Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
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यह काम चेक साइंस फाउंडेशन (18-10035S), राष्ट्रीय स्थिरता कार्यक्रम मैं (LO1419), संस्थागत सहायता (RVO68378050), यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (C$.02.1.01/0.0/0.0/16]013/001775) और अनुदान एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया था चार्ल्स विश्वविद्यालय (GAUK 134516). हम आगे लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, IMG कैस, प्राग, चेक गणराज्य (अनुदान द्वारा समर्थित (चेक-बायोइमेजिंग - LM2015062) स्वीकार करते हैं.

1. माइक्रोइंजेक्शन के लिए srnNAs की तैयारी
<ol><li>पीसीआर द्वारा एक निम्नलिखित पीसीआर सेटअप का उपयोग करके एसआर आरएनए के पूर्ण लंबाई या छोटा/परिवर्तित संस्करण युक्त एक डीएनए टेम्पलेट तैयार करें: 60 एस के लिए 98 डि?...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

हमने परमाणु काजल निकायों में एनआरएनए स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण दृश्यों का निर्धारण करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबल वाले snRNAs का माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग किया। लेबल आरएनए की तेजी से और बल्कि सरल तैयारी ...

आरएनए splicing जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, जो एक बड़े ribonucleoप्रोटीन परिसर द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है spliceosome कहा जाता है. कुल में, 150 से अधिक प्रोटीन और 5 छोटे परमाणु आरएनए (srnAs) splicing मार्ग के विभिन्न चरणों में spliceosome में एकीकृत कर रहे हैं. U1, U2, U4, U5 और U6 snRNAs प्रमुख GU-AG introns के splicing में भाग ले रहे हैं. इन snRNAs पूर्व गठन छोटे परमाणु ribonucleoप्रोटीन कणों (srnPs) कि snRNA होते हैं के रूप में spliceosome में शामिल होने, सात Sm प्रोटीन snRNA के साथ जुड़े (या की तरह एस एम प्रोटीन, जो U6 snRNA के साथ संबद्ध) और 1-12 प्रोटीन प्रत्येक snRNP के लिए विशिष्ट.
snRNPs की विधानसभा कोशिकाद्रव्यी और परमाणु चरणों शामिल है. नव लिखित SnRNA कोशिका द्रव्य जहां यह सात एस एम प्रोटीन से इकट्ठे एक अंगूठी प्राप्त करने के लिए निर्यात किया जाता है। Sm अंगूठी बाद में snRNA फिर से आयात के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करता है नाभिक के लिए वापस. दोषपूर्ण srnAs कि Sm प्रोटीन के साथ संबद्ध करने में विफल कोशिका द्रव्य1में बनाए रखा जाता है. नव आयातित srnPs पहले काजल शरीर में दिखाई देते हैं, जहां वे snRNP विशेष प्रोटीन से मिलने और उनकी परिपक्वता खत्म (संदर्भ में समीक्षाकी 2,3). हमने हाल ही में यह दिखाया है कि अंतिम परिपक्वता के कदमों के अवरोध के परिणामस्वरूप काजल निकायों4,5में अपरिपक्व एसएनआरपी को अलग कर दिया गया है . हम एक मॉडल जहां अंतिम srnP परिपक्वता गुणवत्ता नियंत्रण है कि snRNP विशेष प्रोटीन और सक्रिय srnPs के गठन के अलावा पर नज़र रखता है के तहत है का प्रस्ताव रखा. हालांकि, कैसे कोशिकाओं को सही ढंग से इकट्ठा परिपक्व और aberant अपरिपक्व कणों के बीच भेद के आणविक विवरण मायावी रहते हैं.
परमाणु काजल निकायों में snRNAs के लक्ष्य और संचय के लिए आवश्यक हैं कि snRNA दृश्यों का निर्धारण करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट लेबल srnAs के microinctions को रोजगार का फैसला किया. माइक्रोइंजेक्शन पसंद की एक विधि थी क्योंकि: 1) यह सिंथेटिक srnRNAs उनके अंतर्जात समकक्षों जो विशेष रूप से अतिरिक्त टैग अनुक्रम की प्रविष्टि के लिए कम स्थान के साथ कम RNAs के लिए महत्वपूर्ण है फार्म भेद करने के लिए एक अतिरिक्त अनुक्रम टैग की आवश्यकता नहीं है; 2) यह दृश्यों कि biogenesis के लिए महत्वपूर्ण हैं के विश्लेषण की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, Sm अनुक्रम Sm अंगूठी विधानसभा के लिए आवश्यक है और नाभिक6में फिर से आयात. जब srnAs सेल में व्यक्त कर रहे हैं, srnAs Sm अनुक्रम की कमी कोशिका द्रव्य में निम्नीकृत कर रहे हैं और नाभिक और काजल निकायों7तक नहीं पहुँच. हालांकि, SnRNAs Sm अनुक्रम के बिना सीधे नाभिक में microinsed किया जा सकता है और इस प्रकार काजल शरीर स्थानीयकरण परख में Sm अनुक्रम की एक संभावित भूमिका.
यहाँ, हम विस्तार से एक माइक्रोइंजेक्शन विधि है कि हम काजल शरीर5में snRNAs लक्ष्य के लिए आवश्यक snRNA दृश्यों का निर्धारण करने के लिए आवेदन का वर्णन. हमने दिखाया कि Sm और SMN बाध्यकारी साइटों को एक साथ आवश्यक हैं और न केवल srnAs लेकिन विभिन्न छोटे गैर-कोडिंग आरएनए काजल शरीर में स्थानीयकरण करने के लिए पर्याप्त हैं। माइक्रोइंजेक्शनिंग के साथ-साथ अन्य साक्ष्यके आधार पर, हमने प्रस्ताव किया कि Sm बाइंडिंग साइट पर इकट्ठे हुए Sm अंगूठी काजल शरीर स्थानीयकरण संकेत है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

स्प्लेयोसोमल एसएनआरए का जीवजनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें परमाणु और कोशिकाद्रव्यदोनों दोनों चरण शामिल होते हैं और अंतिम चरण काजल शरीर नामक परमाणु डिब्बे में होता है। हालांकि, इस subnuclear संरचना में प्रत्यक्ष snRNA स्थानीयकरण अनुक्रम हाल तक ज्ञात नहीं किया गया है. काजल निकायों में srnAs के संचय के लिए महत्वपूर्ण दृश्यों का निर्धारण करने के लिए, हम fluorcently लेबल snRNAs के माइक्रोइंजेक्शन कार्यरत कोशिकाओं के अंदर उनके स्थानीयकरण के बाद. सबसे पहले, हम snRNA विलोपन म्यूटेंट तैयार, इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए संश्लेषित डीएनए टेम्पलेट्स और ALEXA488 के साथ युग्मित यूटीपी की उपस्थिति में snRNAs टाइप. लेबलित srnAs के साथ मिश्रित किया गया 70 kDa-Dextran TRITC के साथ संयुग्मी, और नाभिक या मानव Hela कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के लिए microined. कोशिकाओं के लिए incubated थे 1 ज और तय है और काजल शरीर मार्कर coilin अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की गई थी, जबकि srnAs और डेक्सट्रान, जो परमाणु या कोशिका द्रव्य ीय इंजेक्शन के एक मार्कर के रूप में कार्य करता है, सीधे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया गया. इस विधि कैसे विभिन्न दृश्यों कोशिकाओं के अंदर आरएनए स्थानीयकरण को प्रभावित के कुशल और तेजी से परीक्षण के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम काजल शरीर में snRNAs के कुशल स्थानीयकरण के लिए Sm बाध्यकारी अनुक्रम के महत्व को दिखाने के.

SnRNA स्थानीयकरण और काजल शरीर लक्ष्यीकरण में Sm बाध्यकारी साइट की भूमिका की निगरानी करने के लिए, हम एक डीएनए टेम्पलेट T7 प्रमोटर युक्त तैयार किया है और या तो पूर्ण लंबाई U2 snRNA या U2 snRNA सात nucleotides की कमी (AUUUUUG) Sm बाध्यका?...

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Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

स्प्लेयोसोमल एसएनआरए के जीवजनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें विभिन्न सेलुलर डिब्बे शामिल होते हैं। यहाँ, हम सेल के अंदर उनके परिवहन की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट लेबल srnAs के माइक्रोइंजेक्शन कार्यरत हैं।

माइक्रोइंजेक्शनिंग का उपयोग करके मानव हेला कोशिकाओं में स्प्लेकोसोमल स्एनआरएन स्थानीयकरण का विश्लेषण

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

यहां हमने आरएनए दृश्यों का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले आरएनए का माइक्रोइंजेक्शन लागू किया जो छोटे परमाणु आरएनए के स्थानीयकरण के लिए परमाणु संरचनाओं में आवश्यक हैं जिसे कैजल निकाय कहा जाता है । इस तकनीक के दो बड़े फायदे हैं। सबसे पहले, इसे छोटे आरएनए के लिए लागू किया जा सकता है जो अन्यथा लेबल और ट्रैक करना मुश्किल है।और दूसरा, यह विभिन्न दृश्यों की तेजी से स्क्रीनिंग और आरएनए स्थानीयकरण में उनकी भूमिका का परीक्षण करने की अनुमति देता है। माइक्रोइंजेक्शन से एक दिन पहले, बीज हेला या 12 मिलीमीटर कवर्लिप पर अन्य अनुयायी कोशिकाएं माइक्रोइंजेक्शन के समय 50% तक पहुंचने के लिए। शुरू करने के लिए, एक तैयार कवरस्लिप को पेट्री डिश के केंद्र में रखें, कोशिकाओं और दो मिलीमीटर संस्कृति मीडिया जोड़ें।अगले दिन, सेल भरे पेट्री डिश को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें। एक माइक्रोलोडर का उपयोग करके, सुई में snrna मिश्रण के तीन माइक्रोलीटर लोड करें और पेट्री डिश की सतह के संबंध में 45 डिग्री के कोण पर माइक्रोइंजेक्टर के धारक में सुई स्थापित करें। सुई खोजने के लिए 10X लंबी दूरी के उद्देश्य का उपयोग करें।सबसे पहले, इंजेक्टर पर मोटे गति सेट करें और सुई को तब तक कम करें जब तक कि यह संस्कृति माध्यम को न छुए। माइक्रोस्कोप दूरबीन का उपयोग करके, उज्ज्वल स्थान ढूंढें जो वह स्थान है जहां सुई संस्कृति माध्यम को छूती है। गति को ठीक करने के लिए बदलें और सुई की नोक तक माइक्रोस्कोप में देखते हुए सुई को और कम करें।दृश्य क्षेत्र के बीच में सुई ले जाएँ और एक 40X लंबी दूरी के उद्देश्य के लिए स्विच करें। इसके बाद सेल का चयन करें और सुई को सेल से ऊपर ले जाएं। सेल संपर्क के लिए दबाव और समय निर्धारित करें।सुई को सेल में नीचे ले जाएं और फिर माइक्रोमैनीपुलेटर की निचली सीमा तय करें। निचली सीमा निर्धारित करना प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। क्योंकि कवरलिप सतह सही नहीं है और क्योंकि प्रत्येक कोशिका अलग है, आपको इंजेक्शन सत्र के दौरान कई बार निचली सीमा निर्धारित करनी होगी।इसके बाद, सुई को सेल के ऊपर वापस ले जाएं और इंजेक्टर की जॉयस्टिक पर इंजेक्शन बटन दबाएं। सुई स्वचालित रूप से कोशिका के अंदर उस जगह पर ले जाएगी जहां आरएनए मिश्रण को इंजेक्ट करने के लिए सीमा निर्धारित है। खत्म करने के लिए, इंजेक्टर पर मेनू बटन पुश करें और धारक से सुई निकालें।इसके बाद इंजेक्टर और माइक्रोमैनीपुलेटर को स्विच ऑफ करने से पहले इंजेक्टर से ट्यूब डिस्कनेक्ट कर दें। माइक्रोइंजेक्शन के बाद कोशिकाओं को कार्बन डाई ऑक्साइड इनक्यूबेटर में वापस कर दें और एक घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को कुल्ला।पीएच 6.9 पर 0.1 मोलर पाइप में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें। फिर कोशिकाओं को कमरे के तापमान पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। यदि केवल snrna स्थानीयकरण का विश्लेषण किया जाता है, तो संक्षेप में पानी में कोशिकाओं को कुल्ला करें और DAPI के साथ बढ़ते माध्यम में माउंट करें।अतिरिक्त प्रोटीन स्थानीयकरण के मामले में, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के साथ कोशिकाओं को पार करें। कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला करें और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित उपयुक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उन्हें दाग दें। फिर पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला करें और एक बार पानी में कुल्ला करें।इसके बाद, कोशिकाओं को DAPI के साथ बढ़ते माध्यम में माउंट करें। जब छवि के लिए तैयार है, तो छवियों को प्राप्त करने के लिए विसर्जन उद्देश्य से लैस एक उच्च अंत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपिक सिस्टम का उपयोग करें। एक बार माइक्रोइंजेक्टेड कोशिकाओं की पहचान हो जाने के बाद, प्रति सैंपल 200 नैनोमीटर जेड चरणों के साथ 20 जेड वर्गों का ढेर इकट्ठा करें और गणितीय डिकोवोोल्यूशन के अधीन हों।फ्लोरोसेंट सिग्नल की मात्रा निर्धारित करने के लिए, सबसे पहले इमेजजे में माइक्रोस्कोपी इमेज खोलें और चैनलों को खिड़कियों में विभाजित करें। सिंक्रोनाइज विंडो टूल द्वारा खिड़कियों को सिंक्रोनाइज़ करें। इसके बाद, कॉइलिन इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा पहचाने गए एक कैजल शरीर के चारों ओर ब्याज के क्षेत्र को आकर्षित करें।कॉइलिन-परिभाषित आरओआई में snRNA संकेत की तीव्रता को मापें। न्यूक्लियोप्लाज्म में बेतरतीब ढंग से रखे गए आरओआई में snRNA फ्लोरेसेंस की तीव्रता निर्धारित करें। मापा मूल्यों को बचाने और सीजल शरीर और न्यूक्लियोप्लाज्म में आरएनए संकेत के अनुपात की गणना।इस अध्ययन में, फ्लोरोसेंटी लेबल वाले snRNAs को कोशिका के अंदर उनके परिवहन की निगरानी करने के लिए माइक्रोइंजेक्टेड किया जाता है। यह परीक्षण करने के लिए कि क्या एसएम साइट कैजल शरीर संचय के लिए महत्वपूर्ण है, एसएम साइट की कमी वाले snRNA को सीधे नाभिक में माइक्रोइंजेक्टेड किया गया है। साइटोप्लाज्म में इंजेक्शन एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जबकि पूर्ण लंबाई स्नैना को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए माइक्रोइंजेक्टेड किया जाता है।इनक्यूबेशन के बाद माइक्रोइंजेक्टेड सेल्स फिक्स हो जाते हैं और कैजल बॉडी मार्कर कॉइलिन को अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की जाती है। पूरी लंबाई एसएनआरएनए परमाणु और साइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन दोनों के बाद कैजल निकायों में जमा हो गई । इसके विपरीत, एसएम साइट की कमी एसएनआरएनए इस डिब्बे में माइक्रोइंजेक्शन के बाद साइटोप्लाज्म में बनी रही जबकि एसएम साइट के बिना snrna के परमाणु माइक्रोइंजेक्शन से पता चलता है कि एसएम बाध्यकारी अनुक्रम कैजल बॉडी लोकलाइजेशन के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह snRNA नाभिक में रहता है लेकिन काजल निकायों में जमा नहीं होता है ।कभी-कभी केवल एक सेलुलर डिब्बे में माइक्रोइंजेक्शन विफल हो जाता है और धोखा दिया गया डेक्सट्रान 70 किलोडलटन नाभिक और साइटोप्लाज्म दोनों में पाया जा सकता है। इन कोशिकाओं को आगे के विश्लेषण से छोड़ दिया जाता है। इस तथ्य के बावजूद कि फ्लोरोसेंटी लेबल वाले snRNAs इंजेक्शन से पहले नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं, आरएनए क्षरण हो सकता है।साइटोप्लाज्म में इंजेक्ट किए गए अवक्रमित snrna को नाभिक में नहीं ले जाया जाता है और साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत रहता है। इस तरह के snrna को छोड़ दिया जाना चाहिए और नए snrna संश्लेषित किया जाना चाहिए । अपने सेल प्रकार के लिए इंजेक्शन को सही ढंग से समायोजित करना और दबाव की भरपाई करना महत्वपूर्ण है।और जैसा कि पहले कहा गया है, सेल इंजेक्शन के लिए सही कम सीमा निर्धारित करना एक अच्छे माइक्रोइंजेक्शन के लिए आवश्यक है। कृपया याद रखें कि आरएनए आइसोलेशन के दौरान इस्तेमाल किया जाने वाला फिनॉल-क्लोरोफॉर्म खतरनाक है और माइक्रोइंजेक्शन सुई एक तेज वस्तु है। इन सामग्रियों को संभालते समय सावधानी बरतें।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

यूटेरो इलेक्ट्रोपॉनेशन द्वारा फेरेट नियोकॉर्टे में न्यूरल प्रोजेनिटर कोशिकाओं को लक्षित करने में वीवो में

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...