Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) (Grant numre 16K15860 og 19K10471 til T. M., 17K12032 til M. I. og 18K09926 til N. H.) og SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (tilskudsnummer 2018.09.10 nr. 1).

Bemærk: Generation af S. mutans ∆gtfc, hvor hele kodnings området for gtfc -genet erstattes med SPCr, skal være afsluttet, inden disse protokoller udføres. Se den publicerede artikel for detaljer om generation5.
1. primer design
<ol><li>
Forbered primere til opførelse af S. mutans hans-gtfc. Bemærk: De primer-sekvenser, der anvendes i denne pr...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

Design af primere er det mest kritiske skridt i protokollen. Sekvenserne af gtfc-reverse og SPCr-Forward primere blev automatisk fastlagt ud fra sekvenserne af både 3 ′ end-regionen gtfc og 5 ′ end-regionen i SPCr. Hver primer indeholder 24 komplementære baser, der indkoder en GS linker og en hans-tag-kodning sekvens i deres 5 ' regioner. Afbrydelse af de oprindelige lovgivningsmæssige sekvenser placeret i upstream ledsage regioner kan undgås ved tilsætni...

Analyse af et gene's funktion indebærer normalt sammenligning af fænotypiske træk af vild-type stammer til stammer, hvor genet af interesse er blevet forstyrret. Når den genforstyrrede stamme produceres, giver eksogen tilsætning af genproduktet mulighed for funktionel restaurering.
Den mest almindelige metode til opnåelse af rensede genprodukter, der kræves til efterfølgende restaurerings undersøgelser, er ved at udføre heterologt udtryk i Escherichia coli1. Men, ekspression af membran proteiner eller høj molekylmasse proteiner er ofte svært ved hjælp af dette system1. I disse tilfælde er målproteinet normalt isoleret fra cellerne, der oprindeligt syntetiserer proteinet gennem en kompleks række trin, hvilket kan føre til tab af genproduktet. For at overvinde disse problemer er der blevet udviklet en enkel procedure for genprodukt rensning efter en genafbrydningsmetode2, PCR-baseret DNA-splejsning-metode3 (udpeget to-trins fusions PCR) og elektro portering for genetiske omdannelse i Streptococcus mutans. Tilsætning af et polyhistidintag (hans-tag) til genproduktets C-endestation letter dets rensning ved immobiliseret metalaffinitets kromatografi (IMAC).
For at isolere hans-tag-udtrykke stamme, er hele genomisk DNA af genet af interesse (i denne hans-tag-udtrykker gene-forstyrret stamme) erstattet med et antibiotikum-resistent markør gen. Proceduren for generering af hans-tag-udtrykker Strainer næsten identisk med, at for at generere en gen-forstyrret stamme som beskrevet tidligere4,5. Metoderne til genafbrydelse og isolering af genproduktet bør derfor udføres som serie eksperimenter for den funktionelle analyse.
I det nuværende arbejde, en polyhistidin-kodning sekvens er knyttet til 3 ′ ende af Gtfc (genbank locus tag SMU_1005) gen, kodning glucosyltransferase-si (GTF-SI) i S. mutans6. Derefter blev der udført udtryks studier i en streptokokart. Opnåelse af heterologe Gtfc udtryk ved E. coli er vanskeligt, sandsynligvis på grund af den høje MOLEKYLÆRE masse af GTF-si. Denne stamme hedder S. mutans His-gtfc. En skematisk illustration, der skildrer organiseringen af gtfc -og Spectinomycin-resistens genkassetten (SPCr)7 loci i vildtype S. mutans (s. mutans WT) og derivater heraf er vist i Figur 1. GTF-si er et sekretorisk protein, der bidrager til udviklingen af kariogene Dental biofilm6. Under tilstedeværelse af saccharose observeres en over vedet biofilm på en glat glasoverflade i WT s. mutans stamme, men ikke i s. mutans gtfc-forstyrret stamme (S. mutans Δgtfc)2,5 . Dannelsen af biofilm er genoprettet i S. mutans Δgtfc ved udefrakommende tilsætning af det rekombinante GTF-si. Stammen, S. mutans hans-gtfc, bruges derefter til at producere den rekombinante GTF-si.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

Elucidation af et gens funktion indebærer typisk sammenligning af fænotypiske træk af vildtypestammer og stammer, hvor det gen af interesse er blevet forstyrret. Tab af funktion efter genafbrydelse genoprettes efterfølgende ved eksogen tilsætning af produktet af det afbrudte gen. Dette hjælper med at bestemme funktionen af genet. En tidligere beskrevet metode indebærer at generere en Gtfc -gene-forstyrret Streptococcus mutans stamme. Her beskrives en fordringsløs metode til rensning af Gtfc -genproduktet fra den nyligt genererede S. mutans stamme efter genafbrydelsen. Det indebærer tilsætning af en polyhistidin-kodning sekvens på 3 ′ ende af genet af interesse, som giver mulighed for enkel rensning af genproduktet ved hjælp af immobiliseret metalaffinitets kromatografi. Der kræves ingen andre enzymatiske reaktioner end PCR for den genetiske modifikation i denne metode. Gendannelsen af genproduktet ved udefrakommende tilsætning efter genafbrydelse er en effektiv metode til bestemmelse af genfunktion, som også kan tilpasses forskellige arter.

Figur 3 viser størrelsen af hver amplikonen fra den første PCR (figur 3a) og anden PCR (figur 3b). Størrelsen af hver amplikonen svarede til den forventede størrelse, som beskrevet i tabel 1. Figur 4a viser S. mutans kolonier OMDANNET med det andet PCR produkt og belagt på BHI agar plader indeholdende Spectinomycin. Koloni PCR-produkter ble...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Beskrevet her er en simpel metode til rensning af et genprodukt i Streptococcus mutans. Denne teknik kan være fordelagtig i oprensning af proteiner, især membran proteiner og højmolekylært masse proteiner, og kan anvendes med forskellige andre bakteriearter.

Oprensning af et Højmolekylært masse protein i Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i mikrobiologi området såsom, hvordan et genprodukt, der er vanskeligt at udtrykke i E.Coli renser. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at ingen enzymatisk reaktion, bortset fra PCR, er bæreren, og fælles applikationer til proteinrensning kan anvendes. Selv om denne metode kan give indsigt i proteinrensning i streptokokker mutans, det kan også være en apprised til andre mikrobiota arter.Demonstration af proceduren vil blive Dr.Mamiko Yamashita, en grad studerende fra vores laboratorium. Efter primer design og genomisk DNA ekstraktion fra streptokokker mutans, udføre den første PCR ved hjælp af wild-type streptococcus mutans og GFC forstyrret streptococcus mutans genom som PCR skabeloner. Forstærke de regioner, der huser den nedstrøms del af GTFC-genet, og dem, der huser spectinomycin resistens genet ved hjælp af den forberedte gtfC-forward og omvendt primer og spc r-forward og omvendt primer.Derefter elektroforese hvert PCR produkt på 1% agarose gel. Brug en gel bandcutter til punktafgifter de ønskede DNA fragmenter af ca 1, 000 base par og 2, 000 base par fra gelen i mikrocentrifuge rør. Tilsæt 500 mikroliter af opløsende buffer i hvert rør og inkuber dem i 10 minutter ved 56 grader Celsius for at opløse gelskiverne.Rens fragmenterne ved hjælp af silicamembranbaseret gelekstraktionsmetode. Udfør en anden PCR ved hjælp af produkterne fra den første PCR som PCR-skabeloner med de indlejrede og indlejrede primere. Når det andet PCR-produkt ikke kan bekræftes ved elektroforese, skal der konstrueres et andet indlejret primerpar.elektroforese fem mikroliter af PCR-blandingen på agarosegelen. Bekræft generering af den passende amplicon af ca. 3.000 basispar ved ethidiumbromidsplettende billede og fortsæt i henhold til manuskriptet. Nu blandes fem mikroliter af det koncentrerede andet PCR-produkt til 50-mikroliteralquot iskold, kompetente vilde streptokokker mutan celler, frosset tidligere.Tilsæt blandingen i en elektroporationsknille, og ansættes cuvette i elektroporationsapparatets cuvettekammer. Giv en enkelt elektrisk puls på 1,8 kilovolts, 600 ohm og 10 mikrofarader i 2,5 millisekunder til cellerne. Tilføj 500 mikroliter af hjerne-hjerte infusion bouillon i cuvette.Straks spredes 10 til 100 mikroliter af suspensionen på hjerne-hjerte infusion snegl plader, der indeholder spectinomycin. Inkuber pladerne i to til seks dage ved 37 grader Celsius, indtil kolonierne er vokset tilstrækkeligt til at blive samlet op. Efter generation af streptokokker mutans polyhistidine kodning sekvens indarbejdet stamme og natten inokulering uden spectinomycin i henhold til manuskriptet, centrifuge den bakterielle kultur suspension i 20 minutter ved 10, 000 gange g ved fire grader Celsius.Overfør kultursupernatanten til et tre-liters glasbæger. For at koncentrere proteinerne fra kultursupernatanten skal du placere den to-liters supernatant på en magnetisk omrører og begynde kraftig omrøring. Der tilsættes 1, 122 gram ammoniumsulfat, og bundfaldet dannes med kraftig omrøring ved fire grader Celsius over en fire timers periode eller natten over. Næste.centrifuge den ammoniumsulfatsulferede opløsning ved 15,000 gange g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Dekanter supernatanten. Med en spatel, indsamle bundfald og overføre det til en 200-milliliter glasbæger.Opslæm pellets i 35 milliliter bindende buffer. Derefter overføres hver ca. 25 milliliter af suspensionen til en regenereret cellulosedialyseslange. Anlælsen sættes i 2,5 liter af omrøringsbindende bufferen på en omrører ved fire grader Celsius for at dialysere suspensionen.Dialyseopløsningen skal udskiftes efter to timer, og dialyse fortsættes natten over. Dernæst overføre dialyseret suspension fra slangen til centrifuge rør og placere rørene i centrifugen på 20, 000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Med sektionsfiltreringsudstyr hældes supernatanten over et 0,2-mikrometermembranfilter for at filtrere.Filtratet overføres til en 75-milliliterkolbe. For at fraktionere den polyhistidine-mærkede gtfSI fra filtrated suspension, først forberede en immobiliseret metal affinitet kromatografi. Efter ækvivalens i henhold til manuskriptet lukkes Hoffman pinch-hanen.Der tilsættes fem milliliter den filtrerede suspension i kolonnen for at lave en gylle. Derefter overføres al gyllen til den resterende filtrerede suspension og hvirvle blandingen forsigtigt i 30 minutter ved fire grader Celsius. Læg blandingen tilbage i kolonnen.Åbn Hoffman pinch cock at fjerne suspensionen ved tyngdekraften flow. IMAC-harpiksen vaskes med 20 milliliter bindingsbuffer, og derefter elueres 20 milliliter elutionbuffer for at opnå rekombinant gtfSI. Derefter indlægges eluatet i et centrifugal ultrafiltreringsrør, og opløsningen centrifugeres ved 2.000 gange g i et til fem minutter for at koncentrere opløsningen.Rørbeholderen tømmes, og der tilsættes 15 milliliter opbevaringsbuffer i røret. Centrifuge prøven igen og gentag processen to ekstra gange. Den rekombinant gtfSI-opløsning er endelig koncentreret til ca. 1 milliliter.Overfør koncentratet til et mikrocentrifugerør og opbevares ved fire grader Celsius. Fortsæt med rest functional restoration-protokollen. I denne protokol viser agarosegelelektroforese, at størrelsen af hver amplicon fra den første PCR og den anden PCR svarede til den forventede størrelse.Streptococcus mutans kolonier blev omdannet med det andet PCR produkt og belagt på hjernen-hjerte infusion snegl plader, der indeholder spectinomycin. Colony PCR produkter kører på agarose gel viser, at hver amplicon var af den forventede størrelse. Protein renset med immobiliseret metal affinitetkromatografi blev observeret som et enkelt bånd af SDS-PAGE.Western blot, udført ved hjælp af anti-polyhistidine antistof, bekræftede, at det observerede bånd var det forventede polyhistidine-mærkede protein på 160 kilodaltons. Den saccharose-afledte biofilm danner evne blev kun set med streptococcus mutans wild-type og streptococcus mutans His-gtfC, som dannede en klæbende biofilm på rørvæggen i overværelse af 1% saccharose. Dette blev ikke observeret i streptococcus mutans delta gtfC.Men tilføjelsen af 25 mikrogram af rekombinant gtfSI restaureret den klæbende biofilm dannelse evne i streptococcus mutans delta gtfC. Da denne metodes succes afhænger af den anden PCR-forstærkning, skal det andet PCR-produkt bekræftes af elektroforese. Allerede, histidin-type protein fremstillet ved denne metode er også indkaldelse til funktionelle syrer, såsom protein-protein interaktioner.Efter sin udvikling banede denne teknik, i kombination med genforstyrrelser, vejen for forskere inden for mikrobiologi til at udforske genfunktionen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bestemmelse af molekylære strukturer af HIV Konvolut glycoproteiner med Cryo-Electron Tomography og Automatiseret Sub-tomogram Gennemsnitsberegnings

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total protein Udvinding og 2-D gelelektroforese Metoder til<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Overvåge ændringer i Membrane polaritet, Membrane Integritet, og intracellulære Ion Koncentrationerne i<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Brug fluorescerende farvestoffer

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Oprensning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites Til brug i opsoniserende antistofanalyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Ikke-invasiv billeddannelse af Innate immunrespons i en zebrafisk Larve Model af<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Et-trins Negativ kromatografisk oprensning af<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende protein overudtrykt i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Oprensning fra Intracellulært Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En murin model af gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...