Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Czech Science Foundation (18-10035S), o programa nacional de sustentabilidade I (LO1419), apoio institucional (RVO68378050), o Fundo Europeu de desenvolvimento regional (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) e a agência de subvenção da Universidade de Charles (GAUK 134516). Nós reconhecemos mais a facilidade do núcleo da microscopia de luz, IMG CAS, Praga, República Checa (apoiado por concessões (Czech-BioImaging-LM2015062).

1. preparação de snRNAs para microinjection
<ol><li>Prepare um molde do ADN que contem a versão full-length ou truncada/Mutated de snRNA pelo PCR usando uma seguinte configuração do PCR: 98 ° c para 60 s, 98 ° c para 15 s, 68 ° c para 30 s, 72 ° c para 1 minuto, 98 ° c para 15 s para 35x e 72 ° c por 5 min.</li>
	<li>O primer dianteiro deve conter uma sequência de promotor para a transcrição in vitro apenas a montante do primeiro nucleotídeo transcrito. Amplify a seqüência de snRNA U2 usando o primer d...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

Nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado para determinar as seqüências importantes para a localização de snRNA em corpos nucleares de Cajal. Devido à preparação rápida e rather simples de RNAs etiquetado (preparação do molde do ADN pelo PCR seguido pela transcrição in vitro) o método oferece a análise eficaz de como as várias seqüências contribuem à localização do RNA. Em tempo relativamente curto, pudemos analisar dez diferentes exclusões ou substituições do snRNA U2 (referênci...

A emenda do RNA é uma das etapas cruciais na expressão de Gene, que é catalisada por um grande complexo do ribonucleoprotein chamado o spliceosome. No total, mais de 150 proteínas e 5 RNAs nucleares pequenas (snrnas) são integrados no spliceossoma em estágios diferentes da via de emenda. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNAs estão participando na emenda dos principais introns GU-AG. Estes snrnas juntam-se ao spliceossoma como partículas nucleares pequenas pré-formadas do ribonucleoprotein (snRNPs) que contêm snRNA, sete proteínas do SM associadas com o snRNA (ou proteínas de like-SM, que associam com o snRNA U6) e 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.
A montagem de snRNPs envolve estágios citoplasmáticos e nucleares. O snRNA recentemente transcrito é exportado para o citoplasma onde adquire um anel montado a partir de sete proteínas SM. O anel SM, subsequentemente, serve como um sinal para snRNA re-importação de volta para o núcleo. SnRNAs defeituosos que não conseguem associar com proteínas SM são retidos no citoplasma1. Os snRNPs recém-importados aparecem pela primeira vez no corpo de Cajal, onde eles atendem às proteínas específicas de snRNP e terminam sua maturação (revisada na referência2,3). Nós mostramos recentemente que a inibição de etapas finais da maturação conduz ao sequestro de snRNPs imaturos em corpos de Cajal4,5. Nós propusemos um modelo onde a maturação final de snRNP esteja o controle de qualidade que monitora a adição de proteínas snRNP-específicas e a formação de snRNPs ativo. Entretanto, os detalhes moleculars de como as pilhas distinguem entre as partículas imaturas maduras e aberrantes corretamente montadas permanecem indescritível.
Para determinar as sequências de snRNA que são essenciais para o direcionamento e acúmulo de snrnas em corpos nucleares de Cajal, decidimos empregar microinjeção de snrnas rotulados com cDNAs. A microinjeção foi um método de escolha porque: 1) não requer uma tag de seqüência adicional para distinguir snRNAs sintéticos formam suas contrapartes endógenas que é especialmente importante para RNAs curtas com pouco espaço para inserção de seqüência de Tags extra; 2) permite a análise de sequências que são importantes para a biogênese. Por exemplo, a sequência SM é essencial para o conjunto do anel SM e re-importar para o núcleo6. Quando snRNAs são expressos na célula, snRNAs faltando a seqüência SM são degradadas no citoplasma e não atingem o núcleo e corpos Cajal7. Entretanto, snrnas sem a seqüência do SM pode diretamente ser injetado no núcleo e assim um papel potencial da seqüência do SM na localização do corpo de Cajal assayed.
Aqui, nós descrevemos em detalhe um método do microinjection que nós aplicamos para determinar as seqüências de snRNA necessárias para alvejar snRNAs no corpo5de Cajal. Nós mostramos que os locais obrigatórios do SM e do SMN são junto necessário e suficiente localizar não somente snRNAs mas vários RNAs não-codificando curtos no corpo de Cajal. Com base na microinjeção, bem como outras evidências, propusemos que o anel SM montado no local de ligação SM é o sinal de localização do corpo Cajal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo ambas as fases nuclear e citoplasmática e o último passo ocorre em um compartimento nuclear chamado corpo de Cajal. No entanto, as sequências que direcionam a localização de snRNA para esta estrutura subnuclear não foram conhecidas até recentemente. Para determinar seqüências importantes para a acumulação de snrnas em corpos de Cajal, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado seguido por sua localização dentro das pilhas. Primeiramente, nós preparamos mutantes do apagamento de snRNA, moldes sintetizados do ADN para in vitro a transcrição e transcrito snRNAs na presença de UTP acoplado com Alexa488. Os snRNAs rotulados foram misturados com 70 kDa-Dextran conjugados com TRITC, e microinjetado no núcleo ou no citoplasma de células HeLa humanas. As células foram incubadas por 1 h e fixadas e a coilina do marcador do corpo de Cajal foi visualizada por imunofluorescência indireta, enquanto snRNAs e Dextran, que serve como marcador de injeção nuclear ou citoplasmática, foram observados diretamente com um microscópio de fluorescência. Este método permite o teste eficiente e rápido de como as várias seqüências influenciam a localização do RNA dentro das pilhas. Aqui, mostramos a importância da sequência de ligação SM para uma localização eficiente de snRNAs no corpo de Cajal.

Para monitorar a localização de snRNA e o papel do local obrigatório do SM na segmentação do corpo de Cajal, nós preparamos um molde do ADN que contem o promotor T7 e o snRNA U2 completo ou o snRNA U2 que faltam os sete nucleotídeos (auuuuug) que formam o local obrigatório do SM. os snRNAs foram transcritos in vitro, isolados e misturados com Dextran-70kDa acoplado ao TRITC. Nós injetado a mistura que contem in vitro o snRNA transcrito no núcleo ou no citoplasma de pilhas de Hela.
Fo...

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Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

A biogênese de snRNAs spliceosomal é um processo complexo envolvendo vários compartimentos celulares. Aqui, nós empregamos o microinjection de snrnas cDNAs etiquetado a fim monitorar seu transporte dentro da pilha.

Análise da localização de snRNA Spliceosomal em células HeLa humanas usando microinjeção

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Aqui aplicamos microinjeção de RNAs fluorescentes para detectar sequências de RNA que são essenciais para a localização de RNAs nucleares curtas em estruturas nucleares chamadas corpos de Cajal. Esta técnica tem duas grandes vantagens. Primeiro, pode ser aplicado para RNAs curtas que são de outra forma difíceis de rotular e rastrear.E segundo, permite a triagem rápida de diferentes sequências e testes de seu papel na localização do RNA. Um dia antes da microinjeção, a semente HeLa ou outras células aderentes em coberturas de 12 milímetros para atingir 50% de confluência no momento da microinjeção. Para começar, coloque um coverlip preparado no centro de uma placa de Petri, adicione células e dois milímetros de mídia cultural.No dia seguinte, coloque a placa de Petri preenchida em um palco de microscópio. Usando um microcarregador, carregue três microlitadores da mistura de snRNA na agulha e instale a agulha no suporte do microinjetor em um ângulo de 45 graus em relação à superfície da placa de Petri. Use um objetivo de longa distância de 10X para encontrar a agulha.Primeiro, coloque a velocidade grosseira no injetor e baixe a agulha até que toque o meio de cultura. Usando os binóculos do microscópio, encontre o ponto brilhante que é o lugar onde a agulha toca o meio da cultura. Mude a velocidade para multar e baixar ainda mais a agulha enquanto olha para o microscópio até que a ponta da agulha seja observada.Mova a agulha no meio do campo visual e mude para um objetivo de longa distância de 40X. Depois disso, selecione a célula e mova a agulha acima da célula. Defina a pressão e o tempo para o contato celular.Mova a agulha para baixo na célula e, em seguida, definir o limite inferior do micromanipulador. Definir o limite inferior é a parte mais crítica do protocolo. Como a superfície do deslizamento não é perfeita e como cada célula é diferente, você terá que definir o limite inferior várias vezes durante a sessão de injeção.Em seguida, mova a agulha para trás acima da célula e pressione o botão de injeção no joystick do injetor. A agulha se moverá automaticamente dentro da célula para o local onde o limite é definido para injetar a mistura de RNA. Para finalizar, pressione o botão do menu no injetor e remova a agulha do suporte.Em seguida, desconecte o tubo do injetor antes de desligar o injetor e o micromanípulo. Após a microinjeção, devolva as células a uma incubadora de dióxido de carbono e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, enxágue as células três vezes com PBS à temperatura ambiente.Fixar as células por 20 minutos com 4% de paraformaldeído em tubos molares de 0,1 em pH 6.9. Em seguida, lave as células três vezes com PBS de temperatura ambiente. Se apenas a localização do snRNA for analisada, enxágue brevemente as células na água e monte em um meio de montagem com DAPI.Em caso de localização adicional da proteína, permeabilize as células com 0,5% Triton X-100 em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Enxágüe as células três vezes com PBS e manche-as com os anticorpos primários e secundários apropriados, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, enxágue três vezes com PBS e enxágue uma vez na água.Depois disso, monte as células em um meio de montagem com DAPI. Quando estiver pronto para a imagem, use um sistema microscópico de fluorescência high-end equipado com um objetivo de imersão para adquirir as imagens. Uma vez identificadas as células microinjetadas, colete uma pilha de seções de 20 Z com 200 passos de nanômetros Z por amostra e sujeito a desconvolução matemática.Para quantificar o sinal fluorescente, primeiro abra a imagem de microscopia no ImageJ e divida os canais em janelas. Sincronizar janelas pela ferramenta de janela sincronizar. Em seguida, desenhe a região de interesse em torno de um corpo de Cajal identificado por imunossuagem de coilina.Meça a intensidade do sinal de snRNA no ROI definido pela coilina. Determine a intensidade da fluorescência de snRNA no ROI colocada aleatoriamente no nucleoplasma. Economize valores medidos e calcule a razão de sinal de RNA no corpo de Cajal e nucleoplasma.Neste estudo, snRNAs fluorescentes são microinjetadas para monitorar seu transporte dentro da célula. Para testar se o local do SM é importante para o acúmulo de corpo de Cajal, o snRNA que não tem o local de SM é microinjetado diretamente no núcleo. A injeção no citoplasma serve como controle enquanto o snRNA de comprimento total é microinjetado para servir como um controle positivo.Após a incubação, as células microinjetadas são fixadas e a coilina do marcador corporal de Cajal é visualizada por imunofluorescência indireta. O snRNA de comprimento completo acumulado em corpos de Cajal após injeções nucleares e citoplasmáticas. Em contraste, o snRNA sem o local de SM permaneceu no citoplasma após a microinjeção neste compartimento, enquanto a microinjeção nuclear de snRNA sem o local SM revela que a sequência de ligação SM é importante para a localização do corpo de Cajal, pois este snRNA permanece no núcleo, mas não se acumula em corpos de Cajal.Às vezes, a microinjeção em apenas um compartimento celular falha e o Dextran 70 kilodalton pode ser encontrado tanto no núcleo quanto no citoplasma. Essas células são descartadas de análises posteriores. Apesar do fato de que os snRNAs fluorescentes rotulados são armazenados a 80 graus Celsius negativos antes da injeção, a degradação do RNA pode ocorrer.O snRNA degradado injetado no citoplasma não é transportado para o núcleo e permanece localizado no citoplasma. Tal snRNA deve ser descartado e novo snRNA deve ser sintetizado. É importante ajustar corretamente a injeção e compensar as pressões para o tipo de célula.E como dito antes, definir o limite inferior correto para injeção celular é essencial para uma boa microinjeção. Lembre-se que o fenol-clorofórmio usado durante o isolamento do RNA é perigoso e que a agulha de microinjeção é um objeto afiado. Tenha cuidado ao manusear esses materiais.

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