Name: analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Bu çalışma Çek Bilim Vakfı (18-10035S), Ulusal sürdürülebilirlik programı ı (LO1419), kurumsal destek (RVO68378050), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) ve hibe ajansı tarafından destekleniyordu. Charles Üniversitesi (GAUK 134516). Biz daha fazla ışık mikroskobu çekirdek tesisi kabul, ıMG CAS, Prag, Çek Cumhuriyeti (hibe tarafından desteklenen (Czech-Bioımaging-LM2015062).

1. mikroenjeksiyon için snRNAs hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki PCR kurulumunu kullanarak snRNA 'nın tam uzunluklu veya kesilmiş/mutasyona uğramış sürümünü içeren bir DNA şablonunu hazırlayın: 98 °C 60 s, 98 °C için 15 s, 68 °C 30 s, 72 °C için 1 dakika, 98 °C için 15 s 35x ve 72 °C 5 dk.</li>
	<li>İleriye dönük astar, ilk transkripsiyon nükperotid 'in sadece upstream olarak in vitro dökümü için bir organizatör dizisi içermelidir. U2 snRNA dizisini, T7 promotör ve ters astar içeren...

<ol>
	<li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis.">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li><li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits.">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li><li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+bodies:+news+insights+into+structure+and+function.">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li><li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies.">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li><li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation.">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li><li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs:+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap.">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li><li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5&#39;-to-3&#39;+exonucleolytic+digestion.">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5&#39;-to-3&#39; exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li><li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+U4/U6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling.">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li></ol>

SnRNA lokalizasyonu için nükleer Cajal organları için önemli dizileri belirlemek için floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam. Etiketli RNAs 'ların hızlı ve oldukça basit hazırlanması nedeniyle (PCR ile DNA şablonunun hazırlanması ve ardından in vitro transkripsiyon) yöntem, çeşitli dizilerin RNA lokalizasyonu için nasıl katkıda bulunduğunu etkili bir analiz sunar. Nispeten kısa sürede, U2 snRNA 'nın on farklı silme veya değiştirme işlemlerini analiz edebildik (referans<sup class="...

RNA birleştirme, spliceosome denilen büyük bir Ribonükleoprotein kompleksi tarafından katalizlenmiş gen ifadesinde önemli adımlardan biridir. Toplam olarak, 150 ' den fazla protein ve 5 küçük nükleer RNAs (snRNAs) spliceosome içine birleştirme yolu farklı aşamalarında entegre edilmiştir. U1, U2, U4, U5 ve U6 snRNAs, büyük GU-AG intron 'larının takılmasını yapmaya katılıyor. Bu snRNAs, snRNA içeren önceden biçimlendirilmiş küçük nükleer Ribonükleoprotein parçacıkları (snRNPs), snRNA ile ilişkili yedi SM proteinleri (U6 snRNA ile ilişkilendirmek gibi-SM proteinleri) ve her snRNP için spesifik 1-12 proteinleri olan spliceosome 'a katılır.
SnRNPs montajı sitoplazmik ve nükleer aşamaları içerir. Yeni yazılmış snRNA, yedi SM proteininden toplanan bir yüzüğü satın aldığı sitoplazmada ihraç edilir. SM halkası daha sonra snRNA 'nın çekirdeğe yeniden ithalatı için bir sinyal olarak hizmet vermektedir. SM proteinleri ile ilişkilendirmek için başarısız arızalı snRNAs sitoplazmada korunur1. Yeni ithal snrnps ilk Cajal vücutta nerede onlar snrnp özgü proteinler karşılamak ve olgunlaşma bitirmek görünür (referans2,3' te gözden). Son olgunlaşma adımlarını inhibisyonu Cajal organları4,5olgunlaşmamış snrnps sekestrasyon sonuçları gösterdi. Biz son snRNP olgunlaşma snRNP özgü Protein ilavesi ve aktif snRNPs oluşumu izler kalite kontrol altında bir model önerdi. Ancak, hücrelerin doğru birleştirilen olgun ve anormal olgunlaşmamış parçacıklar arasında ayırt nasıl moleküler detayları zor kalır.
Nükleer Cajal vücutlarının hedefleme ve snRNAs birikimi için gerekli olan snRNA dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs mikroenjeksiyon istihdam etmeye karar verdik. Mikroenjeksiyon bir seçim yöntemidir, çünkü: 1) sentetik snRNAs 'ların, ekstra etiket dizisinin yerleştirilmesi için az alan olan kısa RNAs 'lar için özellikle önemli olan endojen meslektaşlarını ayırt etmek için ek bir sıralı etiket gerektirmediği; 2) biyogenesis için önemli olan dizileri analiz sağlar. Örneğin, SM dizisi SM Ring montajı için gereklidir ve çekirdek6' ya yeniden içe aktarabilir. SnRNAs hücrede ifade edildiğinde, SM dizisi bulunmayan snRNAs sitoplazmada bozulur ve çekirdeğin ve Cajal organları7' ye ulaşmaz. Ancak, SM dizisi olmadan snRNAs doğrudan çekirdeğin içine mikro enjekte edilebilir ve böylece Cajal vücut lokalizasyonu içinde SM dizisinin potansiyel bir rolü assayed.
Burada, snRNA dizilerini Cajal gövdesine5' e hedef almak için gerekli olan bir mikroenjeksiyon yöntemi hakkında ayrıntılı olarak tarif ediyoruz. Biz SM ve SMN bağlayıcı siteleri birlikte gerekli ve sadece snRNAs ama Cajal vücuda çeşitli kısa olmayan kodlama RNAs yerelleştirmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Mikroenjeksiyon yanı sıra diğer kanıtlar dayalı, biz SM halka SM bağlayıcı site monte Cajal vücut yerelleştirme sinyali olduğunu önerdi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C11403</td>
			<td>Stock concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>Containing 4.5 g&#8260;L D-glucose, Phenol red and antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet express Injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000043</td>
			<td>Microinjection needle of 0.5 &#181;m inner and 0.7 &#181;m outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9510</td>
			<td>Stock concentration 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded Glass Coverslips</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10817</td>
			<td>Coverslips with a grid, no direct experience with them</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5181000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m3-2,2,7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G trimethyled cap analogue</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-853-1</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAshortscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>111520</td>
			<td>For routine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH</td>
			<td>117520</td>
			<td>For high resolution images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DeltaVision</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope DMI6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32% solution EM grade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15714</td>
			<td>Dissolved in PIPES to the final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform 5:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for U2 amplification: Forward: 5&#8217;-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, 
			Reverse: 5&#180; TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>T7 rpromoter sequence in italics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2615</td>
			<td>Stock concentration 40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1162</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37240</td>
			<td>Dissolved in water, stock concentration 10%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of spliceosomal snrna localization in human hela cells using microinjection

İntronları snrnas Biogenesis hem nükleer ve sitoplazmik aşamaları içeren karmaşık bir süreçtir ve son adım Cajal vücut denilen bir nükleer bölme oluşur. Ancak, snRNA lokalizasyonu bu subnuclear yapısına doğrudan dizileri yakın zamana kadar bilinmemektedir. Cajal vücutlarında snRNAs birikimi için önemli dizileri belirlemek için, floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu ve ardından hücrelerin içindeki lokalizasyonu ile çalışmaktadır. İlk olarak, snRNA silme mutantlar hazırladık, in vitro transkripsiyon için sentezlenmiş DNA şablonları ve Alexa488 ile birleştiğinde UTP varlığı ile snRNAs transkripsiyonu. Etiketli snRNAs TRITC ile konjuli 70 kDa-dextran ile karıştırıldı ve Kernel veya insan HeLa hücrelerinin sitoplazması mikroenjekte edildi. Hücreler 1 h ve sabit ve Cajal vücut Marker aytac dolaylı immünofluorescence tarafından görselleştirilmiş iken, snrnas ve dextran, hangi nükleer veya sitoplazmik enjeksiyon bir marker olarak hizmet veren, doğrudan bir floresan mikroskop kullanılarak gözlenmiştir. Bu yöntem, çeşitli sıraları hücrelerin içinde RNA lokalizasyonu nasıl etkilediğini verimli ve hızlı test etmek için izin verir. Burada, snRNAs 'ın Cajal gövdesine verimli bir şekilde lokalizasyonu için SM-bağlayıcı dizisinin önemini gösteriyoruz.

SnRNA lokalizasyonunu ve Cajal vücut hedeflemede SM bağlama sitesinin rolünü izlemek için, T7 Organizatör içeren bir DNA şablonu ve SM bağlayıcı sitesini oluşturan yedi nükleotid (auuuuug) bulunmayan tam uzunlukta U2 snRNA veya U2 snRNA 'yı hazırladık. snRNAs in vitro transkripsiyonu, izole ve TRITC-bağlı dextran-70kDa ile karışık. İçinde vitro olarak transkripsiyonu snRNA içeren karışımı mikroenjekte ettik.
Daha önce SM bağlayıcı sitenin nükleer ithalat6<...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection at JoVE.com

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

İntronları snrnas Biogenesis çeşitli hücresel bölmeler içeren karmaşık bir süreçtir. Burada, hücrenin içindeki taşımalarını izlemek için floresan etiketli snRNAs 'ın Mikroenjeksiyonu çalışılmış.

Mikroenjeksiyon kullanarak ınsan hela hücrelerinde Spliceosomal snRNA yerelleştirme Analizi

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Burada, kısa nükleer RNA'ların Cajal cisimleri adı verilen nükleer yapılara yerelleştirilmesi için gerekli olan RNA dizilerini tespit etmek için floresan etiketli RNA'ların mikroenjeksiyonunu uyguladık. Bu tekniğin iki büyük avantajı vardır. İlk olarak, etiketlenebilen ve izlenmesi zor olan kısa RNA'lar için uygulanabilir.Ve ikincisi, farklı dizilerin hızlı bir şekilde taranmasına ve RNA yerelleştirmedeki rollerinin test edilmesine olanak tanır. Bir gün önce mikroenjeksiyon, tohum HeLa veya diğer yapışık hücreler 12 milimetre kapakları üzerinde mikroenjeksiyon sırasında% 50 birleştiği zaman ulaşmak için. Başlamak için, bir Petri kabının ortasına hazırlanmış bir kapak yerleştirin, hücreleri ve kültür medya iki milimetre ekleyin.Ertesi gün, hücre dolu Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir mikroloader kullanarak, snRNA karışımının üç mikrolitresini iğneye yükleyin ve iğneyi Petri kabının yüzeyine göre 45 derecelik bir açıyla mikroenjektörtutucuya takın. İğneyi bulmak için 10X uzun mesafe hedefi kullanın.İlk olarak, enjektörüzerinde hız kaba ayarlayın ve kültür ortamı dokunur kadar iğne indirin. Mikroskop dürbün kullanarak, iğne kültür ortamı dokunur yerdir parlak nokta bulmak. İğnenin ucu gözlemlenene kadar mikroskoba bakarken iğneyi ince ve daha da düşürmek için hızı değiştirin.İğneyi görme alanının ortasında hareket ettirin ve 40X uzun mesafe hedefine geçin. Bundan sonra, hücreseçin ve hücre üzerinde iğne hareket ettirin. Hücre teması için basıncı ve zamanı ayarlayın.İğneyi hücreye doğru hareket ettirin ve mikromanipülörün alt sınırını ayarlayın. Alt sınırın ayarlanması protokolün en kritik parçasıdır. Kapak yüzeyi mükemmel olmadığından ve her hücre farklı olduğundan enjeksiyon seansı sırasında alt sınırı birkaç kez ayarlamanız gerekir.Daha sonra iğneyi hücrenin üzerine geri taşıyın ve enjektörün joystick'indeki enjeksiyon düğmesine basın. İğne otomatik olarak hücre içinde rna karışımı enjekte etmek için sınır ayarlanır yere hareket edecektir. Bitirmek için enjektörün üzerindeki menü düğmesine basın ve iğneyi tutucudan çıkarın.Daha sonra enjektör ve mikromanipülörü kapatmadan önce tüpü enjektörden çıkartın. Mikroenjeksiyondan sonra hücreleri karbondioksit kuvöze döndürün ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, oda sıcaklığında PBS ile hücreleri üç kez durulayın.PH 6.9'da 0.1 molar borularda %4 paraformaldehit ile hücreleri 20 dakika boyunca düzeltin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın. Sadece snRNA lokalizasyonu analiz edilirse, hücreleri sudaki durulayın ve DAPI ile montaj ortamına monte edin.Ek protein lokalizasyonu durumunda, hücreyi PBS'de %0.5 Triton X-100 ile oda sıcaklığında beş dakika geçirin. Hücreleri PBS ile üç kez durulayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi uygun birincil ve ikincil antikorlarla lekeleyin. Daha sonra PBS ile üç kez durulayın ve suda bir kez durulayın.Bundan sonra, DAPI ile bir montaj orta hücreleri monte. Görüntüye hazır olduğunuzda, görüntüleri elde etmek için daldırma hedefiyle donatılmış üst düzey bir floresan mikroskobik sistem kullanın. Mikro enjekte edilen hücreler tanımlandıktan sonra, numune başına 200 nanometre Z adımlı ve matematiksel dekonvolutiona tabi olan 20 Z kesitlerinden oluşan bir yığın toplayın.Floresan sinyali ölçmek için önce ImageJ'deki mikroskopi görüntüsünü açın ve kanalları pencerelere bölün. Pencereleri eşitleme penceresi aracıyla eşitleyin. Daha sonra, coilin immunostaining ile tanımlanan bir Cajal vücut etrafında ilgi bölge çizin.Bobin tanımlı Yatırım Getirisi'ndeki snRNA sinyalinin yoğunluğunu ölçün. Nkleoplazm'a rasgele yerleştirilen ROI'daki snRNA floresansının yoğunluğunu belirleyin. Ölçülen değerleri kaydedin ve Cajal gövdesi ve nükleoplazmdaki RNA sinyalinin oranını hesaplayın.Bu çalışmada floresan etiketli snRNA'lar hücre içindeki ulaşımlarını izlemek için mikro enjekte edilmiştir. SM sitesinin Cajal vücut birikimi için önemli olup olmadığını test etmek için, SM bölgesinden yoksun snRNA doğrudan çekirdeğe mikroenjekte edilir. Tam uzunlukta snRNA pozitif kontrol olarak hizmet etmek için mikroenjekte edilirken sitoplazma içine enjeksiyon bir kontrol olarak hizmet vermektedir.Kuluçkadan sonra mikroenjekte edilen hücreler sabitlenir ve Cajal cisim işaretbobini dolaylı immünoresans ile görselleşir. Tam uzunlukta snRNA cajal cisimlerde hem nükleer hem de sitoplazmik enjeksiyonlar sonra birikmiş. Buna karşılık, SM alanı olmayan snRNA bu bölmeye mikroenjeksiyon dan sonra sitoplazmada kalırken, SM sitesi olmadan snRNA'nın nükleer mikroenjeksiyonu, snRNA'nın çekirdekte kaldığı ancak Cajal cisimlerde birikmediği için SM bağlama dizisinin Cajal vücut lokalizasyonu için önemli olduğunu ortaya koymaktadır.Bazen sadece bir hücresel bölmeiçine mikroenjeksiyon başarısız olur ve kandırdı Dextran 70 kilodalton hem çekirdek hem de sitoplazmabulunabilir. Bu hücreler daha fazla analiz atılır. Floresan etiketli snRNA'lar enjeksiyondan önce negatif 80 santigrat derecede depolanmasına rağmen RNA bozulması meydana gelebilir.Sitoplazmaya enjekte edilen bozulmuş snRNA çekirdeğe taşınmaz ve sitoplazmada lokalize kalır. Bu tür snRNA atılmalıdır ve yeni snRNA sentezlenmelidir. İğneve kompanzasyon basınçlarını hücre tipinize doğru şekilde ayarlamak önemlidir.Ve daha önce de belirtildiği gibi, hücre enjeksiyonu için doğru alt sınırı ayarı iyi bir mikroenjeksiyon için gereklidir. RNA izolasyonu sırasında kullanılan fenol-kloroformun tehlikeli olduğunu ve mikroenjeksiyon iğnesinin keskin bir nesne olduğunu lütfen unutmayın. Bu malzemeleri kullanırken dikkatli olun.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Elektrofizyolojik Ölçümler ve İnsan Bebeklerde nosisepsiyon Analizi

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Utero Elektroporasyon in Ferret Neokorteks nöral progenitor hücrelerinin Vivo Hedefleme

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...