Name: purification of platelets from mouse blood
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Platelets from Mouse Blood at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en oppstart finansiering av Cincinnati Children ' s Research Foundation og et universitet i Cincinnati pilot translational stipend til M.N. Vi vil gjerne takke Cincinnati Children ' s Hospital Research Flow flowcytometri Core for sine tjenester.

Mouse blod samling bør gjennomføres med riktig institusjonelle dyr omsorg og bruk komité godkjenning.
Merk: Blodplate rense protokollen er beskrevet i et strømnings skjema i figur 1.
1. innsamling av blod
<ol><li>Tilsett 25 μL av 3,2% natrium citrate (pH 7,2) som en anti-koagulere og 0,4 mM Gly-Pro-ARG-Pro (GPRP) i et polypropylen rør.</li>
	<li>
Samle inn omtrent 200 μL av blod fra C57BL/6-musen ved hj...

<ol>
	<li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation.">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li><li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte:+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation.">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li><li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+signaling+cells+in+the+immune+continuum.">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li><li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+platelets+and+PBMC:+New+evidence+in+wound+healing.">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li><li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall.">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li><li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets'+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock.">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li><li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis.">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li><li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+&amp;#34;first+responders&amp;#34;+in+wound+response,+cancer,+and+metastasis.">Platelet &amp;#34;first responders&amp;#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li><li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection.">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li><li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood.">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).</li><li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new,+rapid,+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood.">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li><li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo.">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li><li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nycodenz:+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium.">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li><li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge.">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li><li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice.">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function.">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li><li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease.">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li><li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic/severe+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li><li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection,+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide.">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li><li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+murine+platelet+structure,+function,+assays,+and+genetic+alterations.">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li><li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway.">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li></ol>

Vanligvis er blodplater isolert med lav hastighet sentrifugering som gir blodplater rik plasma som inneholder et betydelig antall blodlegemer, cellulære rusk, og plasmaproteiner som kan forstyrre de biokjemiske og fysiologiske analyser og behov ytterligere rensing21. Derfor er det viktig å bruke en rask og enkel metode som kan gi rene blodplater uten store forurensninger. Protokollen som presenteres her beskriver rensing av blodplater fra mus blod ved hjelp av en gradient medium med lav hastighe...

Blodplater er en del av blodet som fungerer som en initiativtaker til blodpropp som svar på skade i blodkaret. De samles på stedet av skade for å plugge fartøyet veggen1. Blodplater er anucleate fragmenter som stammer fra megakaryocytter av benmargen under påvirkning av thrombopoietin og angi sirkulasjon2. De regnes som metabolically aktiv og i stand til sensing ekstracellulære miljø ved å aktivere intracellulære signalering kaskader som resulterer i blodplater sprer seg, aggregering, og hemostatic plug formasjon1,3. Foruten hemostase/trombose og sår helbredelse4, blodplater spille en viktig rolle i Host inflammatoriske responser, angiogenese, ogmetastatis 3,5,6,7, 8i den.
Blodplater er renset fra blodet til å studere sine biokjemiske og fysiologiske egenskaper, som skal være fri for andre blodkomponenter. Siden røde blodlegemer (RBC) og hvite blodlegemer (WBC) inneholder betydelig mer RNA og proteiner enn blodplater9,10, kan tilstedeværelsen av selv et lite antall av disse cellene forstyrre transcriptomic og Proteomikk analyser av RNA og proteiner avledet fra blodplater. Vi fant at renset blodplater aktivert med trombin bind antistoff som anti-GPIIb/IIIa (JON/A) og anti-P-selectin mer effektivt enn hele blodplater.
Siden blodplater er skjøre, er det viktig å behandle prøvene så mildt som mulig. Hvis blodplatene er aktivert, slipper de sitt granule innhold og til slutt brytes ned. Derfor, for å holde blodplater funksjonelle egenskaper intakt, er det viktig å opprettholde blodplate fredfulle omgivelser under isolasjon. Flere protokoller har beskrevet isolering av blodplater fra menneske, hund, rotte, og ikke-menneskelige primater av ulike metoder1,10,11,12. Noen av metodene krever flere trinn som for eksempel innsamling av blodplater-rik plasma av sentrifugering, filtrering av separasjon kolonne, negativt utvalg av blodplater med RBC-og WBC-spesifikke antistoff bøyd til magnetiske perler, og så videre, som er tidkrevende og kan svekke blodplater og deres innhold.
Ford og kollegene hans beskrev blodplate rensing fra humant blod ved hjelp av iohexol medium11. Denne metoden bruker et lignende volum av blodprøve og medium under rensing. Siden mennesker gir et høyere volum av blod, er det relativt lett å rense blodplater.
Iohexol er en Universal Density gradient inert medium som er fritt oppløselig i vann og brukes i fraksjonering av nukleinsyre syrer, proteiner, polysakkarider, og nucleoproteins13,14. Det har lav osmolalitet og er ikke giftig, og dermed gjør det til et ideelt medium for rensing av intakt levende celler11. Det er et ikke-partikkel medium; fordelingen av celler i en gradering kan derfor bestemmes ved hjelp av hemocytometer, flyt flowcytometer eller spektrofotometer. Det forstyrrer ikke det meste av enzymatisk eller kjemisk reaksjon av cellene eller cellulære fragmenter etter fortynning.
Musa fungerer som en viktig dyremodell for mange menneskelige sykdommer15,16,17,18. Det er noen publiserte artikler som beskriver rensing av musen blodplater19,20. Men musen gir et relativt mindre volum av blod, noe som gjør det vanskelig å rense blodplater. Hvis det samme lille volumet av gradient medium og blodprøver er brukt, kan blodplater laget ikke klart skilles fra RBC-WBC lag etter sentrifugering. I denne artikkelen har vi beskrevet en rask og enkel metode for mus blodplater rensing med tre ganger mer iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volum og lav hastighet sentrifugering. Vi har også aktivert renset blodplater med trombin og undersøkt deres kvalitet med Flow flowcytometri og mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>17-0626-82</td>
			<td>Platelets activation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-166</td>
			<td>Tube for centifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS DIVA software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Tubes for flow cytomtery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Ingredient for staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat anti-mouse CD41</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553848</td>
			<td>Platelets marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo, Inc.</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-34-0001</td>
			<td>Prevent platelet clot formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit Capillary tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>Blood collection capillary tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Blood cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td>Cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Use to Anesthetize mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Olympus CKX41)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz (Histodenz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td>Gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE rat anti-mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561087</td>
			<td>WBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557853</td>
			<td>RBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 200 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-1A</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 1000 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-2C</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffured saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td>Buffer for washing and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Physiological saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-688-26</td>
			<td>Anti-coagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Wash and dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>Swinging bucket rotor centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Enzyme Research Laboratoty</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td>Platelet activation agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td>Buffer for Nycodenz medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of platelets from mouse blood

Blodplater er renset fra hele blodet til å studere deres funksjonelle egenskaper, som bør være fri fra røde blodlegemer (RBC), hvite blodlegemer (WBC), og plasmaproteiner. Vi beskriver her rensing av blodplater fra mus blod ved hjelp av tre-fold mer iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volum og sentrifugering i en svingende bøtte rotoren på 400 x g for 20 min ved 20 ° c. Utvinningen/utbyttet av renset blodplater var 18.2-38.5%, og renset blodplater var i hviletilstand, som ikke inneholder noen betydelig antall RBC og WBC. De renset blodplater behandlet med trombin viste opp til 93% aktivisering, indikerer deres levedyktighet. Vi har bekreftet at de renset blodplatene er tilstrekkelig rene ved bruk av strømnings analytiske og mikroskopisk evaluering. Disse blodplater kan brukes til genuttrykk, aktivisering, granule utgivelse, aggregering, og vedheft analyser. Denne metoden kan brukes for rensing av blodplater fra blodet til andre arter også.

Sammendraget av plate rensing er beskrevet i et strømnings skjema (figur 1). Trinn inkluderer innsamling av blod fra mus ved hjelp av retro-orbital blødning i nærvær av en antikoagulerende, tillegg av blodprøve på iohexol gradient medium, sentrifugering i en svingende bøtte rotor på 400 x g for 20 min ved 20 ° c. Kvaliteten på de renset blodplatene ble evaluert med mikroskopi og Flow flowcytometri etter farging med antistoff for å oppdage eventuelle forurensende celler og...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Platelets from Mouse Blood at JoVE.com

Purification of Platelets from Mouse Blood

Her ble mus blod samlet i nærvær av en anti-koagulere. Blodplatene ble renset ved iohexol gradient medium ved hjelp av lav hastighet sentrifugering. Blodplatene ble aktivert med trombin for å undersøke om de var levedyktige. Kvaliteten på de renset blodplatene ble analysert av Flow flowcytometri og mikroskopi.

Rensing av blodplater fra mus Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Blodplater skal være fri for blodceller og proteiner når de studerer deres biokjemiske og fysiologiske egenskaper. Derfor har vi utviklet en protokoll for å rense blodplater fra museblod. Denne teknikken kan rense blodplater ved hjelp av iohexol gradient medium og lav hastighet sentrifugering, noe som resulterer i en klar separasjon av blodplater fra andre blodkomponenter.For å rense blodplatene, bruk en bredstagende pipettespiss til lag 200 mikroliter med nyhøstet fullblod sakte ned på siden av et 1,5-milliliter rør på 600 mikroliter i iohexol gradient medium uten blanding. Etter sentrifugering i en svingende bøtterotor for å isolere blodplatene, bruk en ny bredståret pipettespiss til å samle det meste av blodplaterike laget og en liten brøkdel av blodplatefattig lag uten å aspirere hvite blodlegemer eller røde blodlegemer. Tilsett blodplateprøven til et nytt rør, og tilsett en milliliter PBS til blodplatene.Bland blodplatene ved inversjon før du utfører en ny sentrifugering. Deretter gjenbruker pelleten i 200 mikroliter PBS med mild pipettering. For blodplateaktivering, overfør en til to ganger 10 til de seks blodplatene til et nytt rør som inneholder 100 mikroliter med fargingsbuffer.Legg en til to ganger 10 til de seks blodplatene til et annet rør som inneholder 100 mikroliter med fargebuffer supplert med 0,4-millimolar GPRP peptid. Tilsett trombin i røret med GPRP peptid for å aktivere blodplatene, og legg til antistoffcocktailen av interesse for begge rørene. Som en positiv kontroll, tilsett en mikroliter fullblod i opptil 100 mikroliter flekker av farging buffer i et rør som inneholder 0,4-millimolar GPRP peptid, og tilsett trombin for å aktivere disse blodplater.Som en negativ kontroll, legg til en mikroliter fullblod i opptil 100 mikroliter med fargingsbuffer. Deretter flekker begge kontrollrørene med antistoffcocktailen. Etter 30 minutter ved romtemperatur i mørket, vask prøvene med en milliliter frisk fargingsbuffer per rør.Resuspend pellets i 300 mikroliter av frisk farging buffer. Deretter overfører celleprøvene til individuelle strømningscytometrianalyserør beskyttet mot lys. Hvis du vil analysere blodplatene etter flowcytometri, oppretter du et nytt eksperiment og genererer logaritmisk fremoverspøs punktet kontra logaritmisk sidespøpunktpunktplott.Etter å ha justert spenningene etter behov, registrerer du de fargefargede cellene for kompensasjonskontrollene. Kjør nå den positive kontrollprøven for å skaffe nok celler til å justere kompensasjonen og portene. Deretter innhente og registrere 100.000 hendelser for hver hele blodprøve, og analysere flytcytometri data ved hjelp av de riktige tomter og porter.Hvis blodet tilsettes på mediet sakte, vil iohexol gradient medium og blodprøven danne to separate lag i røret. Etter sentrifugering inneholder det øverste, halmfargede laget plasmaet, men ingen intakte blodceller. Det andre, hvite, blodplaterike laget inneholder de fleste blodplater.Det tredje, gjennomsiktige laget er blodplatefattig lag og er rett over røde blodlegemer og hvite blodlegemerpellet. Fullblod viser forskjellige populasjoner av røde blodlegemer, hvite blodlegemer og blodplater på en logaritmisk fremover scatter versus side scatter dot plot. Rensede blodplater viser imidlertid en distinkt populasjon med ubetydelig antall røde eller hvite blodlegemer.Fullblodsprøver inneholder Ter119-positive røde blodlegemer og CD45-positive hvite blodlegemer som er nesten fraværende i rensede blodplateprøver. Ubehandlede rensede blodplater uttrykker nesten ingen aktiveringsmarkører som bekrefter hviletilstanden, mens rensede trombinbehandlede blodplater vanligvis viser et 71 % P-selectin-uttrykk. Mikroskopisk evaluering av ubehandlede rensede blodplateprøver avslører ingen blodplateaggregering.Etter aktivering med trombin viser blodplatene imidlertid en robust aggregering, noe som ytterligere bekrefter deres levedyktighet etter rensing som vist. Lag blodprøven forsiktig på iohexol-mediet, og når du samler blodplatene, sørg for å aspirere forsiktig som å ikke samle inn røde blodlegemer og hvite blodlegemer lag for vellykket blodplaterensing. Denne metoden kan også brukes til blodplaterensing fra andre arter.De rensede blodplatene kan brukes til genuttrykk, aktivering, aggregering, granulatutgivelse og vedheftsstudier.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og rensing av kinesin fra Drosophila Embryoer

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Rensing og microRNA Profilering av Exosomes Avledet fra Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Celleoverflaten Marker Mediert Rensing av iPS Cell Intermediates fra en reprogrammable Mouse Model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...