Name: detection of extravascular trypanosoma parasites by fine needle aspiration
Uploaded: 2019-08-07T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration at JoVE.com

Este projeto foi financiado pela Fundação para a ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da ciência, tecnologia e ensino superior (MCTES) através do fundos do orçamento de estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). O LMF é investigador da Fundação para a ciência e tecnologia (IF/01050/2014) e o laboratório é financiado pela ERC (FatTryp, ref. 771714). A publicação deste trabalho também foi financiada pelo projeto UID/BIM/50005/2019 financiado pela Fundação para a ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da ciência, tecnologia e ensino superior (MCTES) através da fundos do orçamento de estado. Agradecemos a Andreia Pinto, do laboratório de histologia e patologia comparativa do iMM, pela assistência especializada em microscopia eletrônica, e Sandra Trindade, Tiago Rebelo e Henrique Machado (iMM) para a partilha de tecidos de camundongos infectados.

Todos os experimentos com animais neste protocolo foram realizados de acordo com a regulamentação da UE e aprovados pelo Comitê de ética animal do Instituto de medicina molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). A facilidade animal do iMM cumpre com a lei portuguesa para a utilização de animais de laboratório (Decreto-lei 113/2013) e segue a Diretiva Europeia 2010/63/UE e as diretrizes da FELASA (Federação das associações de Ciências dos animais de laboratório europeu) e recomendações relativas ao bem-estar dos animais de laboratório.
1. aspiração de parasitas dos órgãos reprodutivos masculinos externos do rato
Nota: A aspiração fina da agulha (FNA) foi executada em ratos machos do selvagem-tipo C57BL/6J, 6 a 10 semanas velhas, infectadas com o T. brucei através da injeção intraperitoneal de 200 μl do soro fisiológico com 2.000 parasita como descrito previamente16.
<ol><li>
Para a FNA dos órgãos reprodutivos masculinos externos, coloque o rato numa capa de fluxo laminar, Anestesie o animal com uma injecção intraperitoneal de 200 μL de uma mistura de 75 mg/kg de cetamina + 1 mg/kg de medetomidina em soro fisiológico.
	<ol>
<li>Confirme a anestesia com o método de pinça do dedo do pé. Quando o reflexo da retração da perna está ausente, posicione o mouse na recumbência dorsal (Figura 2a).</li>
		<li>Palpar com cuidado o testis, avaliando o tamanho e a distância da pele sobrejacente. Contenha o órgão entre o índice e o dedo médio ou entre o dedo indicador e o polegar. Esticar a pele sobrejacente firmemente através da massa para imobilizar ainda mais o alvo. Limpe a superfície com toalhetes de álcool (Figura 2a).</li>
		<li>Segure a agulha montada de 22 G e a seringa de 5 mL e insira a ponta da agulha no alvo, sempre com o êmbolo no estado restante (Figura 2b-C).</li>
		<li>Aplique a sucção retirando o êmbolo da seringa para a marca de 4 mL a 5 mL 2-3 vezes. Redirecionar a agulha dentro do órgão em uma linha reta ou ao longo de várias tangentes diferentes para aumentar a probabilidade de uma amostra representativa e de segmentação de estruturas menores, como o epidídimo. Certifique-se de que este procedimento é delicado, para minimizar o dano tecidual (Figura 2C-D).</li>
		<li>Solte a sucção e, em seguida, retire a agulha. Não redesenhe a agulha com o êmbolo recolhido, pois isso levará à aspiração do aspirado para o tambor da seringa e impedirá a sua recuperação (Figura 2e). Após a retirada da agulha, controle qualquer sangramento aplicando pressão com uma esponja de gaze esterilizada no local da punção.</li>
		<li>Desligue a seringa da agulha, encha-a com ar, volte a ligar a agulha e retire suavemente o conteúdo da agulha para uma lâmina. Coloque a ponta da agulha muito perto ou até mesmo na corrediça para evitar o splattering (Figura 2F-I).</li>
		<li>Realize pelo menos uma aspiração adicional por órgão/animal para garantir a amostragem de repetição.</li>
		<li>Reverter a anestesia com uma injeção subcutânea de 200 μL de 1 mg/kg de Atipamezol em soro fisiológico e devolver animais à sua gaiola de repouso para recuperação e observar até à recuperação total.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação do esfregaço do material aspirado
Nota: Use luvas durante todo o procedimento e assegure a eliminação segura das agulhas e das seringas.
<ol><li>
Dois passos puxar método
	<ol>
<li>Pegue o slide que tem a gota do aspirado usando a mão não dominante, e aperte a extremidade fosco entre o polegar eo dedo indicador (Figura 3a).</li>
		<li>Pegue um segundo slide limpo, o slide propagador, com a mão dominante e trazê-lo através do primeiro slide com a gota do aspirado. Coloque a borda limpa e Lisa da lâmina na lâmina da amostra, apenas na parte superior da gota, em um ângulo de aproximadamente 30 ° (Figura 3B).</li>
		<li>Deslize o slide para a frente com um movimento leve, contínuo e constante para obter um filme fino (Figura 3C).</li>
		<li>Descanse a corrediça e permita a secagem de ar completa e rápida do material (Figura 3D). Não aqueça-fixe. Rotule a borda geada do slide com um lápis. Nota: O protocolo pode ser pausado nesta etapa e os esfregaços podem ser armazenados indefinidamente até que estejam prontos para ser manchados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coloração dos esfregaços
Nota: Use luvas durante todo o procedimento e assegure-se de que as etapas 3.1.4 e 3.2.9 estejam executadas dentro de uma capa das emanações.
<ol><li>
Protocolo de coloração de Giemsa
	<ol>
<li>Fixar manchas secas ao ar, imersando as lâminas em um frasco de Coplin contendo 100% de metanol por 5 min (Figura 3E).</li>
		<li>Transfira o slide para um frasco de Coplin contendo 20% de solução de Giemsa (diluída para 1/5 em água destilada) por 30 min, ou 10% de Giemsa por 10 min (Figura 3F).</li>
		<li>Enxágüe em água da torneira e seque cuidadosamente usando papel tissue para DAB.</li>
		<li>Segure o slide horizontalmente e aplique uma gota do meio de montagem não aquoso no esfregaço. Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, abaixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunocytochemistry em esfregaços de FNA
	<ol>
<li>Fixar esfregaços secos a ar em 100% de metanol à temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Lave a corrediça por 5 minutos em um frasco de Coplin com tampão de fosfato 1x (PBS), repetindo este passo 3 vezes usando o PBS 1x fresco cada vez.</li>
		<li>Retire a corrediça do frasco de Coplin, limpe o amortecedor adicional sem tocar na mancha e desenhe um círculo em torno do esfregaço com uma caneta repelente de água (tabela de materiais).</li>
		<li>Segure o slide horizontalmente e aplique 150 μL de solução de anticorpo primário diluído em cada esfregaço e incubar por 1 h à temperatura ambiente. Nota: O anticorpo preliminar usado aqui é um antígeno não-purified do soro do coelho anti-t. brucei VSG13 (Cross-Reactive com muitos t. brucei vsgs, produzidos em casa), diluído em 1X PBS em 1:50000. Executar controles negativos, substituindo o anticorpo primário apropriado com soro pré-imune (tabela de materiais) para permitir a avaliação da ligação não específica do anticorpo secundário.</li>
		<li>Lave a corrediça por 5 minutos em um frasco de Coplin com 1X PBS, repetindo esta etapa 3 vezes usando o PBS 1x fresco cada vez.</li>
		<li>Segure o slide horizontalmente e aplique 150 μL de sistema de visualização peroxidase/DAB de rábano disponível comercialmente para cada esfregaço. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente (tabela de materiais).</li>
		<li>Lave por 3x por 5 min em 1X PBS.</li>
		<li>Contratura por imersão das lâminas em um frasco de Coplin contendo Harris hematoxilina. Enxágüe em água da torneira e seque cuidadosamente usando papel para DAB.</li>
		<li>Segure o slide horizontalmente e aplique uma gota do meio de montagem não aquoso no esfregaço. Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, abaixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Leopold, G., Koss, M. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Koss&#8217; Diagnostic cytology and it&#8217;s histologic bases. , (2006).</li><li>Raskin, R. E., Meyer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).</li><li>Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+invasive+assessment+of+tumor+angiogenesis+by+fine+needle+aspiration+and+flow+cytometry.">Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry.</a> Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).</li><li>Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+needle+aspiration+biopsy+proves+increased+T-lymphocyte+proliferation+in+tumor+and+decreased+metastatic+infiltration+after+treatment+with+doxorubicin+bound+to+PHPMA+copolymer+carrier.">Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A aspiração fina da agulha (FNA) é um método amplamente utilizado para diagnosticar a doença em animais humanos e domésticos. A técnica tem sido padronizada ao longo de muitos anos1,2, oque faz uso de uma agulha de pequeno furo para aspirar células ou fluidos de uma massa palpável ou órgão1,3. O aspirado é então tipicamente manchado em uma corrediça de vidro e manchado para a observação microscópica para conseguir um diagnóstico, mas a técnica pode igualmente ser usada para recuperar pilhas para outras finalidades4,5,6, 7 anos de , 8 . º , a 9.
O procedimento é rápido (< 5 min por mouse, para um pesquisador experiente) e o risco de complicações é mínimo, semelhante ao risco incorrido quando submetido a punção venosa simples. Por esta razão, para FNA de massas palpáveis, a anestesia é exigida somente para posições anatômicas sensíveis ou quando uma boa imobilização do animal e a estabilização do órgão ou da massa a ser aspirada são extremamente cruciais para resultados os melhores. Isto é freqüente para animais pequenos do laboratório, como a contenção segura e eficaz de um roedor pequeno com uma mão ao assegurar o melhor acesso à área para a aspiração com a outra mão, é difícil de conseguir sem anestesia. A anestesia de curto prazo é, na maioria dos casos, suficiente, no entanto necessário, para uma boa FNA no mouse. Uma boa imobilização maximiza as chances de obter um aspirado que é representativo dos componentes celulares da lesão e também minimiza as chances de externalizar a ponta da agulha enquanto a pressão negativa é aplicada.
Embora o procedimento em si seja muito simples, a aplicação coordenada e a liberação de vácuo são as etapas mais críticas. Após a inserção da agulha, o êmbolo da seringa é retraído para conseguir um vácuo controlado (sucção), e a agulha só pode ser removida da massa depois de liberar a pressão negativa, deixando ir do êmbolo (Figura 2); caso contrário, o aspirado é sugado para o barril da seringa e, em seguida, é muito difícil de recuperar. Outro passo muito importante é a preparação de esfregaços de alta qualidade. Existem vários métodos para fazer um esfregaço, mas independentemente do método, esfregaços devem ser preparados imediatamente após o material foi colocado sobre o vidro. O material biológico deve ser espalhado suavemente para evitar artefatos de esmagamento de células. O uso de uma lamínula como propagador pode ajudar a evitar esses artefatos. No entanto, a aplicação de demasiada força ao fazer o esfregaço vai quebrar a lamínula. Uma mancha da boa qualidade tem tipicamente a maioria da população da pilha distribuída como o monocamada de modo que possam facilmente transmitir a luz. O material celular não deve ser excessivamente preso no coágulo sanguíneo.
O objetivo de uma FNA é coletar células de uma massa, tecido ou órgão. O uso de agulhas maiores do furo é útil aumentar o cellularity, mas pode ser associado com a contaminação excessiva do sangue, quando a amostragem com agulhas menores rende uma qualidade mais elevada, embora o material menos abundante. No nosso caso, a aspiração percutânea das estruturas reprodutivas masculinas externas em camundongos infectados experimentalmente com T. bruceifoi realizada com agulhas de calibre 22 acopladas a uma seringa de 5 ml. Os camundongos foram anestesiados, o testis foi estabilizado com uma mão e punção e aspiração guiada e realizada com a outra mão. Foram recuperados numerosos tripanossomas misturados com células germinativas, espermatozóides, células epiteliais e células estromais, que foram manchadas e imunomanchadas para as proteínas superficiais dos parasitas (VSG) (Figura 4).
Há sempre o erro potencial da amostragem nos aspirados produzindo resultados negativos porque embora as áreas múltiplas de uma lesão dada possam ser amostradas várias vezes, esta é uma aspiração cega onde nós não visualizamos a ponta da agulha e o órgão ou a massa do alvo. Isto é extremamente relevante em um ajuste clínico, onde um Fna negativo de uma lesão suspeita não evitar umas investigações mais adicionais, mas não é tão relevante em modelos animais da doença. Assim, as limitações gerais incluem principalmente resultados falsos negativos, e menos freqüentemente resultados falsos positivos (por exemplo, da contaminação do sangue), mas a limitação a mais importante no ajuste da experimentação animal é a falta da informação no tecido arquitetura17, como temos com histopatologia, por exemplo, padrão de distribuição de parasitas, de células imunes e características de interação celular-célula. No entanto, as vantagens são de que a PAAF é um procedimento não terminal que permite a amostragem repetida no mesmo animal ao longo do tempo e sempre possibilita uma melhor morfologia celular preservada (Figura 5). Alternativas para a FNA para a colheita de células hospedeiras, células imunes ou microrganismos de um rato sempre dependem de eutanizar o rato para recolher a massa ou órgãos de interesse.
A nosso conhecimento, há somente alguns relatórios no uso de Fna em animais pequenos do laboratório, um de 1949 que corresponde à aspiração da medula com a agulha de 22 G para estudar o hematopoiese18, e todo o outro em combinação com a citometria do fluxo a quantificar células inflamatórias associadas ao tumor ou células endoteliais7,19,20. Nosso trabalho mostra que esta técnica pode ser estendida ao diagnóstico e ao estudo de modelos infecciosos da doença e pode combinar a citologia com as técnicas como o Immunocytochemistry ou a microscopia de elétron. Duas das principais vantagens do método em animais experimentais são: (1) este procedimento não é terminal, ou seja, pode ser realizado em camundongos vivos; e (2) devido à sua gravidade leve, permite aspirações seriais no mesmo animal. Portanto, menos camundongos são necessários para cada estudo, e a correlação entre progressão da doença clínica e evolução das características celulares e moleculares de uma doença e/ou microrganismo pode ser facilmente realizada, possibilitando estudos longitudinais.
Talvez o primeiro relato sobre o uso da FNA para diagnosticar doenças infecciosas seja um estudo de Grieg e Gray em 1904 que relata aspirações de agulhas de linfonodos de pacientes com doença do sono, que revelaram tripanossomas motile12. Se nossos achados em camundongos laboratoriais encontrarem tradução para bovinos, ou seja, se o Trypanosoma pode ser facilmente amostrado pela Fna a partir das estruturas reprodutivas masculinas externas, pode-se esperar que essa técnica seja útil para os veterinários para o diagnóstico de animais tripanossomose na fazenda, no gado.

A aspiração fina da agulha (FNA) é amplamente utilizada no diagnóstico do cancro e das doenças não-neoplásticas, ambos em animais humanos e domésticos. A técnica tem sido padronizada ao longo dos anos e é descrita em inúmeros livros didáticos1,2.
Consiste, em grande parte, na aspiração percutânea de massas palpáveis, órgãos ou derrames com uma agulha fina montada sobre uma seringa vazia, utilizando a pressão negativa para retirar células ou fluidos da massa1,3. As agulhas são tipicamente 22 a 25 G (calibre que corresponde ao diâmetro interno da agulha), e o uso de uma agulha maior do furo (grande diâmetro, por exemplo, 21 G) é útil aumentar o cellularity, embora este possa produzir a contaminação excessiva do sangue. Comprimento da agulha dependerá da profundidade da massa, mas 1 ou 11/2 polegadas é comumente usado para massas superficiais. As seringas são tipicamente 5 a 10 mL, com as seringas maiores que atingem o vácuo mais elevado, que aumenta por sua vez o rendimento aspirado. Massas profundas não palpáveis também podem ser aspiradas, com agulhas mais longas e orientação de imagem (ultrassonografia). O aspirado recuperado pode então ser manchado, ar seco, molhado-fixo, manchado e observado um microscópio para conseguir um diagnóstico3 (Figura 1).
Esta é uma técnica simples, barata, painless e mìnima invasora usada principalmente no ajuste pré-operativo para conseguir um diagnóstico em massas palpáveis e igualmente para órgãos, como nós de linfa, tiróide, próstata ou mesmo as estruturas reprodutivas masculinas externas 1. além de ser uma ferramenta diagnóstica, esta técnica também pode ser utilizada para a coleta de células para outros fins, ou seja, citogenética, microscopia eletrônica (Figura 1D), caracterização citométrica de fluxo4,5 ,6,7, estabelecimentode culturas de células8. Um exemplo comum na prática clínica é A recuperação de espermatozóides para fertilização in vitro9.
A aspiração pode ser repetida várias vezes na mesma massa para obter múltiplos esfregaços. Em caso de lesão heterogênea, por exemplo, uma área sólida e um espaço cístico, é importante que as células sejam aspiradas de cada região. O material coletado pela FNA é em geral altamente celular, que na maioria dos casos permite o diagnóstico de doenças sem a necessidade de uma biópsia tecidual. Manchas especiais, imunofluorescência. Immunocytochemistry (Figura 1D), e as técnicas moleculars podem igualmente ser executadas nas manchas obtidas através de Fna, por exemplo, para a identificação de agentes infecciosos quando não reconhecíveis pela morfologia sozinho10. Uma breve visão geral das aplicações gerais e dos equipamentos e suprimentos necessários para a FNA estão resumidas nas tabelas 1 e 2, respectivamente.
O primeiro relatório no uso da punctura da agulha para finalidades diagnósticas é descrito em escritas adiantadas da medicina árabe, mas é no início do século XX que as técnicas modernas da aspiração da agulha foram executadas11. Notavelmente, talvez o primeiro relato que sugere o uso da FNA para o diagnóstico de doenças infecciosas foi um estudo em 1904, onde Grieg e Gray relataram que as aspirações da agulha de linfonodos de pacientes com doença do sono revelaram tripanossomas motile12 . Os autores relataram a presença de tripanossomas em casos precoces e avançados, e em maior densidade do que o observado em esfregaços sanguíneos, onde estes são frequentemente raros eventos12.
O diagnóstico atual de tripanossomíase em bovinos depende da observação direta de parasitas no sangue, linfa ou em técnicas imunodiagnósticas13,14,15. Nós mostramos previamente que em infecções experimentais de Trypanosoma no rato, o brucei de Trypanosoma (T. brucei) tem um tropismo notável ao tecido adiposo16 e também a algumas das estruturas reprodutivas masculinas externas, ou seja, epidídimo17. Os parasitas se acumulam no estroma desses tecidos em grandes números16.
O protocolo descrito abaixo descreve um procedimento técnico detalhado passo a passo para a FNA em camundongos vivos, visando a aspiração de tripanossomas presentes nas estruturas reprodutivas masculinas externas (testículos, epidídimo e gordura epididimérmica), seguidas por citologia convencional e imunocoloração para proteínas parasitas específicas (VSG)16,17. A aspiração foi realizada 6 dias após a infecção e os procedimentos de segurança que se aplicam são aqueles comumente estabelecidos para manuseio rotineiro de animais experimentais. Medidas adicionais são necessárias para os animais que têm deficiências imunes (vestindo um vestido esterilizado a vapor, máscara, capota de cabelo, luvas estéreis, e garantir a técnica asséptica em todos os momentos) para mitigar a exposição acidental a patógenos oportunistas.

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<tbody>
<tr>
<td>Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL)</td>
<td>Bio 2</td>
<td>7418046</td>
<td>Anesthesia reversal</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover slips (24 x 60 No.1)</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0664</td>
<td>Smear making</td>
</tr>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>Dako</td>
<td>K3468</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Entellan (500 mL)</td>
<td>VWR</td>
<td>1.07961.0500</td>
<td>Mounting media</td>
</tr>
<tr>
<td>Envision Flex antibody diluent </td>
<td>Dako</td>
<td>8006</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit)</td>
<td>Dako</td>
<td>K4010</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Envision Flex Wash Buffer </td>
<td>Dako</td>
<td>K8007</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Giemsa stain </td>
<td>Atom Scientific Ltd</td>
<td>RRSPSS-A</td>
<td>Smear staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass slides (Superfrost Plus)</td>
<td>VWR</td>
<td>631-9483</td>
<td>Smear making</td>
</tr>
<tr>
<td>Harris Haematoxylin </td>
<td>Bio-optica</td>
<td>05-06004E</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxidase solution </td>
<td>Sigma</td>
<td>H1009-500ML</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Hypodermic needles Microlance 3 (23G) </td>
<td>Henry Schein</td>
<td>902-8001</td>
<td>Aspiration technique</td>
</tr>
<tr>
<td>Ketamin (IMALGENE 1000 - 10 mL)</td>
<td>Bio 2</td>
<td>7410928</td>
<td>Anesthesia </td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomidine (DOMITOR 10 mL) </td>
<td>Bio 2</td>
<td>7418335</td>
<td>Anesthesia </td>
</tr>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>Merck</td>
<td>1.06009.2511</td>
<td>Smear fixative</td>
</tr>
<tr>
<td>Pap pen </td>
<td>Merck</td>
<td>Z377821-1EA</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Protein Block Serum free </td>
<td>Dako</td>
<td>X0909</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (5 mL, 10 mL)</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>900-3311, 900-3304</td>
<td>Aspiration technique</td>
</tr>
</tbody>
</table>

detection of extravascular trypanosoma parasites by fine needle aspiration

A aspiração fina da agulha (FNA) é um procedimento diagnóstico rotineiro essencial às práticas médicas e veterinárias. Consiste na aspiração percutânea de células e/ou microrganismos de massas palpáveis, órgãos ou derrames (acumulação de fluidos em uma cavidade corporal) usando uma agulha fina semelhante à agulha regular usada para a punção venosa. O material coletado pela FNA é em geral altamente celular, e o aspirado recuperado é então manchado, ar seco, molhado-fixo, manchado e observado um microscópio. No contexto clínico, a FNA é uma importante ferramenta diagnóstica que serve como um guia para o manejo terapêutico adequado. Porque é simples, rápido, minimamente invasivo e requer investimento limitado no laboratório e recursos humanos, é amplamente utilizado por praticantes de veterinária, principalmente em doméstico, mas também em animais de fazenda. Em estudos que utilizam modelos animais, a FNA tem a vantagem de que pode ser realizada repetidamente no mesmo animal, possibilitando estudos longitudinais através da coleta de células de tumores e órgãos/tecidos ao longo da doença. Além do que a microscopia rotineira, o material recuperado pode igualmente ser usado para o Immunocytochemistry, a microscopia de elétron, a análise bioquímica, a citometria do fluxo, a biologia molecular ou in vitro ensaios. A FNA tem sido utilizada para identificar o protozoário parasita Trypanosoma brucei nas gônadas de camundongos infectados, abrindo a possibilidade de um diagnóstico futuro em bovinos.

A PAAF foi realizada nos órgãos reprodutivos externos masculinos de camundongos infectados com T. brucei usando uma agulha de 22 G acoplada a uma seringa de 5 ml e lâminas de vidro para a preparação do esfregaço (Figura 1a-C). O método é simples mas os resultados óptimos confiam em etapas críticas: a imobilização perfeita do rato conseguida com a anestesia geral, e a estabilização dos órgãos durante todo o procedimento inteiro (Figura 2a-B). A sucção foi aplicada 2-3 vezes e a agulha redirecionada 1-2 vezes para permitir a amostragem representativa dos órgãos e dos tecidos menores: epidídimo e gordura epididimal. A pressão negativa foi liberada antes de externalizar a agulha. O aspirado contido no lúmen e no cubo da agulha (aproximadamente 20 μL), foi utilizado para produzir 2 esfregaços (Figura 3a-C). Nos casos em que a agulha foi retirada sem a liberação da sucção, o material foi sugado para dentro da seringa e não foi recuperável. O processo foi repetido com sucesso duas vezes, um para cada órgão emparelhado. Após a secagem, esfregaços foram molhados-fixos e Immunocytochemistry para as proteínas de superfície do tripanossoma foi executado.
Um esfregaço de boa qualidade (figura 4a-C) foi caracterizado por uma monocamada de células com boa densidade celular, em que as células hospedeiras apresentam características morfológicas preservadas, permitindo a identificação de seu tecido de origem e relativa proporção entre si. Os parasitas foram eficientemente imuno-manchados, identificáveis e contáveis (Figura 4B). Um exemplo de um FNA de uma efusão peritoneaa em um rato contaminado, manchado com Giemsa para a observação direta e o diagnóstico, é mostrado igualmente (Figura 3D-F e Figura 4C).
Um resultado pobre ou negativo de FNA pode ser devido às razões diferentes: (1) demasiado pouco material de FNA é expressado na corrediça e é subrepresentante da amostra; (2) muito material de FNA é expressado em um único slide, fazendo manchas excessivamente grossas e prejudicando a avaliação citológica; (3) demasiada força é aplicada ao fazer o esfregaço, e as células são interrompidas, resultando em um monte de núcleos nus e raias de DNA (artefato esmagamento); ou (4) não se aplica força suficiente ao fazer o esfregaço e as células não se desagregam, resultando em uma camada estratificada que impede a avaliação das características morfológicas das células (Figura 5).
Quando comparamos a Citopatologia da FNA com a histopatologia, ou seja, a análise de células versus tecidos, o punho tem a vantagem de que a morfologia celular é melhor preservada e as proporções relativas e a contagem das células podem ser melhor avaliadas (Figura 6). Além disso, o Immunocytochemistry é mais simples, mais rápido e mais fácil de aperfeiçoar do que Immunohistochemistry, que é executado tipicamente no tecido formalin-fixado e parafina-encaixado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Alvo</td>
			<td>Aplicativos</td>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Limitações</td>
		</tr>
<tr>
<td>Massa palpável</td>
			<td>Microscopia de rotina, diagnóstico</td>
			<td>Simples, rápido</td>
			<td>Nenhuma arquitetura do tecido</td>
		</tr>
<tr>
<td>Órgão</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td>Baixo custo</td>
			<td rowspan="4">Aspiração cega (a agulha pode faltar alvo tangencialmente; a aspiração pode segmentar áreas necróticas, císticas ou hemorrágicas)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efusões</td>
			<td>Citometria de fluxo</td>
			<td>Amostragem de vários sites</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Citogenética</td>
			<td>Morfologia celular bem preservada</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Microscopia eletrônica</td>
			<td>Livre de complicações</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR, outras técnicas moleculares</td>
			<td>Exatidão diagnóstica elevada</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Análise bioquímica</td>
			<td>Anestesia (para imobilização)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ensaios in vitro, cultura celular</td>
			<td>Procedimento não terminal</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: alvo, aplicações gerais, vantagens e limitação da aspiração fina da agulha.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kit FNA</td>
			<td>Archetype de uma agulha e de uma seringa da aspiração</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aspiração:</td>
			<td>Peças da agulha:</td>
		</tr>
<tr>
<td>1. seringas plásticas descartáveis (5 ou 10 mL) (Figura 1b)</td>
			<td>
Chanfro. A ponta do eixo da agulha é inclinada para dar forma a um ponto, a inclinação que é o chanfro. Somente as agulhas chanfradas são apropriadas para aspirações percutaneous.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. agulhas de 22 a 25-gauge (diâmetro); 0,75, 1,0, 1,5 polegadas de comprimento, com borda chanfrada padrão da ponta da agulha (Figura 1a)</td>
			<td>
Eixo. Porção tubular oca da agulha cujo comprimento pode ser ajustado de acordo com a profundidade da massa. O calibre da agulha corresponde ao diâmetro de seu furo, que é o diâmetro do interior do eixo (as agulhas menores têm um calibre mais elevado). O uso de agulhas maiores do furo (menos de 22 G) é útil aumentar o cellularity, embora este possa produzir a contaminação iatrogênica excessiva do sangue.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1. anestesia (se necessário). A dor associada à PAAF é semelhante à de punção venosa, porém, boa aspiração requer boa imobilização do sujeito, especialmente importante em animais de pequeno porte e/ou para lesões e órgãos pequenos e flutuantes. Ratos e camundongos sujeitos à PAAF devem ser adequadamente restrinados passivamente, ou, quando necessário, sedados ou anestesia geral leve.</td>
			<td>
Hub. Porção plástica da agulha que está presa à seringa; deve ser transparente para permitir a visualização do material aspirado. O material aspirado obtido durante a PAAF deve ser coletado no eixo da agulha e a aspiração interrompida quando o material é visto entrando no cubo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tomada e interpretação da mancha de FNA:</td>
			<td>Peças da seringa:</td>
		</tr>
<tr>
<td>1. fosco final microscópio de vidro slides (Figura 1C)</td>
			<td>
Tambor/cilindro. Porção oca da seringa. A menos que lidar com lesões císticas ou derrames, o material que é aspirado para o barril geralmente não pode ser recuperado. O volume ideal de aspirado para a citologia de FNA é aproximadamente 5 μL, correspondendo ao volume médio de aspirado que ocupa o eixo e o cubo da agulha.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. romanowsky manchas tipo (por exemplo, diff-Quik, Giemsa)</td>
			<td>
A gorjeta. Fim do barril ao qual o cubo da agulha está anexado.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. microscópio (brilhante-campo)</td>
			<td>
Êmbolo. Porção móvel da seringa que tem um disco liso ou lábio em uma extremidade e um selo de borracha na outra extremidade. Cabe no tambor e fornece a pressão para desenhar as células, fluido na agulha. Um êmbolo perfeitamente selado que cria uma boa pressão negativa é obrigatório para obter um bom rendimento aspirado.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: equipamentos e suprimentos necessários para a aspiração de agulhas finas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig01v4.jpg"> Figura 1 : Ferramentas e resultados para a aspiração fina da agulha. (A) o diâmetro ideal da agulha para Fna é de 22 a 25 G. (B) o volume ideal da seringa para obter um bom rendimento aspirado é de 5 a 10 ml. (C) Limpe, seque, livre da corrediça de vidro da graxa com área geada da marcação para escrever com lápis e pre-coated (se para immunohistochemistry). (D) exemplo de Trypanosomes observado com coloração de Giemsa (ponta de seta preta), imunomanchada para as proteínas superficiais do VSG (ponta de seta branca) e microscopia eletrônica de transmissão (seta de bloqueio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig01v4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig02v4.jpg"> Figura 2 : Esquemas que mostram a aspiração fina da agulha (Fna) dos órgãos reprodutivos masculinos externos (testis, epididymis, e gordura epididimal) nos ratos. (A) uma vez que o animal é fixado, o instrumento de aspiração previamente montado é recolhido. (B-C) Insira a ponta da agulha no órgão alvo. (D) Aplique a sucção retraindo o êmbolo da seringa para a marca de 1 ml a 2 ml, repetidamente 3-4 vezes. A ponta da agulha pode igualmente ser movida para a frente e para trás dentro do alvo ao aplicar a sucção, para coletar o suficiente material. (E) Solte a sucção e retire a agulha. (F) Retire a agulha da seringa e (G) Puxe o êmbolo para trás. (H) volte a colocar a agulha. (I) expelir o material sobre uma lâmina de vidro empurrando o êmbolo rapidamente através da seringa. A fim evitar splattering, assegure-se de que a ponta da agulha descanse muito perto ou mesmo na corrediça. A gota do aspirado é coloc aproximadamente 1 cm da borda da área geada da marcação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig02v4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig03v2.jpg"> Figura 3 : Preparação e coloraçãoda mancha. (A) Segure uma extremidade do slide (área fosco) entre o polegar e o dedo indicador. (B) Coloque a borda limpa lisa de uma segunda corrediça (propagador) na corrediça da amostra apenas na frente da gota do material. (C) deslize a propagação para a frente uma vez com velocidade moderada para obter um filme fino. (D) permita que a corrediça seque e rotule a borda geada da corrediça com um lápis. (E) após a correção de secagem completa com metanol por 5 min. (F) mancha com solução de Giemsa 20% por 30 min (ou 10% Giemsa por 10 min). Enxague levemente com água, seque completamente, mergulhe no xileno e montado com um agente de montagem insolúvel em água. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig04v4.jpg"> Figura 4 : Microfotografias de esfregaços obtidos de PAAF de estruturas reprodutivas masculinas externas em camundongos infectados com T. brucei. (A) aparência bruta de um esfregaço direto de boa qualidade: o material foi expresso no slide a aproximadamente 1 cm de distância da borda fosco (ponto preto), manchado e parado 0,5 cm antes da borda do slide (linhas paralelas). (B) Immunocytochemistry para as proteínas de superfície do parasita (VSG) foi executado para os esfregaços obtidos de Fna dos órgãos reprodutivos masculinos externos no dia 6 da infecção. Numerosos parasitas (Arrowhead) foram detectados misturados com células germinativas do camundongo (seta). DAB contratura com a hematoxilina de Harris. Ampliação original: 40x (barra de escala = 50 μm). (C) Giemsa-coloração do esfregaço obtido após a PAAF de uma efusão peritoneal no dia 21 da infecção, mostrou numerosos parasitas (Arrowhead) misturados com células hospedeiras (camundongo), neste caso, células inflamatórias, macrófagos (seta) e linfócitos. Ampliação original: 40x (barra de escala = 50 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig04v4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig05v4.jpg"> Figura 5 : Má qualidade esfregaços de Fna. (A) esfregaço mal celular, subrepresentante da massa ou órgão. (B) esfregaço muito espesso. (C) artefato esmagado, com células interrompidas, núcleos nus e estrias de DNA. (D) agregados e camadas estratificadas de células. DAB contratura com a hematoxilina de Harris. Ampliação original: 20x (barra de escala = 100 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig05v4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig06v4.jpg"> Figura 6 : Comparação da citologia epididimérmica e histologia em camundongos infectados com T. brucei. (A) microfotografias correspondentes a um esfregaço da Fna e (B) uma seção de parafina de 4 μm, na mesma ampliação (ampliação original de 20x, barra de escala = 100 μm), ambas imunomanchadas para as proteínas superficiais do parasita (VSG). O esfregaço mostrou grande número de parasitas (Arrowhead) com morfologia celular bem preservada, misturado com números moderados de células germinativas e poucos espermatozóides (seta). A seção histológica mostrou uma arquitetura bem preservada do tecido, compor dos dutos epididimal com espermatozóides intraluminal (seta), e a presença de um grande número parasitas que expandem o estroma epididimal (Arrowhead). DAB contratura com a hematoxilina de Harris. Ampliação original: 20x (barra de escala = 100 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig06v4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

A aspiração fina da agulha é uma técnica, por meio de que as pilhas são obtidas de uma lesão ou de um órgão usando uma agulha fina. Os materiais aspirados são manchados, manchados e examinados um microscópio para o diagnóstico ou usados para a biologia molecular, a citometria ou a análise in vitro. É barato, simples, rápido e provoca um trauma mínimo.

Deteção de parasitos extravascular do Trypanosoma pela aspiração fina da agulha

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous ...

A citologia de aspiração de agulha fina é uma técnica barata, simples, rápida e minimamente invasiva que usamos para coletar trypanosomos de lesões palpáveis em órgãos em camundongos vivos. Dado que a aspiração da agulha fina é um procedimento não terminal, permite a amostragem repetida no mesmo animal ao longo do tempo. Se esses achados puderem ser traduzidos para o gado, esse método será muito útil para os veterinários diagnosticarem triplosomiase em bovinos em uma fazenda.Demonstrando o procedimento de coloração de manchas será Ana Margarida Santos, tecnóloga assistente do meu laboratório. Para começar, confirme a anestesia com o método de beliscar o dedo do dedo do dedo. Quando o reflexo da retração da perna estiver ausente, posicione o rato na recência dorsal.Empalidece cuidadosamente os testículos para determinar o tamanho e a distância da pele sobrelada e, em seguida, contê-lo entre o índice e o dedo médio ou entre o dedo indicador e o polegar. Para imobilizar ainda mais o alvo, estique a pele sobrelada firmemente e limpe a superfície com lenços umedecidos. Em seguida, insira a ponta da agulha de uma agulha de calibre 23 conectada a uma seringa de cinco mililitros no alvo certificando-se de que o êmbolo está no estado de descanso.Para aplicar a sucção, retraia o êmbolo da seringa na marca de três a quatro milímetros de duas a três vezes. Para aumentar a probabilidade de obter uma amostra representativa e de direcionar estruturas menores como a epidídis, redirecione a agulha dentro do órgão em linha reta ou ao longo de várias tangentes diferentes. Solte a sucção e retire a agulha.A agulha só pode ser removida depois que a pressão negativa for liberada soltando o êmbolo. Caso contrário, o aspirador é sugado para dentro da seringa e é irrecuperável. Aplique pressão com uma esponja de gaze estéril no local da punção para controlar qualquer sangramento.Desconecte a seringa da agulha e encha-a com ar. Reconecte a agulha, coloque a ponta da agulha bem perto ou mesmo no slide e ejete suavemente o conteúdo da agulha sobre o slide. Para garantir a reprodução da amostragem, realize pelo menos uma aspiração adicional por órgão e animal.Depois de reverter a anestesia com uma injeção subcutânea de 200 microlitres de um miligrama por quilo Atipamezole em soro fisiológico, devolva os animais à sua gaiola para recuperação. Usando a mão nondominante, pegue o slide que tem a gota de aspirado beliscando a extremidade fosca entre o polegar e o dedo indicador. Usando a mão dominante, pegue um slide de espalhador limpo e coloque-o suavemente borda limpa através do segundo slide apenas na parte superior da gota em um ângulo de aproximadamente 30 graus.Para obter uma película fina, deslize o slide para a frente com um movimento contínuo e constante leve. Descanse o slide e deixe a secagem completa e rápida do material. Rotule a borda fosco do escorregador com um lápis.Para o protocolo de coloração giemsa, conserte manchas secas de ar imergindo os slides em um frasco de Coplin contendo 100% de metanol por cinco minutos. Em seguida, transfira os slides para um frasco Coplin contendo solução 20% Giemsa e água destilada por 30 minutos. Enxágüe as lâminas na água da torneira e dab com papel de tecido para secar completamente.Ao segurar o slide horizontalmente, aplique várias gotas de meio de montagem não diagante na mancha. Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, baixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar. Para imunocitoquímica, fixar manchas secas de ar em 100% de metanol à temperatura ambiente por 10 minutos.Lave o slide por cinco minutos em um frasco coplin com 1X PBS repetindo esta etapa três vezes usando pbs 1X fresco todas as vezes. Depois de remover os slides do frasco coplin, limpe o excesso de tampão sem tocar na mancha e desenhe uma linha ao redor da mancha com uma caneta repelente de água. Enquanto segura o slide horizontalmente, aplique 150 microliters de solução de anticorpos primários diluídos para cada mancha e incubar por uma hora à temperatura ambiente.Após a incubação, lave os slides por cinco minutos em um frasco de Coplin com 1X PBS repetindo esta etapa três vezes usando PBS 1X fresco todas as vezes. Enquanto segura o slide horizontalmente, aplique 150 microliters de rabanete comercialmente disponível no sistema de visualização da DAB em cada mancha e, em seguida, incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Lave os slides novamente três vezes durante cinco minutos em PBS.Em seguida, contra-manchar imergindo os slides em um frasco Coplin contendo hematoxilina Harris por 10 segundos. Enxágüe na água da torneira e dab com papel para secar completamente. Ao segurar o slide horizontalmente, aplique várias gotas de meio de montagem não diagante na mancha.Coloque a borda de um vidro de cobertura sobre o slide, baixe-a e pressione suavemente para remover quaisquer bolhas de ar. Uma mancha de boa qualidade foi caracterizada por uma monocamada de células com boa densidade e características morfológicas preservadas permitindo a identificação de seu tecido de origem e proporção relativa entre si. Além disso, os parasitas eram eficientemente imunossuidentes, identificáveis e contáveis.Os resultados de aspiração de agulha fina ruim ou negativa podem ser devido a pouco material e, portanto, sob representação da massa ou órgão. Também pode ser devido a muito material em um único slide fazendo manchas excessivamente grossas e prejudicando a avaliação citológica. O chamado artefato esmagado acontece devido a muita força sendo aplicada ao fazer a mancha sair para células rompidas resultando em muitos núcleos nus e listras de DNA.Quando não há força suficiente durante a preparação da mancha, as células não desagregam resultando em uma camada estratificada que impede a avaliação das características morfológicas das células. Comparação da citopatologia da aspiração da agulha fina com a histopatologia, a citopatologia teve a vantagem de uma morfologia celular melhor preservada e melhor avaliação das proporções relativas e da contagem das células. A imunocitoquímica é mais simples, rápida e fácil de otimizar do que a imunohistoquímica.Para aspiração fina da agulha, sempre garanta uma boa imobilização do animal, estabilização dos órgãos ou massa a ser aspirada, e uma aplicação e liberação coordenada de vácuo. Em seguida, para manchas de alta qualidade, espalhe-se imediatamente após o material ter sido colocado sobre o vidro e seja suave sobre a força aplicada para fazer a mancha para evitar artefatos esmagados por células. Além da microscopia de rotina e imunocitologia, este material também pode ser usado para microscopia eletrônica, análise bioquímica, citometria de fluxo, biologia molecular, ou mesmo para ensaios in vitro.Essa técnica nos permitiu demonstrar que a aspiração de agulha fina pode ser usada para diagnosticar e estudar doenças em animais experimentais. Conseguimos diagnosticar o tropismo dos parasitas do Trypanosoma nos órgãos reprodutivos masculinos externos e também caracterizar essa doença ao longo da infecção.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

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Exame da estrutura G-Telomere saliência na Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Imunologia e Infecção

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Microondas Assistida Diagnóstico Rápido de Doenças vírus de planta por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...