Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
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この研究は、チェコ科学財団(18-10035S)、国家サステナビリティプログラムI(LO1419)、制度支援(RVO68378050)、欧州地域開発基金(CZ.02.1.01/0.0.0.0.0/0.0/16_013/0001775)、および助成金によって支援されました。チャールズ大学 (GAUK 134516).我々はさらに、光顕微鏡コア施設、IMG CAS、プラハ、チェコ共和国(助成金によってサポートされている-チェコバイオイメージング - LM2015062)を認めます。

1. マイクロインジェクション用snRNAの調製
<ol><li>次の PCR セットアップを使用して PCR による snRNA の全長または切り捨て/変異バージョンを含む DNA テンプレートを準備する: 60 s の場合は 98 °C、15 s の場合は 98 °C、30 s は 68 °C、1 分間は 72 °C、98 °C は 1 分間、98 °C は 35 倍の場合、および5分間72 °C。</li>
	<li>前方プライマーは、最初に転写されたヌクレオチドのちょうど上流のインビトロ転?...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを用い、核カジャール体へのsnRNA局在化に重要な配列を決定した。標識されたRNAの迅速かつかなり単純な調製(PCRによるDNAテンプレートの調製、インビトロ転写)により、この方法は、様々な配列がRNA局在化にどのように寄与するかの効果的な分析を提供します。比較的短時間で、U2 snRNAの10種類の欠損または置換を分析することができました(参?...

RNAスプライシングは、遺伝子発現における重要なステップの1つであり、スプライセオソームと呼ばれる大きなリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。合計で、150以上のタンパク質と5つの小さな核RNA(snRNA)がスプライシング経路の異なる段階でスプライセオソームに統合されています。U1、U2、U4、U5、U6 snRNAは、主要なGU-AGイントロンのスプライシングに参加しています。これらのsnRNAは、snRNAを含む予め形成された小さな核リボヌクレオタンパク質粒子(snRNA)としてスプリセオソームに結合し、snRNAに関連する7つのSmタンパク質(またはU6 snRNAに関連するライクSmタンパク質)および各snRNPに特異的な1-12タンパク質を含む。
snNRPsの組み立てには、細胞質および核段階が含まれる。新たに転写されたsnRNAは細胞質にエクスポートされ、7つのSmタンパク質から組み立てられたリングを獲得する。Smリングは、その後、snRNAを核に再インポートするためのシグナルとして機能します。Smタンパク質と関連付けることができない欠陥のあるsnRNAは、細胞質1に保持される。新しくインポートされたsnRAPは、まずSnRNP特異的タンパク質を満たし、その成熟を終えるCajal体内に現れ(参照2、3で確認)。我々は最近、最終的な成熟ステップの阻害がCajal体内の未熟なsnNRRpの隔離をもたらすことを示した4,5.我々は、snRNP特異的タンパク質の添加と活性snRNPの形成を監視する品質管理下にある最終snRNP成熟モデルを提案した。しかし、細胞が正しく組み立てられた成熟粒子と異常な未熟粒子を区別する方法の分子詳細は、依然として不明瞭なままである。
核カジャール体内のsnRNAの標的化と蓄積に不可欠なsnRNA配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用することにしました。マイクロインジェクションは、1)合成snRNAを区別するために追加のシーケンスタグを必要としないため、余分なタグ配列を挿入するためのスペースが少ない短いRNAにとって特に重要です。2)それは生体発生のために重要な配列の分析を可能にする。たとえば、Sm シーケンスは Sm リング アセンブリに不可欠であり、核6に再インポートします。snRNAが細胞内で発現されると、Sm配列を欠くsnRNAは細胞質中で分解され、核およびCajal体7に到達しない。しかしながら、Sm配列を持たないSnRNAは、核に直接マイクロ注入することができ、したがって、Cajal体局在化におけるSm配列の潜在的な役割をアッセイする。
ここでは、Cajal本体5にsnRNAを標的にするために必要なsnRNA配列を決定するために適用したマイクロインジェクション法について詳しく説明する。我々は、SmおよびSMN結合部位が一緒に必要であり、SnRNAだけでなく、Cajal本体に様々な短い非コーディングRNAをローカライズするのに十分であることを示した。マイクロインジェクションおよび他の証拠に基づいて、Sm結合部位に組み立てられたSMリングがCajal本体ローカリゼーション信号であることを提案した。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、核相と細胞質相の両方を含む複雑なプロセスであり、最後のステップはCajal体と呼ばれる核コンパートメントで起こる。しかし、この亜核構造にsnRNA局在化を指示する配列は、最近まで知られていなかった。カジャール体内のsnRNAの蓄積に重要な配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用し、その後細胞内での局在化を行った。まず、SnRNA欠失変異体、インビトロ転写用の合成DNAテンプレート、およびAlexa488と組み合わせたUTPの存在下で転写されたsnRNAを調製した。標識されたsnRNAをTRITCと共役した70kDa-Dextranと混合し、ヒトHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。細胞を1時間固定して固定し、カジャルボディマーカーコイルリンを間接免疫蛍光で可視化し、核または細胞質注射のマーカーとなるsnRNAとデキストランを蛍光顕微鏡で直接観察した。この方法は、様々な配列が細胞内のRNA局在化にどのように影響するかを効率的かつ迅速にテストすることを可能にします。ここでは、Cajal体内へのSnRNAの効率的なローカリゼーションのためのSm結合配列の重要性を示す。

SnRNA局在化とカジャール体内標的におけるSm結合部位の役割を監視するために、T7プロモーターと全長U2 snRNAまたはU2 snRNAを含むDNAテンプレートを調製し、Sm結合部位を形成する7つのヌクレオチド(AUUUUUG)を欠いている。snRNAは、TRITC結合デキストラン-70kDaとインビトロ転写し、単離され、混合された。インビトロ転写snRNAを含む混合物をHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。
<p class="jo...

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Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、様々な細胞コンパートメントを含む複雑なプロセスである。ここでは、細胞内での輸送を監視するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用しました。

マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

ここでは、蛍光標識RNAのマイクロインジェクションを適用して、カハル体と呼ばれる核構造への短核RNAの局在化に不可欠なRNA配列を検出しました。この手法には、2 つの大きな利点があります。まず、ラベルや追跡が難しい短いRNAに適用できます。第二に、異なる配列の迅速なスクリーニングを可能にし、RNAの局在におけるそれらの役割をテストする。マイクロインジェクションの1日前に、12ミリメートルのカバーリップ上のHeLaまたは他の付着細胞を播種し、マイクロインジェクション時に50%の合流度に達する。まず、準備したカバースリップをペトリ皿の中央に入れ、細胞と2ミリメートルの培養培地を加えます。翌日、細胞充填されたペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。マイクロローダーを使用して、snRNA混合物の3マイクロリットルを針にロードし、ペトリ皿の表面に対して45度の角度でマイクロインジェクターのホルダーに針を取り付けます。針を見つけるために10倍の長距離目的を使用してください。まず、注射器に粗い速度を設定し、それが培養培地に触れるまで針を下げる。顕微鏡双眼鏡を使用して、針が培養培地に触れる場所である明るいスポットを見つける。針の先端が観察されるまで、顕微鏡を見ながら速度を細かくし、さらに針を下げます。視野の中央に針を移動し、40倍の長距離目標に切り替えます。その後、セルを選択し、針をセルの上に移動します。セル接触の圧力と時間を設定します。針を細胞の中に下に移動し、マイクロマニピュレーターの下限を設定します。プロトコルの最も重要な部分は、下限を設定します。カバースリップサーフェスは完璧ではなく、各セルが異なるため、注入セッション中に何度か下限を設定する必要があります。次に、針をセルの上に戻し、インジェクタのジョイスティックの注射ボタンを押します。針は、RNA混合物を注入するために限界が設定されている場所に細胞の中で自動的に移動します。完了するには、インジェクタのメニューボタンを押し、ホルダーから針を取り外します。次に、インジェクタとマイクロマニピュレーターの電源を切る前に、チューブをインジェクタから取り外します。マイクロインジェクション後、細胞を二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、室温でPBSで細胞を3回リンスする。pH 6.9で0.1モルパイプに4%パラホルムアルデヒドで20分間細胞を固定します。その後、室温PBSで細胞を3回洗浄します。snRNAの局在のみを分析する場合は、水中の細胞を短時間リンスし、DAPIを使用して取り付け媒体に取り付けます。タンパク質の局在化を追加する場合は、PBSで0.5%トリトンX-100で細胞を室温で5分間透過させます。細胞をPBSで3回リンスし、テキストプロトコルで概説されているように適切な一次および二次抗体でそれらを染色します。その後、PBSで3回すすいで、水に1回リンスします。その後、DAPIを使用して、セルを取り付け媒体に取り付けます。画像を撮影する準備ができたら、浸漬目的を備えたハイエンド蛍光顕微鏡システムを使用して画像を取得します。マイクロインジェクションされた細胞が同定されたら、サンプル当たり200ナノメートルZステップで20Zセクションのスタックを収集し、数学的なデコンボリューションを受けます。蛍光信号を定量化するには、まず ImageJ で顕微鏡画像を開き、チャンネルをウィンドウに分割します。同期ウィンドウ ツールでウィンドウを同期します。次に、コイリン免疫染色によって同定されたカハル体の周囲に関心領域を描く。コイリン定義ROIにおけるsnRNAシグナルの強度を測定します。核内に無作為に配置されたROI中のsnRNA蛍光の強度を決定する。測定値を保存し、カハル体と核内のRNAシグナルの比率を計算します。本研究では、蛍光標識されたsnRNAをマイクロインジェクションして細胞内の輸送を監視する。SM部位がカハル体蓄積にとって重要であるかどうかを検査するために、SM部位を欠いているsnRNAは核に直接マイクロインジェクションされる。細胞質への注入はコントロールとして機能し、一方で全長snRNAは、陽性対照として機能するようにマイクロインジェクションされる。インキュベーション後、マイクロインジェクションされた細胞は固定され、カハル体マーカーコイリンは間接的な免疫蛍光によって可視化される。全長snRNAは、核および細胞質注射の両方後にカハル体に蓄積された。対照的に、SM部位を欠いたsnRNAは、このコンパートメントへのマイクロインジェクション後に細胞質に残り、SM部位を除くsnRNAは、このsnRNAが核内に残っているがカジャール体に蓄積しないため、SM結合配列がカジャール体の局在化にとって重要であることを明らかにした。時には、1つの細胞コンパートメントへのマイクロインジェクションだけが失敗し、Dextran 70キロダルトンは核と細胞質の両方で見つけることができます。これらのセルは、さらなる分析から廃棄されます。蛍光標識されたsnRNAは、注射前に80°Cの負の80度で保存されているにもかかわらず、RNAの分解が起こり得る。細胞質に注入された分解されたsnRNAは核に輸送されず、細胞質に局在し続ける。そのようなsnRNAは廃棄されるべきであり、新しいsnRNAは合成されるべきである。細胞タイプの注入と補償圧力を正しく調整することが重要です。そして、前に述べたように、細胞注入のための正しい下限を設定することは、良好なマイクロインジェクションに不可欠です。RNAの単離中に使用されるフェノールクロロホルムは危険であり、マイクロインジェクションニードルは鋭利な物体であることを覚えておいてください。これらの材料を取り扱う際は注意してください。

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