Name: purification of platelets from mouse blood
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Platelets from Mouse Blood at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי סטארט-up מימון של הקרן המחקר של סינסינטי לילדים ואוניברסיטת סינסינטי מענק הפיילוט Translational M.N. אנחנו רוצים להודות הילדים סינסינטי בבית החולים מחקר זרימה Cy, ליבה על השירותים שלהם.

אוסף דם העכבר צריך להתבצע עם טיפול בעלי חיים מוסדיים המתאים ולהשתמש אישור הוועדה.
הערה: פרוטוקול טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה באיור 1.
1. אוסף דם
<ol><li>הוסף 25 μL של 3.2% נתרן ציטראט (pH 7.2) כאנטי מקריש ו 0.4 mM של הפרו-Pro-Arg-Pro (GPRP) בצינור פוליפ...

<ol>
	<li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation.">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li><li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte:+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation.">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li><li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+signaling+cells+in+the+immune+continuum.">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li><li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+platelets+and+PBMC:+New+evidence+in+wound+healing.">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li><li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall.">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li><li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets'+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock.">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li><li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis.">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li><li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+&amp;#34;first+responders&amp;#34;+in+wound+response,+cancer,+and+metastasis.">Platelet &amp;#34;first responders&amp;#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li><li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection.">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li><li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood.">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).</li><li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new,+rapid,+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood.">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li><li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo.">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li><li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nycodenz:+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium.">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li><li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge.">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li><li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice.">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function.">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li><li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease.">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li><li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic/severe+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li><li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection,+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide.">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li><li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+murine+platelet+structure,+function,+assays,+and+genetic+alterations.">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li><li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway.">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li></ol>

בדרך כלל, טסיות מבודדות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה אשר מניב פלזמה עשיר טסיות המכיל מספר משמעותי של כדוריות הדם, הפסולת התאית, וחלבונים פלזמה אשר יכול להפריע הביוכימי והפיסיולוגיים והצרכים הפיזיולוגיים טיהור נוסף21. לכן, חשוב להשתמש בשיטה מהירה ופשוטה אשר יכולה להניב טסיו?...

טסיות הם רכיב של דם המתפקד כיוזם של קרישת דם בתגובה לנזק בכלי הדם. הם מתאספים באתר של פציעה. כדי לחבר את כלי הקיבול לקיר1 טסיות הם שברי אנוקלאט של ציטופלסמה הנגזר מהקרציטים של מח העצם תחת השפעת התרובטין ולהיכנס למחזור הדם2. הם נחשבים metabolically פעילים ומסוגלים לחוש הסביבה מסחטות על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים כי התוצאה היא התפשטות טסיות, מצבור, ו הומוסטטית היווצרות תקע1,3. מלבד הומוסטזיס/פקקת וריפוי הפצע4, טסיות לשחק תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות מארח, אנגיוגנזה, ו גרורות3,5,6,7, שמונה.
טסיות מטוהרים מדם ללמוד תכונות ביוכימיים ופיסיולוגיים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מרכיבי דם אחרים. מאז כדוריות הדם האדומות (rbc) וכדוריות הדם הלבנות (wbc) מכילים באופן משמעותי יותר RNA וחלבונים מאשר טסיות9,10, נוכחות של מספר קטן של תאים אלה יכול להפריע לניתוח הטרנססקריפט והפרוטאומית של RNA וחלבונים הנגזרים מטסיות הדם. מצאנו כי טסיות מטוהרים מופעל עם נוגדנים לאגד תרומבין כגון אנטי GPIIb/IIIa (ג'ון/A) ו אנטי-P-selectin ביעילות רבה יותר מאשר טסיות דם שלמות.
מאחר שטסיות הן שבירות, חשוב לטפל בדגימות במתינות ככל האפשר. אם טסיות מופעלות, הם משחררים את תוכן הגרריר שלהם ובסופו של דבר לבזות. לכן, כדי לשמור על המאפיינים הפונקציונליים של טסיות שלמות, חשוב לשמור על השקט טסיות בזמן הבידוד. פרוטוקולים מספר תיארו בידוד של טסיות מן האדם, כלב, עכברוש, והפרימטים לא אנושיים על ידי שיטות שונות1,10,11,12. חלק מהשיטות דורשות שלבים מרובים כגון אוסף של פלזמה עשיר טסיות ידי צנטריפוגה, סינון על ידי הפרדת הטור, מבחר שלילי של טסיות עם הנוגדן הספציפי RBC-ו-WBC-מצוייחים לחרוזים מגנטיים, וכן הלאה, אשר זמן רב ועלול לבזות את הטסיות ואת תוכנם.
פורד ועמיתיו תיאר לטיהור טסיות דם אנושי באמצעות iohexol בינוני11. שיטה זו משתמשת בכמות דומה של דגימת דם ובינונית במהלך הטיהור. מאז בני האדם להניב נפח גבוה יותר של דם, קל יחסית לטהר את טסיות.
Iohexol היא צפיפות אוניברסלית מעבר הדרגתי בינונית, כי הוא מסיסים באופן חופשי במים ומשמש השבר של חומצות גרעין, חלבונים, פוליסכרידים, ו נוקלאופרוטאינים13,14. יש לו אוסמאליות נמוכה והוא לא רעיל, ובכך הופך אותו למדיום אידיאלי לטיהור של תאים חיים שלמים11. זהו מדיום שאינו חלקיקי; לפיכך, ניתן לקבוע את התפלגות התאים במעבר צבע באמצעות הומוציטומטר, הזרמת cytom, או ספקטרוסקופיה. היא אינה מפריעה לרוב התגובה האנזימטית או הכימית של התאים או החלקים הסלולריים לאחר דילול.
העכבר משמש מודל חשוב בעלי חיים עבור מחלות אנושיות רבות15,16,17,18. יש כמה מאמרים שפורסמו שמתארים טיהור של טסיות העכבר19,20. עם זאת, העכבר מניב נפח קטן יחסית של דם, מה שמקשה על טיהור טסיות. אם נעשה שימוש באותו כמות קטנה של בינוני ודגימות דם, שכבת הטסיות לא יכולה להיות מופרדת בבירור משכבת ה-RBC-WBC לאחר צנטריפוגה. במאמר זה, תיארנו שיטה מהירה ופשוטה של טיהור העכבר טסיות עם שלושה קיפול מעבר מדרגה גבוהה יותר בינונית ביחס לנפח דגימת הדם ומהירות נמוכה צנטריפוגה. בנוסף, הפעלנו את טסיות הדם הטהורה עם התרומבין וחקרו את איכותם בעזרת cy, והמיקרוסקופיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>17-0626-82</td>
			<td>Platelets activation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-166</td>
			<td>Tube for centifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS DIVA software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Tubes for flow cytomtery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Ingredient for staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat anti-mouse CD41</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553848</td>
			<td>Platelets marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo, Inc.</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-34-0001</td>
			<td>Prevent platelet clot formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit Capillary tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>Blood collection capillary tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Blood cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td>Cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Use to Anesthetize mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Olympus CKX41)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz (Histodenz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td>Gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE rat anti-mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561087</td>
			<td>WBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557853</td>
			<td>RBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 200 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-1A</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 1000 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-2C</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffured saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td>Buffer for washing and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Physiological saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-688-26</td>
			<td>Anti-coagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Wash and dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>Swinging bucket rotor centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Enzyme Research Laboratoty</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td>Platelet activation agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td>Buffer for Nycodenz medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of platelets from mouse blood

טסיות מטוהרים מדם שלם כדי ללמוד את המאפיינים הפונקציונליים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מתאי דם אדומים (RBC), כדוריות דם לבנות (WBC), וחלבונים פלזמה. אנו מתארים כאן טיהור של טסיות מתוך דם העכבר באמצעות שלושה מקפלים יותר מעבר מדרגה בינונית ביחס לנפח דגימת דם ו צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. ההתאוששות/תשואה של טסיות מטוהר היו 18.2-38.5%, ואת טסיות מטוהר היו במצב מנוחה, אשר לא מכילים כל מספר משמעותי של RBC ו-WBC. טסיות מטוהרים מטופלים עם תרומבין הגיע עד 93% הפעלה, המציין את הכדאיות שלהם. אנו מאשרים כי טסיות מטוהר הם טהורים מספיק באמצעות cytometric זרימה הערכה מיקרוסקופית. טסיות אלה ניתן להשתמש עבור ביטוי גנים, הפעלה, שחרור גרגר עושה מצבור, הדבקה assays. שיטה זו ניתן להשתמש לטיהור של טסיות מדם של מינים אחרים, כמו גם.

סיכום של טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה (איור 1). השלבים כוללים אוסף של דם מהעכבר באמצעות מסלולית רטרו בנוכחות של נוגד קרישה, תוספת של דגימת דם על בינוני הדרגתי iohexol, צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. האיכות של טסיות מטוהר הוערך עם מיקרוסקופ וזרימה cy, ...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Platelets from Mouse Blood at JoVE.com

Purification of Platelets from Mouse Blood

כאן, דמו של העכבר נאסף. בנוכחות אנטי-מקריש טסיות היו מטוהרים על ידי המדיום iohexol באמצעות מהירות נמוכה צנטריפוגה. טסיות הדם הופעלו עם תרומבין. כדי לחקור אם הם היו מעשי האיכות של טסיות מטוהר נותחו על ידי cy, מיקרוסקופ זרימה.

טיהור של טסיות מתוך דם העכבר

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

טסיות דם צריכות להיות חופשיות מתאים וחלבונים בחקר תכונותיהם הביוכימיות והפיזיולוגיות. לכן, פיתחנו פרוטוקול לטיהור טסיות דם מדם העכבר. טכניקה זו יכולה לטהר טסיות דם באמצעות iohexol הדרגתי בינוני ומהירות נמוכה צנטריפוגה, וכתוצאה מכך הפרדה ברורה של טסיות דם מרכיבי דם אחרים.כדי לטהר את טסיות הדם, השתמש בקצה פיפטה רחב נשא לשכבה 200 microliters של דם שלם שנקטף טרי לאט בצד של צינור 1.5 מיליליטר על 600 microliters של מדיום שיפוע iohexol ללא ערבוב. לאחר צנטריפוגה רוטור מתנדנד דלי כדי לבודד את טסיות הדם, להשתמש טיפ פיפטה רחב נשא חדש כדי לאסוף את רוב השכבה עשיר טסיות דם וחלק קטן של שכבת טסיות דם עניים מבלי לשאוף את תא הדם הלבן או שכבת תא הדם האדום. מוסיפים את דגימת טסיות הדם לצינור חדש, ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS לטסיות הדם.מערבבים את טסיות הדם על ידי היפוך לפני ביצוע צנטריפוגה נוספת. ואז תן שימוש חוזר את גלולה ב 200 microliters של PBS עם צינורות קלים. להפעלת טסיות דם, להעביר אחד עד פעמיים 10 לשש טסיות דם לצינור חדש המכיל 100 microliters של חיץ כתמים.הוסף אחד עד פעמיים 10 לשש טסיות הדם לצינור אחר המכיל 100 מיקרוליטרים של חיץ כתמים בתוספת פפטיד GPRP 0.4 מילימולר. מוסיפים את הטרומבין לצינור עם הפפטיד GPRP כדי להפעיל את טסיות הדם, ומוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המעניין את שני הצינורות. כשליטה חיובית, להוסיף microliter אחד של דם שלם עד 100 microliters של חיץ כתמים בצינור המכיל פפטיד GPRP 0.4 מילימולר, ולהוסיף טרומבין כדי להפעיל טסיות אלה.כבקרה שלילית, יש להוסיף מיקרוליטר אחד של דם שלם ב-100 מיקרוליטרים של חוצץ כתמים. ואז להכתים את שני צינורות הבקרה עם קוקטייל הנוגדנים. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של חיץ כתמים טריים לכל צינור.תן שימוש חוזר לכדורים ב-300 מיקרוליטרים של חיץ כתמים טרי. ואז להעביר את דגימות התא לתוך צינורות ניתוח ציטומטריה זרימה בודדים מוגנים מפני אור. כדי לנתח את טסיות הדם לפי ציטומטריית זרימה, צור ניסוי חדש וצור פיזור קדמי לוגריתמי לעומת חלקות נקודה של פיזור צד לוגריתמי.לאחר התאמת המתחים לפי הצורך, רשום את התאים המוכתמים בצבע יחיד עבור פקדי הפיצוי. עכשיו להפעיל את מדגם השליטה החיובית כדי לרכוש מספיק תאים כדי להתאים את הפיצוי ואת השערים. לאחר מכן לרכוש ולהקליט 100, 000 אירועים עבור כל דגימת דם שלמה, ולנתח את נתוני cytometry זרימה באמצעות חלקות ושערים המתאימים.אם הדם מתווסף למדיום לאט, מדיום שיפוע iohexol ואת דגימת הדם יהיה ליצור שתי שכבות נפרדות בצינור. לאחר הצנטריפוגה, השכבה העליונה בצבע קש מכילה את הפלזמה אך ללא תאי דם שלמים. השכבה השנייה, לבנוויטית ועשירה בטסיות דם, מכילה את רוב טסיות הדם.השכבה השלישית השקופה היא שכבת טסיות הדם הירודה והיא נמצאת ישירות מעל תא הדם האדום וכדור תאי הדם הלבנים. דם שלם מציג אוכלוסיות שונות של תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם על פיזור לוגריתמי קדימה לעומת חלקת נקודה של פיזור צד. טסיות דם מטוהרות, לעומת זאת, להפגין אוכלוסייה ברורה עם מספרים זניחים של תאי דם אדומים או לבנים.דגימות דם שלמות מכילות תאי דם אדומים חיוביים Ter119 ואוכלוסיות תאי דם לבנים חיוביים CD45 שכמעט נעדרים בדגימות טסיות מטוהרות. טסיות דם מטוהרות שלא טופלו אינן מבטאות כמעט סמני הפעלה המאשרים את מצב המנוחה שלהם, בעוד טסיות דם מטוהרות שטופלו בטרומבין מדגימות בדרך כלל ביטוי של 71%P-selectin. הערכה מיקרוסקופית של דגימות טסיות דם מטוהרות לא מטופלות אינה מגלה צבירת טסיות דם.לאחר ההפעלה עם טרומבין, עם זאת, טסיות הדם להפגין צבירה חזקה, עוד יותר המאשר את הכדאיות שלהם לאחר טיהור כפי שהוכח. שכבת דגימת הדם בזהירות על מדיום iohexol, וכאשר אוספים את טסיות הדם, הקפד שאפו בזהירות כדי לא לאסוף את תא הדם האדום ואת שכבות תאי הדם הלבנים לטיהור טסיות דם מוצלח. שיטה זו יכולה לשמש לטיהור טסיות דם ממינים אחרים גם כן.טסיות הדם המטוהרות יכולות לשמש להבעת גנים, הפעלה, צבירה, שחרור גרנולים ולימודי הידבקות.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...