Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

وقد دعمت هذا العمل الجمعية اليابانية لتعزيز العلم (رقم المنحة 16K15860 و19K10471 إلى T.M., 17K12032 to M.I., and 18K09926 to N.H.) ومؤسسة SECOM للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة 2018.09.10 No. 1).

ملاحظة: يجب إكمال توليد S. mutans ‹gtfC، الذي يتم استبدال منطقة الترميز بأكملها من الجين gt fC مع sPCr، قبل تنفيذ هذه البروتوكولات. راجع المقالة المنشورة للحصول على تفاصيل حول الجيل5.
1. تصميم التمهيدي 2.
<ol><li>
إعداد التمهيديات لبناء ...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

تصميم التمهيديات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. تم تحديد تسلسل gtfC-عكس وSPCR-إلى الأمام التمهيديات تلقائيا على أساس تسلسل كل من منطقة نهاية 3′ من GTFC والمنطقة نهاية 5′ من sPCr. كل التمهيدي يتضمن 24 قواعد تكميلية التي ترميز رابط GS وتسلسل له العلامة الترميز في ...

وعادة ما ينطوي تحليل وظيفة الجين على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات البرية بالسلالات التي تعطل فيها جين الفائدة. وبمجرد إنتاج السلالة التي تعطلت الجينات، فإن الإضافة الخارجية للمنتج الجيني تسمح باستعادة وظيفية.
الطريقة الأكثر شيوعا للحصول على منتجات الجينات النقية اللازمة لتجارب الترميم اللاحقة هي عن طريق أداء التعبير غير المتجانس في الإشريكية القولونية1. ومع ذلك، فإن التعبير عن بروتينات الغشاء أو البروتينات الكتلية العالية غالبا ما يكون من الصعب استخدام هذا النظام1. في هذه الحالات، عادة ما يتم عزل البروتين المستهدف من الخلايا التي تجمع البروتين أصلا من خلال سلسلة معقدة من الخطوات، والتي قد تؤدي إلى فقدان المنتج الجيني. للتغلب على هذه القضايا، تم تطوير إجراء بسيط لتنقية المنتجات الجينية بعد طريقة تعطيل الجينات2،طريقة ربط الحمض النووي المستندة إلى PCR3 (المعينة ثنائي ونفي من خطوتين PCR)، والكهرباء للجينات التحول في موتات العقدية. إضافة علامة polyhistidine (له العلامة) إلى C-terminus من المنتج الجيني يسهل تنقية من قبل الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).
لعزل سلالة التعبير عن علاماته، يتم استبدال الحمض النووي الجينومي الكامل للجين موضع الاهتمام (في هذه السلالة التي تعبر عن الجينات التي تم التعبير عنها) بجين علامة مقاوم للمضادات الحيوية. إجراء لتوليد سلالة له العلامة التعبير عن متطابقة تقريبا لتلك التي لتوليد سلالة الجينات تعطل كما هو موضح سابقا4,5. ولذلك، ينبغي تنفيذ أساليب تعطيل الجينات وعزل المنتجات الجينية كتجارب متسلسلة للتحليل الوظيفي.
في العمل الحالي، يتم إرفاق تسلسل الترميز polyhistidine إلى نهاية 3′ من gtfC (GenBank locus tag SMU_1005) الجينات، ترميز غلوكوزيلترانسفيراز-SI (GTF-SI) في S. mutans6. ثم أجريت دراسات التعبير في الأنواع العقدية. تحقيق التعبير gt fC غير متجانسة من قبل E. القولونية من الصعب، على الأرجح بسبب الكتلة الجزيئية العالية من GTF-SI. هذه السلالة تدعى س. موتانس له-gtfC. رسم تخطيطي يصور تنظيم GTFC وspectinomycin كاسيت الجينات المقاومة(sPCr)7 loci في البرية من نوع S. mutans (S. mutans WT) وتظهر مشتقاته في الشكل 1 وGTF-SI هو بروتين إفرازي الذي يساهم في تطوير biofilm الأسنان المسببة للسرطان6. تحت وجود السكروز، لوحظ biofilm الملتصق على سطح زجاجي أملس في سلالة WT S. mutans ولكن ليس في سلالة S. mutans gtfC-disrupted(S. mutans ΔgtfC)2،5 . يتم استعادة تشكيل Biofilm في S. mutans ΔgtfC على إضافة خارجية من GTF-SI المؤتلف. سلالة، S. mutans له-gtfC، ثم يستخدم لإنتاج المؤتلف GTF-SI.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

وينطوي توضيح وظيفة الجين عادة على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات والسلالات البرية التي تعطل فيها جين الفائدة. يتم استعادة فقدان الوظيفة بعد انقطاع الجينات في وقت لاحق عن طريق إضافة خارجية للمنتج من الجين المعطلة. وهذا يساعد على تحديد وظيفة الجين. وتنطوي الطريقة التي سبق وصفها على توليد سلالة موتان العقدية التي تعطلت في الجينات gt. هنا، يتم وصف طريقة لا تتطلب لتنقية المنتج الجيني gtfC من سلالة S. mutans التي تم إنشاؤها حديثا بعد اضطراب الجينات. هو يتضمّن الإضافة من [بولهيستيدين-كدينغ] تسلسل في ال 3′ نهاية من المورثة الفائدة, أيّ يسمح تنقية بسيطة من المورّة منتوج يستعمل محصّلة معدنة تقارب كروماتوغرافيا. لا توجد ردود فعل أنزيمية غير PCR مطلوبة للتعديل الجيني في هذه الطريقة. واستعادة المنتج الجيني عن طريق إضافة خارجية بعد تعطيل الجينات هي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات، والتي يمكن أيضا تكييفها مع الأنواع المختلفة.

ويبين الشكل 3 حجم كل أمبير يكون من ثاني PCR(الشكل 3ألف)وPCR الثاني(الشكل 3B). ويتوافق حجم كل أمبير مع الحجم المتوقع، على النحو المبين في الجدول 1. ويبين الشكل 4A مستعمرات S. mutans التي تحولت مع المنتج PCR ا...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

وصف هنا هو طريقة بسيطة لتنقية منتج الجينات في موتان العقدية. قد تكون هذه التقنية مفيدة في تنقية البروتينات، وخاصة بروتينات الغشاء والبروتينات الكتلية الجزيئية العالية، ويمكن استخدامها مع مختلف الأنواع البكتيرية الأخرى.

تنقية بروتين كتلة جزيئية عالية في موتان العقدية

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة مثل، كيف ينقي منتج الجينات الذي يصعب التعبير عنه في E.Coli. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يوجد تفاعل انزيمي ، بخلاف PCR ، هو الناقل ، ويمكن استخدام التطبيقات الشائعة لتنقية البروتين. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تنقية البروتين في المكورات العقدية المتطاوعة، فإنه يمكن أيضا أن يكون على علم الأنواع الميكروبية الأخرى.وسوف يكون إثبات الإجراء د.ماميكو ياماشيتا، طالب غراد من مختبرنا. بعد تصميم التمهيدي واستخراج الحمض النووي الجينومي من المكورات العقدية المتطاومة، تنفيذ PCR الأولى باستخدام المكورات العقدية البرية من النوع المتطاول وGFC تعطيل المكورات العقدية الطفرات الجينوم كقوالب PCR. تضخيم المناطق التي تؤوي الجزء المصب من جين gtfC وتلك التي تؤوي جين المقاومة spectinomycin باستخدام إعداد gtfC إلى الأمام واعكس التمهيدي وspc r إلى الأمام والمراحل العكسية.ثم، electrophorese كل منتج PCR على 1٪ agarose هلام. استخدام الهلام bandcutter لاستخراج شظايا الحمض النووي المطلوب من ما يقرب من 1،000 أزواج قاعدة و 2،000 أزواج قاعدة من هلام إلى أنابيب microcentrifuge. إضافة 500 ميكرولترات من العازلة solubilizing في كل أنبوب واحتضان لهم لمدة 10 دقيقة في 56 درجة مئوية لإذابة شرائح هلام.تنقية الشظايا باستخدام السيليكا الغشاء القائم على طريقة استخراج هلام. تنفيذ PCR الثاني باستخدام منتجات PCR الأول كقوالب PCR مع التمهيديات المتداخلة إلى الأمام وتكتل عكس. عندما لا يمكن تأكيد المنتج PCR الثاني بواسطة electrophoresis، يجب تصميم زوج التمهيدي متداخلة آخر.الكهرباء خمسة ميكروليترات من خليط PCR على هلام agarose. تأكيد توليد أمبيركون المناسبة من حوالي 3،000 أزواج قاعدة بواسطة ethidium بروميد هلام تلطيخ صورة والمضي قدما وفقا للمخطوطة. الآن، مزيج خمسة ميكرولترات من المنتج PCR الثاني المركزة إلى aloquot 50 ميكرولتر من الجليد الباردة، المختصة البرية من النوع العقديات الخلايا المتنية، المجمدة سابقا.يُضاف الخليط إلى الكوفيت الكهربائي ثم نضع الكوفيت في غرفة cuvette في جهاز الإلكتروبوريشن. إعطاء نبضة كهربائية واحدة من 1.8 كيلوفولت، 600 أوم، و 10 microfarads لمدة 2.5 مللي ثانية إلى الخلايا. إضافة 500 ميكرولترات من مرق ضخ الدماغ والقلب في cuvette.انتشرت على الفور 10 إلى 100 ميكرولترات من التعليق على الدماغ القلب ضخ لوحات أوبر التي تحتوي على سبكتينوميسين. احتضان لوحات لمدة يومين إلى ستة أيام في 37 درجة مئوية حتى المستعمرات نمت بما فيه الكفاية ليتم التقاطها. بعد جيل من المكورات العقدية المتطاولة تسلسل الترميز polyhistidine أدرجت سلالة والتلقح بين عشية وضحاها دون spectinomycin وفقا للمخطوطة، الطرد المركزي تعليق الثقافة البكتيرية لمدة 20 دقيقة في 10،000 مرات ز في أربع درجات مئوية.نقل الثقافة فائقة إلى كوب زجاجي ثلاثة لتر. لتركيز البروتينات من عظمى الثقافة، ضع السوبر لترين على مُحرك مغناطيسي وابدأ في التحريك القوي. إضافة 1، 122 غراما من كبريتات الأمونيوم والسماح للترسب لتشكيل مع اثارة قوية في أربع درجات مئوية على مدى فترة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها. التالي.أجهزة الطرد المركزي كبريتات الأمونيوم عجلت في 15، 000 مرات ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. اِنّهُ المُنَاَعِيّ. مع ملعقة، وجمع الترسب ونقله إلى كوب زجاجي 200 ملليلتر.resuspend الكريات في 35 ملليلتر من العازلة ملزمة. ثم, نقل كل ما يقرب من 25 ملليلتر من التعليق في أنابيب غسيل الكلى السليلوز مجددة. ضع أنابيب غسيل الكلى في 2.5 لتر من الحاجز الربط التحريك على مُحرك في أربع درجات مئوية لـ dialyze التعليق.استبدل محلول غسيل الكلى بعد ساعتين، وتواصل غسيل الكلى طوال الليل. نقل المقبل تعليق dialyzed من أنابيب إلى أنابيب الطرد المركزي ووضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي في 20،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. مع قسم الترشيح المعدات، صب سوبرنات على 0.2 ميكرومتر مرشح غشاء لتصفية.نقل الترشيح إلى قارورة 75 ملليلتر. لكسر gtfSI الموسومة ببولي هيستيدين من التعليق المرشّح، قم أولاً بإعداد كروماتوغرافيا معدنية غير ثابتة. بعد اكويفيرتينج الراتنج وفقا للمخطوطة، أغلق ديك قرصة هوفمان.إضافة خمسة ملليلتر من التعليق الذي تمت تصفيته في العمود لجعل الطين. ثم، نقل كل الطين إلى التعليق المتبقية المصفاة ودوامة الخليط بلطف لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. قم بتحميل الخليط مرة أخرى إلى العمود.فتح ديك قرصة هوفمان لإزالة تعليق من تدفق الجاذبية. غسل راتنج IMAC مع 20 ملليلتر من العازلة ملزمة ومن ثم، elute 20 ملليلتر من عازلة elution للحصول على gtfSI المؤتلف. بعد ذلك، تحميل eluate في أنبوب الترشيح فائقة الطرد المركزي والطرد المركزي الحل في 2، 000 مرات ز لمدة دقيقة إلى خمس دقائق لتركيز الحل.إفراغ حاوية الترشيح وإضافة 15 ملليلتر من المخزن المؤقت في أنبوب. الطرد المركزي العينة مرة أخرى، وتكرار العملية مرتين إضافية. وأخيراً يتركز الحل gtfSI المؤتلف إلى ما يقرب من ملليلتر واحد.نقل التركيز إلى أنبوب microcentrifuge وتخزينها في أربع درجات مئوية. متابعة مع بقية بروتوكول استعادة وظيفية. في هذا البروتوكول، يظهر الـ agarose gel electrophoresis أن حجم كل أمبيركون من PCR الأول والثاني PCR يتوافق مع الحجم المتوقع.تم تحويل مستعمرات المكورات العقدية مع المنتج PCR الثاني ومطلية على لوحات أوجر ضخ الدماغ والقلب التي تحتوي على سبتينوميسين. تظهر منتجات PCR مستعمرة تشغيل على هلام agarose أن كل أمبيركون كان من الحجم المتوقع. وقد لوحظ البروتين المنقى مع الكروماتوغرافيا تقارب المعادن غير المُشلَّم كقناة واحدة بواسطة SDS-PAGE.وأكدت البقعة الغربية، التي أجريت باستخدام الأجسام المضادة للبوليهيستادين، أن النطاق المرصود هو البروتين الموسوم بالبولي هيستيدين المتوقع البالغ 160 كيلودالطن. وقد شوهد فقط القدرة على تشكيل بيو فيلم مشتق من السكروز مع المكورات العقدية المتواطن البرية من النوع والcoccus العقدية الطفرات His-gtfC، والتي شكلت بيو فيلم مُلتمس على جدار الأنبوب في وجود 1٪sucrose. ولم يلاحظ ذلك في المكورات العقدية المتطاة دلتا gtfC.ومع ذلك ، فإن إضافة 25 ميكروغرام من gtfSI المؤتلف أعاد القدرة على تكوين بيو فيلم في العقديات المتوات دلتا gtfC. منذ نجاح هذه الطريقة يعتمد على تضخيم PCR الثاني، يجب تأكيد المنتج PCR الثاني بواسطة الكهرباء. بالفعل، البروتين من نوع الهستيدين التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة هو أيضا الدعوة إلى الأحماض الوظيفية، مثل البروتين البروتين التفاعلات.بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية ، بالاشتراك مع اضطراب الجينات ، الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف وظيفة الجينات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط ​​الفرعية صورة مقطعية

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em&gt; بيركولديريا</em&gt; الأنواع

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; استخدام الأصباغ نيون

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

واحد خطوة السلبية الكروماتوغرافي تنقية<em&gt; هيليكوباكتر بيلوري</em&gt; بروتين العدلات، تفعيل Overexpressed في<em&gt; كولاي</em&gt; في دفعة واسطة

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...