Name: detection of extravascular trypanosoma parasites by fine needle aspiration
Uploaded: 2019-08-07T14:00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration at JoVE.com

Этот проект был профинансирован Фондом пара Ci'ncia e Tecnologia (FCT)/ Министерио да Сьенсия, Tecnologia электронной Ensino Superior (MCTES) через Fundos ду Оршаменто де Эстадо (реф.: ID / BIM/50005/2019). LMF является исследователем Фонда пара Ci'ncia электронной Tecnologia (IF/01050/2014) и лаборатория финансируется ERC (FatTryp, ref.771714). Публикация этой работы также финансировалась UID/BIM/50005/2019 проект, финансируемый Funda'o para a Ci'ncia e a Tecnologia (FCT)/ Министерио да Сьенсия, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) через Fundos do Or'amento de Estado. Мы благодарим Андрея Пинто из Лаборатории гистологии и сравнительной патологии ИММ за помощь эксперта по электронной микроскопии, а Сандру Триндаде, Тиаго Ребело и Энрике Мачадо (iMM) за обмен тканями инфицированных мышей.

Все эксперименты на животных в этом протоколе были проведены в соответствии с правилами ЕС и одобрены Комитетом по этике животных Института Молекулярной Медицины (iMM), (AEC-2011-006-LF-TBrucei-IMM). Объект iMM в отношении животных соответствует португальскому законодательству об использовании лабораторных животных (Декрет-Закон 113/2013) и следует Европейской директиве 2010/63/EU и руководящим принципам FELASA (Федерация европейских лабораторных ассоциаций по науке о животных) и рекомендации, касающиеся лабораторного благополучия животных.
1. Стремление паразитов от внешних мужских репродуктивных органов мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Изобразительная аспирация иглы (FNA) была выполнена в диких типа мужчин C57BL/6J мышей, от 6 до 10 недель, инфицированных T. brucei через интраперитонеальной инъекции 200 Л соления с 2000 паразитов, как описано ранее16.
<ol><li>
Для FNA внешних мужских репродуктивных органов, поместите мышь в ламинар ный капот потока, обезболять животное с интраперитонеальной инъекцией 200 л смеси 75 мг/кг кетамин 1 мг/кг медетомитин в сольном.
	<ol>
<li>Подтвердите анестезию методом щепотки. Когда рефлекс опрокидки ноги отсутствует, положение мыши в подошве recumbency(рисунок 2A).</li>
		<li>Тщательно пальпировать яичка, оценивая размер и расстояние от надлежащей кожи. Ограничите орган между указательным и средним пальцами или между указательным и большим пальцами. Вытяните надлежащую кожу плотно по всей массе, чтобы еще больше обездвижить цель. Очистите поверхность спиртными салфетками(рисунок 2A).</li>
		<li>Держите собранную 22 G иглу и шприц 5 мл и вставьте кончик иглы в цель, всегда с поршенем в состоянии отдыха(рисунок 2B-C).</li>
		<li>Примените всасывание путем втягивать поршень шприца к метке 4 mL до 5 mL 2-3 времени. Перенаправьте иглу внутри органа либо по прямой линии, либо по нескольким различным касательным, чтобы увеличить вероятность репрезентативного образца и ориентации на более мелкие структуры, такие как эпидидимис. Убедитесь, что эта процедура является мягкой, чтобы свести к минимуму повреждение тканей(Рисунок 2C-D).</li>
		<li>Отпустите всасывание, а затем снять иглу. Не перерисовывайте иглу с убранным поршенем, так как это приведет к всасыванию аспирата в бочку шприца и затрудните его восстановление(рисунок 2E). После снятия иглы, контролировать любые кровотечения, применяя давление со стерилизованные губки марли на месте прокола.</li>
		<li>Отсоедините шприц от иглы, заполните его воздухом, воссоедините иглу и аккуратно вывешивайте содержимое иглы на горку. Поместите кончик иглы очень близко или даже на слайд, чтобы избежать брызг(рисунок 2F-I).</li>
		<li>Выполните по крайней мере одно дополнительное стремление на орган/животное, чтобы обеспечить репликацию выборки.</li>
		<li>Вернуть анестезию с подкожной инъекцией 200 л 1 мг/кг атипамезола в солевой растворе и вернуть животных в родную клетку для выздоровления и наблюдать до полного выздоровления.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Подготовка мазка из аспирового материала
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки на протяжении всей процедуры и обеспечить безопасное удаление игл и шприцев.
<ol><li>
Метод вытягивания двух шагов
	<ol>
<li>Возьмите слайд, который имеет падение аспирата с помощью недоминирующей стороны, и щепотку матовый конец между большим и указательным пальцем (Рисунок 3A).</li>
		<li>Возьмите второй чистый слайд, распределительник слайд, с доминирующей рукой и довести его через первый слайд с падением аспирата. Поместите гладкий чистый край слайда на образец слайд только на верхней части капли под углом примерно 30 "(Рисунок3B).</li>
		<li>Скользить слайд вперед с одним легким, непрерывным и устойчивым движением, чтобы получить тонкую пленку(Рисунок 3C).</li>
		<li>Отдых слайд и обеспечить полную и быструю сушку воздуха материала(Рисунок 3D). Не нагревайте. Наклейте карандашом матовый край горки. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на этом этапе и мазки могут храниться бесконечно, пока не будет готов к окрашивания.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Окрашивание мазков
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки на протяжении всей процедуры и убедитесь, что шаги 3.1.4 и 3.2.9 выполняются внутри капота дыма.
<ol><li>
Протокол окрашивания Гимсы
	<ol>
<li>Исправить высушенные в воздухе мазки, погрузив слайды в банку Коплин, содержащий 100% метанола в течение 5 мин(рисунок 3E).</li>
		<li>Перенесите слайд в банку Коплина, содержащую 20% раствор giemsa (разбавленный до 1/5 в дистиллированной воде) в течение 30 мин, или 10% Giemsa в течение 10 мин(рисунок 3F).</li>
		<li>Промыть в водопроводной воде и высушить тщательно с помощью бумаги ткани, чтобы мазок.</li>
		<li>Держите слайд горизонтально и нанесите одну каплю неводно-разводной среды крепления на мазок. Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Иммуноцитохимия в мазках ФНА
	<ol>
<li>Исправить высушенные на воздухе мазки в 100% метанола при комнатной температуре в течение 10 минут.</li>
		<li>Вымойте слайд в течение 5 минут в банку Коплин с 1x фосфат буфера (PBS), повторяя этот шаг 3 раза с помощью свежих 1x PBS каждый раз.</li>
		<li>Удалите слайд из банки Коплин, протрите лишний буфер, не касаясь мазка и нарисуйте круг вокруг мазка с водоотталкивающим пером (Таблица материалов).</li>
		<li>Держите слайд горизонтально и нанесите 150 л разбавленного первичного раствора антитела к каждому мазку и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: Первичное антитело, используемое здесь, является неочищенным антигеном сыворотки кролика anti-T. brucei VSG13 (кросс-реактивным со многими T. brucei VSGs, произведенным в доме), разбавленным в 1x PBS в 1:50,000. Выполните отрицательный контроль, заменив соответствующее первичное антитело с предиммунной сывороткой(Таблица материалов), чтобы обеспечить оценку неспецифических связывания вторичного антитела.</li>
		<li>Вымойте слайд в течение 5 минут в банку Коплин с 1x PBS, повторяя этот шаг 3 раза с помощью свежих 1x PBS каждый раз.</li>
		<li>Держите слайд горизонтально и нанесите 150 л коммерчески доступной системы визуализации куньда/DAB для каждого мазка. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре(Таблицаматериалов).</li>
		<li>Вымойте в течение 3 раз в течение 5 мин в 1x PBS.</li>
		<li>Противокоесть, погружая слайды в банку Коплин, содержащий Харрис гематоксилин. Промыть в водопроводной воде и высушить тщательно с помощью бумаги, чтобы мазок.</li>
		<li>Держите слайд горизонтально и нанесите одну каплю неводно-разводной среды крепления на мазок. Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Leopold, G., Koss, M. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Koss&#8217; Diagnostic cytology and it&#8217;s histologic bases. , (2006).</li><li>Raskin, R. E., Meyer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).</li><li>Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration+biopsy+for+cytopathologic+analysis:+Utility+of+syringe+handles,+automated+guns,+and+the+nonsuction+method.">Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method.</a> Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).</li><li>Saliba, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+sorting+and+multimodal+typing+of+cancer+cells+in+self-assembled+magnetic+arrays.">Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).</li><li>Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+flow+cytometry+for+immunophenotyping+lymphoproliferative+disorders+in+cats:+a+retrospective+study+of+19+cases.">The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases.</a> Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).</li><li>Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+fine-needle+aspiration+cytology+and+flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+primary+and+recurrent+lymphoma.">Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma.</a> Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).</li><li>Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+fine-needle+aspiration+of+solid+tumours+in+mice+allows+the+identification+of+multiple+infiltrating+immune+cell+types.">Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).</li><li>Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+needle+aspiration+as+a+tool+to+establish+primary+human+breast+cancer+cultures+in+vitro.">Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro.</a> Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).</li><li>Craft, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+epididymal+sperm+aspiration+and+intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+management+of+infertility+due+to+obstructive+azoospermia.">Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia.</a> Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).</li><li>Powers, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+infectious+diseases:+A+cytopathologist&#8217;s+perspective.">Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist&#8217;s perspective.</a> Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).</li><li>Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-needle+aspiration+(FNA)+biopsy:+Historical+aspects.">Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).</li><li>Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note+on+the+lymphatic+glands+in+sleeping+sickness.">Note on the lymphatic glands in sleeping sickness.</a> British Medical Journal. 1 (2265), 1252 (1904).</li><li>Robson, J., Ashkar, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosomiasis+in+domestic+livestock+in+the+Lambwe+Valley+area+and+a+field+evaluation+of+various+diagnostic+techniques.">Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques.</a> Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).</li><li>Disease, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=African+Animal+Trypanosomiasis.">African Animal Trypanosomiasis.</a> In Vitro. , 1-15 (2009).</li><li>Kennedy, P. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+features,+diagnosis,+and+treatment+of+human+African+trypanosomiasis+(sleeping+sickness).">Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness).</a> Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).</li><li>Trindade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+parasites+occupy+and+functionally+adapt+to+the+adipose+tissue+in+mice.">Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).</li><li>Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+bruceitriggers+a+marked+immune+response+in+male+reproductive+organs.">Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).</li><li>Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals.">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4 (5), 557-561 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+invasive+assessment+of+tumor+angiogenesis+by+fine+needle+aspiration+and+flow+cytometry.">Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry.</a> Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).</li><li>Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+needle+aspiration+biopsy+proves+increased+T-lymphocyte+proliferation+in+tumor+and+decreased+metastatic+infiltration+after+treatment+with+doxorubicin+bound+to+PHPMA+copolymer+carrier.">Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier.</a> Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Fine Needle Aspiration (FNA) является методом, широко используемым для диагностики заболеваний у человека и домашних животных. Техника была стандартизирована на протяжении многих лет1,2, который использует мелкой иглы, чтобы аспирировать клетки или жидкость из ощутимой массы или органа1,3. Аспират затем, как правило, смазывают на стеклянной горке и окрашенных для микроскопического наблюдения для достижения диагноза, но техника также может быть использован аспиратом для других целей4,5,6, 7 (г. , 8 , 9.
Процедура быстрая (для опытного исследователя 5 мин на мышь) и риск осложнений минимален, по аналогии с риском, понесенным при прохождении простого венозного прокола. По этой причине, для FNA ощутимых масс, анестезия требуется только для чувствительных анатомических местах или когда хорошая иммобилизация животного и стабилизации органа или массы, чтобы быть аспирированным чрезвычайно важно для оптимальных результатов. Это часто для мелких лабораторных животных, как безопасное и эффективное ограничение небольшого грызуна с одной стороны, обеспечивая лучший доступ к области для устремления с другой стороны, трудно достичь без анестезии. Краткосрочная анестезия в большинстве случаев достаточна, тем не менее необходима, для хорошего FNA в мыши. Хорошая иммобилизация максимизирует шансы получения аспирата, который является репрезентативным для клеточных компонентов поражения, а также сводит к минимуму шансы на экстернализацию кончика иглы при применении отрицательного давления.
Хотя сама процедура очень проста, скоординированное применение и высвобождение вакуума являются наиболее важными шагами. После вставки иглы, поршень шприца убирается для достижения контролируемого вакуума (всасывания), и игла может быть удалена из массы только после освобождения отрицательное давление, отпустив поршень (Рисунок 2); в противном случае аспират всасывается в бочку шприца, а затем очень трудно восстановить. Еще одним очень важным шагом является подготовка высококачественных мазков. Существуют различные методы, чтобы сделать мазок, но независимо от метода, мазки должны быть подготовлены сразу же после того, материал был помещен на стекло. Биологический материал должен быть распространен осторожно, чтобы избежать клеточной дробления артефактов. Использование coverslip в качестве распределители может помочь предотвратить эти артефакты. Тем не менее, применение слишком много силы при принятии мазок сломает coverslip. Мазок хорошего качества обычно имеет большую часть популяции клеток, распределенных как монослой, так что они могут легко передавать свет. Сотовый материал не должен быть чрезмерно в ловушке в сгусток крови.
Целью FNA является сбор клеток из массы, ткани или органа. Использование больших игл ы полезны для увеличения клеточной, но может быть связано с чрезмерным загрязнением крови, в то время как выборка с меньшими иглами дает более высокое качество, хотя и менее обильный материал. В нашем случае, перкутанное стремление внешних мужских репродуктивных структур у мышей, экспериментально инфицированных T. brucei, было выполнено с 22-калиберными иглами в сочетании с 5 мл шприца. Мыши были под анестетом, яички стабилизировались одной рукой и проколить и стремление руководствоваться и выполняется с другой стороны. Мы извлекли многочисленные трипаносомы, смешанные с зародышевыми клетками, сперматозоидами, сперматозоидами, эпителиальными клетками и стромальными клетками, которые были смазаны и ослаблены на поверхностные белки паразитов (VSG) (Рисунок 4).
Существует всегда потенциальная ошибка выборки в аспирати дает отрицательные результаты, потому что, хотя несколько областей данного поражения могут быть отобраны несколько раз, это слепое стремление, где мы не визуализировать кончик иглы и целевой орган или массу. Это крайне актуально в клинических условиях, где негативное FNA подозрительного поражения не отменяет дальнейших исследований, но это не так актуально в животных моделях болезни. Таким образом, общие ограничения включают в основном ложные отрицательные результаты и реже ложные положительные результаты (например, от загрязнения крови), но наиболее важным ограничением в настройках экспериментов на животных является отсутствие информации о тканях архитектура17, как у нас с гистопатологией, например, распределение картины паразитов, иммунных клеток, и клеточных взаимодействий особенностей. Тем не менее, преимущества в том, что FNA является нетерминальной процедурой, позволяющей проводить повторный отбор проб в одном и том же животном, и всегда позволяет лучше сохранившуюся клеточную морфологию(рисунок 5). Альтернативы FNA для сбора клеток-хозяев, иммунных клеток или микроорганизмов от мыши всегда полагаются на эвтаназию мыши для сбора массы или органов, представляющих интерес.
Насколько нам известно, Есть только несколько докладов об использовании FNA в небольших лабораторных животных, один из 1949, соответствующие стремление костного мозга с 22 G иглы для изучения hematopoiesis18, и все другие в сочетании с потоком цитометрии количественно либо опухолевых воспалительных клеток или эндотелиальных клеток7,19,20. Наша работа показывает, что этот метод может быть распространен на диагностику и изучение моделей инфекционных заболеваний и может сочетать цитологию с такими методами, как иммуноцитохимия или электронная микроскопия. Два основных преимущества метода у экспериментальных животных: (1) эта процедура не является терминальной, т.е. может быть выполнена у живых мышей; и (2) из-за своей легкой тяжести он позволяет для серийных устремлений в том же животном. Таким образом, меньше мышей требуется для каждого исследования, и корреляция между прогрессированием клинических заболеваний и эволюции клеточных и молекулярных особенностей болезни и / или микроорганизмов может быть легко выполнена, что позволяет продольных исследований.
Возможно, первый доклад об использовании FNA для диагностики инфекционных заболеваний является исследование Григ и Грей в 1904 году, что доклады иглы стремления лимфатических узлов от пациентов со сонной болезнью, которая показала, мотилические trypanosomes12. Если наши выводы на лабораторных мышах найдут перевод на крупный рогатый скот, т.е. если трипаносома может быть легко отобрана ФНА из внешних мужских репродуктивных структур, можно ожидать, что этот метод будет полезен ветеринарам для диагностики животных трипаносомоз на ферме, в животноводстве.

Fine Needle Aspiration (FNA) широко используется в диагностике онкологических и неопластических заболеваний, как у животных, так и у домашних животных. Техника была стандартизирована на протяжении многих лет и описана в многочисленных учебниках1,2.
Она в значительной степени состоит из перкутанного стремления ощутимых масс, органов или выпотов с тонкой иглой, установленной на пустой шприц, используя отрицательное давление, чтобы вывести клетки или жидкость из массы1,3. Иглы, как правило, от 22 до 25 G (калибровка, соответствующая иглы внутреннего диаметра), и использование больших иглы (большой диаметр, например, 21 G) полезно для увеличения клеточной, хотя это может привести к чрезмерному загрязнению крови. Длина иглы будет зависеть от глубины массы, но 1 или 11'2 дюйма обычно используется для поверхностных масс. Шприцы, как правило, от 5 до 10 мл, с большими шприцев достижения более высокого вакуума, который, в свою очередь, увеличивает выход аспирата. Не-ощутимые глубоко сидячие массы также могут быть аспирированы, с более длинными иглами и под руководством изображения (ультрасонография). Извлеченный аспират может быть смазан, высушен воздухом, мокрой фиксированной, окрашенных и наблюдается под микроскопом для достижения диагноза3 (Рисунок 1).
Это простая, недорогая, безболезнененная и минимально инвазивная техника, в основном используемая в предоперационной обстановке для достижения диагноза на ощутимых массах, а также для органов, таких как лимфатические узлы, щитовидная железа, простата или даже внешние мужские репродуктивные структуры 1. В дополнение к тому, диагностический инструмент, этот метод может быть использован для сбора клеток для других целей, а именно, цитогенетика, электронная микроскопия (Рисунок 1D), поток цитометрической характеристики4,5 ,6,7, создание клеточных культур8. Распространенным примером в клинической практике является поиск спермыдля экстракорпорального оплодотворения 9.
Стремление может быть повторено несколько раз в той же массе, чтобы получить несколько мазков. В случае разнородного поражения, например, твердой области и кистозного пространства, важно, чтобы клетки аспирировались из каждого региона. Материал, собранный ФНА, в целом высококлеточный, что в большинстве случаев позволяет диагностировать заболевания без необходимости биопсии тканей. Специальные пятна, иммунофлуоресценция. иммуноцитохимия(рисунок 1D),и молекулярные методы также могут быть выполнены в мазках, полученных через FNA, например, для идентификации инфекционных агентов, когда не узнаваемы ежей только по морфологии10. Краткий обзор общих заявок и оборудования и материалов, необходимых для ФНА, обобщен в таблицах 1 и 2,соответственно.
Первый доклад об использовании прокола иглы для диагностических целей описан в ранних писаниях арабской медицины, но это в начале 20-го века, что современные методы аспирации иглы были реализованы11. Примечательно, что, возможно, первый доклад, который предлагает использование FNA для диагностики инфекционных заболеваний было исследование в 1904 году, где Григ и Грей сообщили иглы стремления лимфатических узлов от пациентов со сонной болезнью показали мотилические trypanosomes12 . Авторы сообщили о наличии трипаносомы как в ранних, так и в запущенных случаях, причем при более высокой плотности, чем в мазках крови, где это часто редкие события12.
Текущий диагноз трипаносомоза у крупного рогатого скота опирается на прямое наблюдение паразитов в крови, лимфатической или иммунодиагностической технике13,14,15. Мы ранее показали, что в экспериментальных инфекций трипаносомы у мыши, Trypanosoma brucei (T. brucei) имеет замечательный тропизм жировой ткани16, а также некоторые внешние мужские репродуктивные структуры, а именно эпидидимис17. Паразиты накапливаются в строми этих тканей в большом количестве16.
Протокол, изображенный ниже, описывает подробную пошаговую техническую процедуру для FNA у живых мышей, направленную на стремление трипаносом, присутствующих во внешних мужских репродуктивных структурах (testis, epididymis и эпидидимальных жира), а затем традиционная цитология и иммуностоинг для специфических белков паразитов (VSG)16,17. Стремление было выполнено через 6 дней после инфекции и процедуры безопасности, которые применяются те, обычно установленных для регулярного обращения с экспериментальными животными. Дополнительные меры необходимы для животных, которые имеют иммунный дефицит (ношение паростерилизовательное платье, маска, капот для волос, стерильные перчатки, и обеспечение асептической техники во все времена), чтобы смягчить случайное воздействие оппортунистических патогенов.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL)</td>
<td>Bio 2</td>
<td>7418046</td>
<td>Anesthesia reversal</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover slips (24 x 60 No.1)</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0664</td>
<td>Smear making</td>
</tr>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>Dako</td>
<td>K3468</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Entellan (500 mL)</td>
<td>VWR</td>
<td>1.07961.0500</td>
<td>Mounting media</td>
</tr>
<tr>
<td>Envision Flex antibody diluent </td>
<td>Dako</td>
<td>8006</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit)</td>
<td>Dako</td>
<td>K4010</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Envision Flex Wash Buffer </td>
<td>Dako</td>
<td>K8007</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Giemsa stain </td>
<td>Atom Scientific Ltd</td>
<td>RRSPSS-A</td>
<td>Smear staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass slides (Superfrost Plus)</td>
<td>VWR</td>
<td>631-9483</td>
<td>Smear making</td>
</tr>
<tr>
<td>Harris Haematoxylin </td>
<td>Bio-optica</td>
<td>05-06004E</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxidase solution </td>
<td>Sigma</td>
<td>H1009-500ML</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Hypodermic needles Microlance 3 (23G) </td>
<td>Henry Schein</td>
<td>902-8001</td>
<td>Aspiration technique</td>
</tr>
<tr>
<td>Ketamin (IMALGENE 1000 - 10 mL)</td>
<td>Bio 2</td>
<td>7410928</td>
<td>Anesthesia </td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomidine (DOMITOR 10 mL) </td>
<td>Bio 2</td>
<td>7418335</td>
<td>Anesthesia </td>
</tr>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>Merck</td>
<td>1.06009.2511</td>
<td>Smear fixative</td>
</tr>
<tr>
<td>Pap pen </td>
<td>Merck</td>
<td>Z377821-1EA</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Protein Block Serum free </td>
<td>Dako</td>
<td>X0909</td>
<td>Immunocytochemistry</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (5 mL, 10 mL)</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>900-3311, 900-3304</td>
<td>Aspiration technique</td>
</tr>
</tbody>
</table>

detection of extravascular trypanosoma parasites by fine needle aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) является обычной диагностической процедурой, необходимой как для медицинской, так и для ветеринарной практики. Она состоит из перкутанного аспирации клеток и/или микроорганизмов из ощутимых масс, органов или выпотов (накопление жидкости в полости тела) с помощью тонкой иглы, похожей на обычную иглу, используемую для венозного прокола. Материал, собранный FNA, в целом высококлеточный, и извлеченный аспират затем смазывается, сушат воздух, мокрые фикчированные, окрашенные и наблюдается под микроскопом. В клиническом контексте, FNA является важным диагностическим инструментом, который служит в качестве руководства для соответствующего терапевтического управления. Поскольку он прост, быстр, малоинвазивн и требует ограниченных инвестиций в лабораторные и людские ресурсы, он широко используется ветеринарными специалистами, в основном в домашних, но и в сельскохозяйственных животных. В исследованиях с использованием моделей животных, FNA имеет то преимущество, что она может быть выполнена неоднократно в том же животном, что позволяет продольных исследований через сбор клеток из опухолей и органов / тканей в течение болезни. В дополнение к обычной микроскопии, извлеченный материал также может быть использован для иммуноцитохимии, электронной микроскопии, биохимического анализа, цитометрии потока, молекулярной биологии или in vitro assays. FNA был использован для выявления простейшей паразит trypanosoma brucei в гонады инфицированных мышей, открывая возможность для будущего диагноза у крупного рогатого скота.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration at JoVE.com

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration - это метод, при котором клетки получаются из поражения или органа с помощью тонкой иглы. Аспирированный материал смазывается, окрашивается и исследуется под микроскопом для диагностики или используется для молекулярной биологии, цитометрии или анализа пробирки. Это дешево, просто, быстро и вызывает минимальную травму.

Обнаружение внесосудистой трипаносомой паразитов путем тонкого аспирации иглы

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous ...

Тонкая цитология аспирации игл является недорогим, простым, быстрым и минимально инвазивным методом, который мы используем для сбора трипаносом от ощутимых поражений в органах у живых мышей. Учитывая, что тонкая аспирации иглы является не терминальной процедурой, она позволяет повторного отбора проб в том же животном с течением времени. Если эти выводы могут быть переведены на крупный рогатый скот, этот метод будет очень полезен для ветеринаров для диагностики трипаносомоза у крупного рогатого скота на ферме.Демонстрацией процедуры окрашивания мазка будет Ана Маргарита Сантос, помощник технолога из моей лаборатории. Для начала подтвердите анестезию методом щепотки нос. Когда рефлекс опрокидывания ноги отсутствует, положение мыши в спинной лежачих.Тщательно пальпировать яички, чтобы определить размер и расстояние от чрезмерной кожи, а затем ограничить его между указательным и средним пальцем или между указательным пальцем и большим пальцем. Для дальнейшей обездвиживания цели, растянуть чрезмерной кожи плотно и очистить поверхность с спиртом салфетки. Затем вставьте кончик иглы иглы 23 калибра, подключенной к пятими миллилитровому шприцу, в цель, убедившись, что поршень находится в состоянии покоя.Чтобы применить всасывание, втягивать поршень шприца до трех-четырех миллиметров знак два-три раза. Чтобы увеличить вероятность получения репрезентативной выборки и ориентации небольших структур, таких как эпидидимис, перенаправьте иглу внутри органа либо по прямой линии, либо по нескольким различным касательной. Отпустите всасывание, а затем снять иглу.Игла может быть удалена только после того, как отрицательное давление будет выпущено, отпустив поршень. В противном случае, аспират всасывается в шприц и невосполним. Нанесите давление стерильной марлевой губкой на месте прокола, чтобы контролировать кровотечение.Отсоедини шприц от иглы и наполните его воздухом. Воссоедините иглу, поместите кончик иглы очень близко или даже на слайде и аккуратно выбросьте содержимое иглы на слайд. Для обеспечения взятия проб выполнить по крайней мере одно дополнительное стремление на орган и животное.После возвращения анестезии с подкожной инъекцией 200 микролитров по 1 миллиграмму на килограмм атипамизола в солевой раствор, возвращай животных в свою домашнюю клетку для выздоровления. Используя недоминантную руку, возьмите слайд, который имеет каплю аспирата щипать матовой конец между большим и указательным пальцами. Используя доминирующую руку, возьмите чистый слайд распределитель и поместите его гладким чистым краем через второй слайд только на верхней части падения под углом около 30 градусов.Чтобы получить тонкую пленку, скользить слайд вперед с одним светом непрерывного и устойчивого движения. Отдых слайд и обеспечить полную и быструю сушку воздуха материала. Наклеьте карандашом матовую кромку слайда.Для протокола окрашивания Giemsa, исправить воздух сушеные мазки, погружая слайды в банку Coplin, содержащий 100% метанол в течение пяти минут. Затем перенесите слайды в банку Coplin, содержащую 20%Giemsa раствор и дистиллированной воды в течение 30 минут. Промыть слайды в водопроводной воде и мазок салфеткой, чтобы высохнуть тщательно.Удерживая слайд горизонтально, нанесите на мазок несколько капель неакеозной крепления среды. Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Для иммуноцитохимии, исправить воздух сушеные мазки в 100% метанола при комнатной температуре в течение 10 минут.Вымойте слайд в течение пяти минут в банке Coplin с 1X PBS повторяя этот шаг три раза, используя свежие 1X PBS каждый раз. После удаления слайдов из банки Coplin, протрите избыточный буфер, не касаясь мазка и провести линию вокруг мазка с водоотталкивающей ручкой. Удерживая слайд горизонтально, нанесите 150 микролитров разбавленного раствора первичного антитела на каждый мазок и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре.После инкубации, мыть слайды в течение пяти минут в банке Coplin с 1X PBS повторяя этот шаг три раза с помощью свежих 1X PBS каждый раз. Удерживая слайд горизонтально, нанесите 150 микролитров коммерчески доступной системы визуализации хрена peroxidase DAB на каждый мазок, а затем инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды снова три раза в течение пяти минут в PBS.Затем counterstain, погружая слайды в банку Коплин, содержащий Харрис гематоксилин в течение 10 секунд. Промыть в водопроводной воде и мазок бумагой, чтобы высохнуть тщательно. Удерживая слайд горизонтально, нанесите на мазок несколько капель неакеозной крепления среды.Поместите край крышки стекла на слайд, опустите его и нажмите осторожно, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. Мазок хорошего качества характеризовался монослой клеток с хорошей плотностью и сохранившимися морфологическими особенностями, позволяющими идентифицировать их ткани происхождения и относительную пропорцию друг между другом. Кроме того, паразиты были эффективно иммунотестных, идентифицируемых и подсчитываемых.Плохие или отрицательные тонкие результаты устремления иглы могут быть из-за слишком маленького материала и таким образом под представителем массы или органа. Это также может быть связано с слишком большим материалом на одном слайде решений слишком толстые мазки и нарушения цитологической оценки. Так называемый дробленый артефакт происходит из-за слишком большой силы, применяемой при принятии мазка оставляя нарушенных клеток в результате чего много голых ядер и полос ДНК.Когда не хватает силы применяется во время подготовки мазка, клетки не дезагрегируется в результате стратифицированного слоя, который препятствует оценке морфологических особенностей клеток. Сравнение тонкой цитопатологии аспирации иглы с гистопатологией, цитопатологией имело преимущество лучше сохранившейся клеточной морфологии и лучшей оценки относительных пропорций и подсчета клеток. Иммуноцитохимия проще, быстрее и проще в оптимизации, чем иммуногистохимия.Для тонкой аспирации иглы, всегда обеспечить хорошую иммобилизацию животного, стабилизация органов или массы, чтобы быть аспирированным, и скоординированное применение вакуума и выпуска. Затем для высококачественных мазков, сразу же распространение после того, как материал был помещен на стекло и быть нежным на прочность применяется, чтобы сделать мазок, чтобы избежать ячейки измельченных артефактов. В дополнение к обычной микроскопии и иммуноцитохимии, этот материал также может быть использован для электронной микроскопии, биохимического анализа, цитометрии потока, молекулярной биологии, или даже для анализа in vitro.Этот метод позволил нам продемонстрировать, что тонкая аспирации иглы могут быть использованы для диагностики и изучения заболеваний у экспериментальных животных. Мы смогли диагностировать тропизм паразитов трипаносомы внешним мужским репродуктивным органам, а также охарактеризовать это заболевание в течение инфекции.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Рассмотрение теломер G-навес структуры в Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Микроволновая печь Assisted экспресс-диагностики болезней растений Вирус помощью просвечивающей электронной микроскопии

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Обнаружение токсинного транслокации в хост цитозоля от поверхностного плазменного резонанса

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Высокая пропускная способность гена Tagging в<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

обнаружение<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Вариант поверхности гликопротеин Переключение с помощью магнитных Активированный сортировки клеток и проточной цитометрии

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Сверхчувствительная обнаружения биомаркеров с помощью молекулярного импринтинга основе емкостной биосенсор

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...