Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Checa de la Ciencia (18-10035S), el Programa Nacional de Sostenibilidad I (LO1419), el apoyo institucional (RVO68378050), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) y la Agencia de Subvenciones de Universidad Charles (GAUK 134516). Además, reconocemos el Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (apoyado por subvenciones (Checo-Bioimagen - LM2015062).

1. Preparación de snRNAs para microinyección
<ol><li>Preparar una plantilla de ADN que contenga la versión de longitud completa o truncada/mutada de snRNA por PCR utilizando una siguiente configuración de PCR: 98 oC para 60 s, 98 oC para 15 s, 68 oC para 30 s, 72 oC para 1 min, 98 oC para 15 s para 35x , y 72 oC durante 5 min.</li>
	<li>La imprimación delantera debe contener una secuencia promotora de la transcripción in vitro justo aguas arriba del primer nucleótido transcrito. Amplifique la secuencia de ARN U2...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

Empleamos microinyección de NMNM con etiqueta fluorescente para determinar secuencias importantes para la localización de ARNEnS en cuerpos nucleares de Cajal. Debido a la preparación rápida y bastante simple de ARN etiquetados (preparación de la plantilla de ADN por PCR seguida de transcripción in vitro), el método ofrece un análisis eficaz de cómo varias secuencias contribuyen a la localización del ARN. En relativamente poco tiempo, pudimos analizar diez eliminaciones o sustituciones diferentes del ARNU U2 (r...

El empalme de ARN es uno de los pasos cruciales en la expresión génica, que es catalizado por un gran complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma. En total, más de 150 proteínas y 5 pequeños ARN nucleares (snRNA) se integran en el espliceosoma en diferentes etapas de la vía de empalme. Los nmarendes U1, U2, U4, U5 y U6 participan en el empalme de los principales intrones GU-AG. Estos snRNAs se unen al spliceosoma como pequeñas partículas de ribonucleoproteína sinformato preformados (snRNPs) que contienen snRNA, siete proteínas Sm asociadas con el ARNs (o proteínas Like-Sm, que se asocian con el ARNS U6) y 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.
El montaje de los snRNPs implica etapas citoplasmáticas y nucleares. El ARNN recién transcrito se exporta al citoplasma donde adquiere un anillo ensamblado a partir de siete proteínas Sm. El anillo Sm sirve posteriormente como señal para el ARN SnRNA re-importación de nuevo al núcleo. Los snRNA defectuosos que no se asocian con las proteínas Sm se retienen en el citoplasma1. Los snRNP recién importados aparecen por primera vez en el cuerpo de Cajal, dondese encuentran con proteínas específicas de snRNP y terminan su maduración (revisada en la referencia 2,3). Recientemente mostramos que la inhibición de los pasos finales de maduración resulta en el secuestro de snRNPs inmaduros en cuerpos Cajal4,5. Propusimos un modelo donde la maduración final de snRNP está bajo control de calidad que monitorea la adición de proteínas específicas de snRNP y la formación de snRNPs activos. Sin embargo, los detalles moleculares de cómo las células distinguen entre partículas maduras correctamente ensambladas y aberrantes inmaduras siguen siendo esquivas.
Para determinar las secuencias de ARNQue que son esenciales para la focalización y acumulación de ARNA en cuerpos nucleares de Cajal, decidimos emplear microinyección de snRNA etiquetados fluorescentemente. La microinyección fue un método de elección porque: 1) no requiere una etiqueta de secuencia adicional para distinguir los snRNA sintéticos forman sus homólogos endógenos, lo que es especialmente importante para ARN cortos con poco espacio para la inserción de secuencia de etiquetas adicionales; 2) permite el análisis de secuencias que son importantes para la biogénesis. Por ejemplo, la secuencia Sm es esencial para el montajedel anillo Sm y reimportar en el núcleo 6. Cuando los snRNA se expresan en la célula, los NMNAr que carecen de la secuencia de Sm se degradan en el citoplasma y no alcanzan el núcleo y los cuerpos de Cajal7. Sin embargo, los snRNA sin la secuencia Sm se pueden microinyectar directamente en el núcleo y, por lo tanto, se puede ensayar un papel potencial de la secuencia Sm en la localización del cuerpo de Cajal.
Aquí, describimos en detalle un método de microinyección que aplicamos para determinar las secuencias de ARNS necesarios para apuntar a los NMNm en el cuerpo de Cajal5. Mostramos que los sitios de unión Sm y SMN son juntos necesarios y suficientes para localizar no sólo los ARN de snRNA, sino varios ARN cortos no codificantes en el cuerpo de Cajal. Basándonos en la microinyección, así como en otras pruebas, propusimos que el anillo Sm ensamblado en el sitio de unión Sm sea la señal de localización del cuerpo Cajal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que implica fases nucleares y citoplasmáticas y el último paso se produce en un compartimiento nuclear llamado cuerpo Cajal. Sin embargo, las secuencias que dirigen la localización de ARN SnRNA en esta estructura subnuclear no se han conocido hasta hace poco. Para determinar secuencias importantes para la acumulación de SnRNAs en cuerpos de Cajal, empleamos microinyección de snRNAs etiquetados fluorescentemente seguido de su localización dentro de las células. Primero, preparamos mutantes de eliminación de SnRNA, sintetizamos plantillas de ADN para transcripción in vitro y snRNAs transcritos en presencia de UTP junto con Alexa488. Los snRNA etiquetados se mezclaron con 70 kDa-Dextran conjugados con TRITC, y microinyectados al núcleo o al citoplasma de células HeLa humanas. Las células fueron incubadas durante 1 h y fijas y la bobina marcadora del cuerpo Cajal fue visualizada por inmunofluorescencia indirecta, mientras que los snRNA y el dextran, que sirve como marcador de inyección nuclear o citoplasmamática, se observaron directamente utilizando un microscopio de fluorescencia. Este método permite realizar pruebas eficientes y rápidas de cómo varias secuencias influyen en la localización del ARN dentro de las células. Aquí, mostramos la importancia de la secuencia de encuadernación Sm para la localización eficiente de los snRNAs en el cuerpo de Cajal.

Para monitorear la localización de SnRNA y el papel del sitio de unión SM en la segmentación del cuerpo de Cajal, preparamos una plantilla de ADN que contiene el promotor T7 y el snRNA U2 de longitud completa o el snRNA U2 que carece de los siete nucleótidos (AUUUUUU) que forman el sitio de unión SM. los snRN fueron transcritos in vitro, aislados y mezclados con dextran-70kDa acoplado a TRITC. Hemos microinyectado la mezcla que contiene ARNn transcrito in vitro en el núcleo o el citoplasma de las células de HeLa.<...

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Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que involucra varios compartimentos celulares. Aquí, empleamos microinyección de nmRNA etiquetados fluorescentemente con el fin de monitorear su transporte dentro de la célula.

Análisis de la localización de ARNS spliceosomal en células hela humanas con microinyección

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Aquí aplicamos microinyección de ARN con etiqueta fluorescente para detectar secuencias de ARN que son esenciales para la localización de ARN nucleares cortos en estructuras nucleares llamadas cuerpos Cajales. Esta técnica tiene dos grandes ventajas. En primer lugar, se puede aplicar para ARN cortos que son difíciles de etiquetar y realizar un seguimiento.Y en segundo lugar, permite la rápida selección de diferentes secuencias y probar su papel en la localización de ARN. Un día antes de la microinyección, heLa de semilla u otras células adherentes en cubreobjetos de 12 milímetros para alcanzar el 50% de confluencia en el momento de la microinyección. Para empezar, coloque un cubreobjetos preparado en el centro de un plato de Petri, agregue celdas y dos milímetros de medios de cultivo.Al día siguiente, coloque la célula llena de petri en una etapa del microscopio. Con un microcargador, cargue tres microlitros de la mezcla de arneses en la aguja e instale la aguja en el soporte del microinyector en un ángulo de 45 grados con respecto a la superficie de la placa Petri. Utilice un objetivo de larga distancia 10X para encontrar la aguja.En primer lugar, ajuste la velocidad gruesa en el inyector y baje la aguja hasta que toque el medio de cultivo. Usando los prismáticos del microscopio, encuentre el punto brillante que es el lugar donde la aguja toca el medio de cultivo. Cambie la velocidad a fina y baje aún más la aguja mientras mira en el microscopio hasta que se observe la punta de la aguja.Mueva la aguja en el centro del campo visual y cambie a un objetivo de larga distancia 40X. Después de esto, seleccione la celda y mueva la aguja por encima de la celda. Ajuste la presión y el tiempo para el contacto de la celda.Mueva la aguja hacia abajo en la celda y luego establezca el límite inferior del micromaniprógrafo. Establecer el límite inferior es la parte más crítica del protocolo. Debido a que la superficie de cobertura no es perfecta y debido a que cada celda es diferente, tendrá que establecer el límite inferior varias veces durante la sesión de inyección.A continuación, vuelva a mover la aguja por encima de la célula y pulse el botón de inyección en el joystick del inyector. La aguja se moverá automáticamente dentro de la célula hasta el lugar donde se establece el límite para inyectar la mezcla de ARN. Para terminar, pulse el botón de menú del inyector y retire la aguja del soporte.A continuación, desconecte el tubo del inyector antes de apagar el inyector y el micromaniprógrafo. Después de la microinyección, devolver las células a una incubadora de dióxido de carbono e incubar a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, enjuague las células tres veces con PBS a temperatura ambiente.Fijar las celdas durante 20 minutos con 4%paraformaldehído en 0,1 tubos molares a pH 6,9. Luego lave las células tres veces con PBS a temperatura ambiente. Si solo se analiza la localización del arn esnar, enjuague brevemente las células en agua y monte en un medio de montaje con DAPI.En caso de localización adicional de proteínas, permeabilizar las células con 0.5%Triton X-100 en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Enjuague las células tres veces con PBS y manchelas con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados como se describe en el protocolo de texto. A continuación, enjuague tres veces con PBS y enjuague una vez en agua.Después de esto, monte las celdas en un medio de montaje con DAPI. Cuando esté listo para la imagen, utilice un sistema microscópico de fluorescencia de alta gama equipado con un objetivo de inmersión para adquirir las imágenes. Una vez identificadas las células microinyecyéyas, recoja una pila de 20 secciones Z con pasos Z de 200 nanómetros por muestra y sujeto a desconvolución matemática.Para cuantificar la señal fluorescente, primero abra la imagen de microscopía en ImageJ y divida los canales en ventanas. Sincronice las ventanas mediante la herramienta Sincronizar ventana. A continuación, dibuje la región de interés alrededor de un cuerpo Deal se identificado por inmunostaining coilin.Mida la intensidad de la señal de ARN en el ROI definido por la bobina. Determinar la intensidad de la fluorescencia del ARN en ROI colocado aleatoriamente en el nucleoplasmo. Guarde los valores medidos y calcule la relación de la señal de ARN en el cuerpo de Cajal y el nucleoplasmo.En este estudio, los snRNAs con etiqueta fluorescente se inyectan microinyectados para monitorear su transporte dentro de la célula. Para comprobar si el sitio SM es importante para la acumulación del cuerpo de Cajal, el ARN que carece del sitio SM se inyecta microinyecte directamente en el núcleo. La inyección en el citoplasma sirve como control, mientras que el ARN de longitud completa se inyecta microinyecía para servir como un control positivo.Después de la incubación, se fijan las células microinyecteladas y la bobina del marcador corporal de Cajal se visualiza mediante inmunofluorescencia indirecta. El ARN de longitud completa se acumuló en los cuerpos de Cajal después de inyecciones nucleares y citoplasmáticos. Por el contrario, el ARN que carecía del sitio SM permaneció en el citoplasma después de la microinyección en este compartimento, mientras que la microinyección nuclear del ARN sin el sitio SM revela que la secuencia de unión SM es importante para la localización del cuerpo de Cajal, ya que este ARN permanece en el núcleo pero no se acumula en los cuerpos de Cajal.A veces la microinyección en un solo compartimiento celular falla y engañado Dextran 70 kilodalton se puede encontrar tanto en el núcleo como en el citoplasma. Estas células se descartan de un análisis posterior. A pesar del hecho de que los snRNAs con etiqueta fluorescente se almacenan en 80 grados Celsius negativos antes de la inyección, puede producirse la degradación del ARN.El ARN degradado inyectado en el citoplasma no se transporta al núcleo y permanece localizado en el citoplasma. Se debe desechar tal arnesón y sintetizar el nuevo ARN. Es importante ajustar correctamente las presiones de inyección y compensación para su tipo de célula.Y como se dijo antes, establecer el límite inferior correcto para la inyección celular es esencial para una buena microinyección. Recuerde que el fenol-cloroformo utilizado durante el aislamiento del ARN es peligroso y que la aguja de microinyección es un objeto afilado. Tenga cuidado al manipular estos materiales.

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