Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Czech Science Foundation (18-10035S), dal National Sustainability Program I (LO1419), dal sostegno istituzionale (RVO68378050), dal Fondo europeo di sviluppo regionale (C..02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) e dall'Agenzia Università Charles (GAUK 134516). Riconosciamo inoltre lo strumento Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Repubblica Ceca (supportato da sovvenzioni (Czech-Bioimaging - LM2015062).

1. Preparazione di snRNA per microiniezione
<ol><li>Preparare un modello di DNA contenente la versione a lunghezza intera o troncata/mutata di snRNA da PCR utilizzando una seguente configurazione PCR: 98 C per 60 s, 98 s per 15 s, 68 gradi C per 30 s, 72 s per 1 min, 98 S per 15 s per 35x e 72 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Il primer in avanti deve contenere una sequenza promotore per la trascrizione in vitro appena a monte del primo nucleotide trascritto. Amplifica la sequenza di snRNA U2 usando il primer in av...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

Abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per determinare sequenze importanti per la localizzazione del snRNA nei corpi nucleari di Cajal. Grazie alla rapida e piuttosto semplice preparazione degli RNA etichettati (preparazione del modello di DNA da PCR seguita dalla trascrizione in vitro) il metodo offre un'analisi efficace di come le varie sequenze contribuiscono alla localizzazione dell'RNA. In tempi relativamente brevi, siamo stati in grado di analizzare dieci diverse eliminazioni o sostituzioni dello...

Lo splicing dell'RNA è uno dei passi cruciali nell'espressione genica, catalizzata da un grande complesso di ribonucleoproteina chiamato slicsome. In totale, più di 150 proteine e 5 piccoli RNA nucleari (snRNA) sono integrati nello spliceosome nelle diverse fasi del percorso di giunzione. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNA stanno partecipando alla giunzione dei principali introni GU-AG. Questi snRNA si uniscono allo spliceo come piccole particelle di ribonucleoproteina nucleare preformate (snRNP) che contengono snRNA, sette proteine Sm associate allo snRNA (o alle proteine Like-Sm, che si associano allo snRNA U6) e 1-12 proteine specifiche per ogni snRNP.
L'assemblaggio di snRNP comporta stadi citoplasmatici e nucleari. Lo snRNA appena trascritto viene esportato nel citoplasma dove acquisisce un anello assemblato da sette proteine Sm. L'anello Sm successivamente funge da segnale per la reimportazione dello snRNA nel nucleo. Gli snRNA difettosi che non riescono ad associarsi alle proteine Sm vengono conservati nel citoplasma1. Gli snRNP appena importati appaiono per la prima volta nel corpo di Cajal dove incontrano proteine specifiche snRNP e terminano la loro maturazione (rivisto nel riferimento2,3). Recentemente abbiamo dimostrato che l'inibizione delle fasi di maturazione finale si traduce nel sequestro di snRNP immaturi nei corpi di Cajal4,5. Abbiamo proposto un modello in cui la maturazione finale dello snRNP è sotto controllo di qualità che monitora l'aggiunta di proteine specifiche snRNP e la formazione di snRNP attivi. Tuttavia, i dettagli molecolari di come le cellule distinguono tra particelle immature mature e aberranti correttamente assemblate rimangono sfuggenti.
Per determinare le sequenze di snRNA che sono essenziali per il targeting e l'accumulo di snRNA nei corpi nucleari di Cajal, abbiamo deciso di impiegare la microiniezione di snRNA fluorescentmente etichettati. La microiniezione è stato un metodo di scelta perché: 1) non richiede un tag di sequenza aggiuntivo per distinguere gli snRNA sintetici che formano le loro controparti endogene, il che è particolarmente importante per gli RNA brevi con poco spazio per l'inserimento di sequenze di tag extra; 2) permette l'analisi di sequenze che sono importanti per la biogenesi. Ad esempio, la sequenza Sm è essenziale per l'assemblaggio dell'anello Sm e reimportata nel nucleo6. Quando i snRNA sono espressi nella cellula, i snRNA privi della sequenza Sm sono degradati nel citoplasma e non raggiungono il nucleo e i corpi Cajal7. Tuttavia, gli snRNA senza la sequenza Sm possono essere microiniettati direttamente nel nucleo e quindi un potenziale ruolo della sequenza Sm nella localizzazione del corpo di Cajal analizzato.
Qui, descriviamo in dettaglio un metodo di microiniezione che abbiamo applicato per determinare le sequenze snRNA necessarie per indirizzare gli snRNA nel corpo di Cajal5. Abbiamo dimostrato che i siti di legame Sm e SMN sono insieme necessari e sufficienti per localizzare non solo snRNA ma vari RNA brevi non codificanti nel corpo di Cajal. Sulla base di microiniezione e di altre prove, abbiamo proposto che l'anello Sm assemblato sul sito di rilegatura Sm è il segnale di localizzazione del corpo Cajal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge fasi nucleari e citoplasmatiche e l'ultimo passo si verifica in un compartimento nucleare chiamato corpo di Cajal. Tuttavia, le sequenze che indirizzano la localizzazione dello snRNA in questa struttura subnucleare non sono note fino a poco tempo fa. Per determinare sequenze importanti per l'accumulo di snRNA nei corpi di Cajal, abbiamo impiegato microiniezione di snRNA fluorescenti etichettati in modo fluorescente seguito dalla loro localizzazione all'interno delle cellule. In primo luogo, abbiamo preparato mutanti di delezione snRNA, sintetizzato modelli di DNA per la trascrizione in vitro e snRNA trascritti in presenza di UTP accoppiati con Alexa488. Gli snRNA etichettati sono stati miscelati con 70 kDa-Dextran coniugati con TRITC, e microiniettati al nucleo o al citoplasma delle cellule umane di HeLa. Le cellule sono state incubate per 1 h e fissa e la bobina del marcatore del corpo di Cajal è stata visualizzata mediante immunoororescenza indiretta, mentre snRNA e dextran, che funge da marcatore di iniezione nucleare o citoplasmica, sono stati osservati direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. Questo metodo consente di testare in modo efficiente e rapido il modo in cui le varie sequenze influenzano la localizzazione dell'RNA all'interno delle cellule. Qui, mostriamo l'importanza della sequenza di legame Sm per una localizzazione efficiente degli snRNA nel corpo di Cajal.

Per monitorare la localizzazione dello snRNA e il ruolo del sito di legame Sm nel targeting del corpo di Cajal, abbiamo preparato un modello di DNA contenente il promotore T7 e il snRNA U2 o U2 a piena lunghezza che mancano i sette nucleotidi (AUUUUUGUG) che formano il sito di legame Sm. gli snRNA sono stati trascritti in vitro, isolati e mescolati con dextran-70kDa accoppiato a TRITC. Abbiamo microiniettato la miscela contenente snRNA trascritto in vitro nel nucleo o il citoplasma delle cellule HeLa.
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge vari compartimenti cellulari. Qui, abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per monitorare il loro trasporto all'interno della cellula.

Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Qui abbiamo applicato la microiniezione di RNA etichettati fluorescentmente per rilevare sequenze di RNA che sono essenziali per la localizzazione di brevi RNA nucleari in strutture nucleari chiamate corpi di Cajal. Questa tecnica ha due vantaggi principali. In primo luogo, può essere applicato per gli RNA brevi che sono altrimenti difficili da etichettare e tracciare.E in secondo luogo, permette uno screening rapido di diverse sequenze e testa il loro ruolo nella localizzazione dell'RNA. Un giorno prima della microiniezione, seminare HeLa o altre cellule aderenti su coverlips da 12 millimetri per raggiungere il 50% di confluenza al momento della microiniezione. Per iniziare, posizionare un coverslip preparato al centro di una piastra di Petri, aggiungere celle e due millimetri di mezzi di coltura.Il giorno seguente, posizionare la piastra di Petri riempita di cella su uno stadio di microscopio. Utilizzando un microloader, caricare tre microlitri della miscela di snRNA nell'ago e installare l'ago nel supporto del microiniettore con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie della piastra di Petri. Usa un obiettivo a lunga distanza 10 volte per trovare l'ago.In primo luogo, impostare la velocità grossolana sull'iniettore e abbassare l'ago fino a tocchi il mezzo di coltura. Usando il binocolo del microscopio, trova il punto luminoso che è il luogo in cui l'ago tocca il mezzo di coltura. Cambiare la velocità per multare e abbassare ulteriormente l'ago mentre si guarda al microscopio fino a quando non si osserva la punta dell'ago.Spostare l'ago al centro del campo visivo e passare a un obiettivo a lunga distanza 40X. Successivamente, selezionare la cella e spostare l'ago sopra la cella. Impostare la pressione e il tempo per il contatto cellulare.Spostare l'ago verso il basso nella cella e quindi impostare il limite inferiore del micromanipolatore. L'impostazione del limite inferiore è la parte più critica del protocollo. Poiché la superficie del coverslip non è perfetta e poiché ogni cella è diversa, dovrai impostare il limite inferiore più volte durante la sessione di iniezione.Quindi, spostare l'ago sopra la cella e premere il pulsante di iniezione sul joystick dell'iniettore. L'ago si muoverà automaticamente all'interno della cella nel punto in cui è impostato il limite per iniettare la miscela di RNA. Per finire, premere il pulsante del menu sull'iniettore e rimuovere l'ago dal supporto.Quindi scollegare il tubo dall'iniettore prima di spegnere l'iniettore e il micromanipolatore. Dopo la microiniezione, riportare le cellule in un incubatore di anidride carbonica e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, sciacquare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente.Fissare le celle per 20 minuti con paraformaldeide al 4% in 0,1 tubi molari a pH 6,9. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS a temperatura ambiente. Se viene analizzata solo la localizzazione dello snRNA, sciacquare brevemente le cellule in acqua e montarlo in un mezzo di montaggio con DAPI.In caso di localizzazione proteica aggiuntiva, permeabilizzare le cellule con 0,5%Triton X-100 in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Risciacquare le cellule tre volte con PBS e macchiarle con gli anticorpi primari e secondari appropriati come delineato nel protocollo di testo. Quindi risciacquare tre volte con PBS e risciacquare una volta in acqua.Successivamente, montare le celle in un supporto di montaggio con DAPI. Quando sei pronto per l'immagine, utilizza un sistema microscopico a fluorescenza di fascia alta dotato di un obiettivo di immersione per acquisire le immagini. Una volta identificate le cellule microiniettate, raccogliere una pila di sezioni 20 Z con passaggi Z di 200 nanometri per campione e soggette a deconvoluzione matematica.Per quantificare il segnale fluorescente, aprire prima l'immagine della microscopia in ImageJ e dividere i canali in finestre. Sincronizzare le finestre con lo strumento sincronizza finestra. Successivamente, disegna la regione di interesse attorno a un corpo di Cajal identificato dall'immunosocienza della coilina.Misurare l'intensità del segnale snRNA nel ROI definito dalla coilina. Determinare l'intensità della fluorescenza dello snRNA nel ROI posta casualmente nel nucleoplasma. Salvare i valori misurati e calcolare il rapporto tra il segnale di RNA nel corpo di Cajal e il nucleoplasma.In questo studio, gli snRNA etichettati fluorescentmente vengono microiniettati per monitorarne il trasporto all'interno della cellula. Per verificare se il sito SM è importante per l'accumulo del corpo di Cajal, lo snRNA privo del sito SM viene microiniettato direttamente nel nucleo. L'iniezione nel citoplasma funge da controllo mentre lo snRNA a tutta lunghezza viene microiniettato per servire come controllo positivo.Dopo l'incubazione, le cellule microiniettate vengono fissate e la coilina del marcatore corporeo cajal viene visualizzato dall'immunofluorescenza indiretta. Lo snRNA a tutta lunghezza si è accumulato nei corpi di Cajal dopo iniezioni nucleari e citoplasmatici. Al contrario, lo snRNA privo del sito SM è rimasto nel citoplasma dopo la microiniezione in questo compartimento mentre la microiniezione nucleare di snRNA senza il sito SM rivela che la sequenza di legame SM è importante per la localizzazione del corpo di Cajal in quanto questo snRNA rimane nel nucleo ma non si accumula nei corpi di Cajal.A volte la microiniezione in un solo compartimento cellulare fallisce e il Dextran 70 kilodalton ingannato può essere trovato sia nel nucleo che nel citoplasma. Queste cellule vengono scartate da ulteriori analisi. Nonostante il fatto che gli snRNA etichettati fluorescentmente siano conservati a -80 gradi Celsius prima dell'iniezione, può verificarsi la degradazione dell'RNA.Lo snRNA degradato iniettato nel citoplasma non viene trasportato nel nucleo e rimane localizzato nel citoplasma. Tale snRNA deve essere scartato e il nuovo snRNA deve essere sintetizzato. È importante regolare correttamente le pressioni di iniezione e compensazione per il tipo di cella.E come detto prima, impostare il limite inferiore corretto per l'iniezione cellulare è essenziale per una buona microiniezione. Si prega di ricordare che il fenolo-cloroformio utilizzato durante l'isolamento dell'RNA è pericoloso e che l'ago di microiniezione è un oggetto appuntito. Fare attenzione quando si maneggiano questi materiali.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Ricerca

Neuroscienze

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Le misurazioni elettrofisiologiche e Analisi di nocicezione nei neonati umani

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...