Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (subsidie nummers 16K15860 en 19K10471 tot T. M., 17K12032 tot M. I., en 18K09926 tot N. H.) en de SECOM Science and Technology Foundation (subsidie nummer 2018.09.10 nr. 1).

Opmerking: Generatie van S. mutans ∆gtfc, waarin de volledige coderende regio van het gtfc -gen wordt vervangen door SPCr, moet worden voltooid voordat deze protocollen worden uitgevoerd. Raadpleeg het gepubliceerde artikel voor meer informatie over generatie5.
1. ontwerp van de primer
<ol><li>
Bereid primers voor de bouw van S. mutans zijn-gtfc. Opmerking:<...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

Het ontwerp van primers is de meest kritieke stap in het protocol. De sequenties van de gtfc-reverse en SPCr-forward primers werden automatisch bepaald op basis van de sequenties van zowel het 3 ′ eindgebied van gtfc als het 5 ′ eindgebied van SPCr. Elke primer bevat 24 complementaire basissen die coderen een GS linker en een zijn-tag-coding sequentie in hun 5 ' regio's. Verstoring van de inheemse regelgevings sequenties gelegen in de upstream flankerende regi...

Analyse van de functie van een gen impliceert meestal een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild-type stammen tot stammen waarin het gen van belang is verstoord. Zodra de door het gen verstoorde stam wordt geproduceerd, maakt exogene toevoeging van het genproduct een functioneel herstel mogelijk.
De meest voorkomende methode voor het verkrijgen van gezuiverde genproducten die nodig zijn voor daaropvolgende restauratie testen is door heterologeuze expressie in Escherichia coli1uit te voeren. Echter, de expressie van membraan eiwitten of hoge moleculaire massa eiwitten is vaak moeilijk met behulp van dit systeem1. In deze gevallen wordt het doeleiwit meestal geïsoleerd van de cellen die het eiwit native synthetiseert door middel van een complexe reeks stappen, wat kan leiden tot verlies van het genproduct. Om deze problemen op te lossen, is een eenvoudige procedure ontwikkeld voor genproduct zuivering na een gendisruptie methode2, PCR-gebaseerde DNA-splicing methode3 (aangewezen twee-STELE fusie-PCR) en elektroporation voor genetische transformatie in Streptococcus mutans. Toevoeging van een polyhistidine tag (his-tag) aan het C-eindpunt van het genproduct vergemakkelijkt de zuivering ervan door geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie (IMAC).
Om de zijn-tag-uitverwoorde stam te isoleren, wordt het gehele genomische DNA van het gen van belang (in deze zijn-tag-uitverwoorde gen-verstoorde stam) vervangen door een antibioticum-resistent marker gen. De procedure voor het genereren van de his-tag-uitdrukken van strainis bijna identiek aan die voor het genereren van een genverstoorde stam zoals eerder beschreven4,5. Daarom moeten de methoden voor gendisruptie en genproduct isolatie worden uitgevoerd als seriële experimenten voor de functionele analyse.
In het huidige werk, een polyhistidine-Coding sequentie wordt gehecht aan het 3 ′ uiteinde van de Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005) gen, codering glucosyltransferase-si (GTF-si) in S. mutans6. Vervolgens werden expressie studies in een streptokokken soort uitgevoerd. Het bereiken van heterologe gtfc expressie door E. coli is moeilijk, waarschijnlijk vanwege de hoge moleculaire massa van GTF-si. Deze stam heeft de naam S. mutans his-gtfc. Een schematische illustratie van de organisatie van de gtfc en spectinomycine resistentie gen cassette (SPCr)7 loci in wild-type S. mutans (s. mutans WT) en derivaten daarvan wordt weergegeven in Figuur 1. De GTF-SI is een secretoire proteïne dat bijdraagt aan de ontwikkeling van de cariogene dentale biofilm6. Onder de aanwezigheid van sucrose wordt een aanhandige biofilm waargenomen op een glad glazen oppervlak in WT s. mutans stam maar niet in de S. mutans gtfc-verstoorde stam (S. mutans Δgtfc)2,5 . Biofilm vorming wordt hersteld in S. mutans Δgtfc op exogene toevoeging van de RECOMBINANT GTF-si. De stam, S. mutans zijn-gtfc, wordt vervolgens gebruikt voor de productie van de RECOMBINANT GTF-si.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

De Elucidatie van de functie van een gen impliceert doorgaans een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild type stammen en stammen waarin het gen van belang is verstoord. Verlies van functie na genverstoring wordt vervolgens hersteld door exogene toevoeging van het product van het verstoorde gen. Dit helpt om de functie van het gen te bepalen. Een eerder beschreven methode omvat het genereren van een Gtfc gen-verstoorde Streptococcus mutans stam. Hier wordt een niet-veeleisende methode beschreven voor het zuiveren van het Gtfc -genproduct uit de nieuw gegenereerde S. mutans -stam na de verstoring van het gen. Het gaat om de toevoeging van een sequentie van polyhistidine-Coding aan het 3 ′ uiteinde van het gen van belang, waardoor eenvoudige zuivering van het genproduct met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie mogelijk is. Voor de genetische modificatie in deze methode zijn geen andere enzymatische reacties nodig dan PCR. Het herstel van het genproduct door exogene toevoeging na gendisruptie is een efficiënte methode voor het bepalen van de genfunctie, die ook kan worden aangepast aan verschillende soorten.

Figuur 3 toont de grootte van elke ampliconlengte voor Temp van de eerste PCR (Figuur 3a) en de tweede PCR (Figuur 3b). De grootte van elke ampliconlengte voor temp correspondeerde met de voorspelde grootte, zoals beschreven in tabel 1. Fig. 4a toont S. mutans kolonies getransformeerd met het tweede PCR product en verguld op de BHI agar platen m...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Hier beschreven is een eenvoudige methode voor de zuivering van een genproduct in Streptococcus mutans. Deze techniek kan voordelig zijn bij de zuivering van eiwitten, met name membraan eiwitten en hoge moleculaire massa-eiwitten, en kan worden gebruikt met verschillende andere bacteriesoorten.

Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie veld, zoals, hoe een gen product dat moeilijk uit te drukken in E.Coli zuivert. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat geen enzymatische reactie, andere dan PCR, is de drager, en gemeenschappelijke toepassingen voor eiwitzuivering kan worden gebruikt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitzuivering in streptokokken mutans, kan het ook een op de hoogte zijn van andere microbiota soorten.Het aantonen van de procedure zal Dr.Mamiko Yamashita, een grad student van ons laboratorium. Na primer ontwerp en genomic DNA extractie van streptokokken mutans, voer de eerste PCR met behulp van de wild-type streptokokken mutans en GFC verstoord streptokokken genoom als de PCR sjablonen. Versterk de regio's die het stroomafwaartse deel van het gtfC-gen herbergen en die het spectinomycine-resistentiegen herbergen met behulp van de voorbereide gtfC-forward en reverse primer en spc r-forward en reverse primer.Vervolgens elektroforese elk PCR-product op 1%agarose gel. Gebruik een gelbandsnijder om de gewenste DNA-fragmenten van ongeveer 1.000 basisparen en 2.000 basisparen uit de gel in microcentrifugebuizen te vereven. Voeg 500 microliter oplosbuffer in elke buis toe en broed ze gedurende 10 minuten uit bij 56 graden Celsius om de gelplakjes op te lossen.Zuiver de fragmenten met behulp van silica membraan gebaseerde gel extractie methode. Voer een tweede PCR uit met de producten van de eerste PCR als PCR-sjablonen met de geneste en geneste omgekeerde primers. Wanneer het tweede PCR-product niet kan worden bevestigd door elektroforese, moet het paar van een andere geneste primer worden ontworpen.elektrophorese vijf microliters van het PCR mengsel op de agarose gel. Bevestig de generatie van de juiste amplicon van ongeveer 3.000 basisparen door ethidium bromide gel kleuring beeld en ga volgens het manuscript. Meng nu vijf microliter van het geconcentreerde tweede PCR-product tot de 50-microliter aloquot van ijskoude, competente streptokokkenmutancellen van het hele wildtype, eerder bevroren.Voeg het mengsel in een elektroporatie cuvette en plaats de cuvette in de cuvette kamer van de elektroporatie-apparaat. Geef een enkele elektrische puls van 1,8 kilovolt, 600 ohm en 10 microfarads gedurende 2,5 milliseconden aan de cellen. Voeg 500 microliters van hersenhart infusiebouillon toe aan de cuvette.Verspreid onmiddellijk 10 tot 100 microliter van de suspensie op hersenhartinfusie augerplaten met spectinomycine. Broed de platen twee tot zes dagen bij 37 graden Celsius tot de kolonies voldoende zijn gegroeid om opgehaald te worden. Na het genereren van streptococcus mutans polyhistidine codering sequentie opgenomen stam en 's nachts inenting zonder spectinomycine volgens het manuscript, centrifugeren de bacteriële cultuur suspensie gedurende 20 minuten op 10.000 keer g bij vier graden Celsius.Breng de cultuur supernatant in een drie-liter glazen beker. Om de eiwitten uit de cultuur supernatant te concentreren, plaats de twee-liter supernatant op een magnetische roerder en beginnen krachtig roeren. Voeg 1, 122 gram ammoniumsulfaat toe en laat het neerslag zich vormen met krachtig roeren bij vier graden Celsius gedurende een periode van vier uur of 's nachts. Volgende.centrifugeren het ammoniumsulfaat neergeslagen oplossing op 15,000 keer g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer de supernatant. Met een spatel, verzamel het neerslag en breng het in een 200-milliliter glazen bekerglas.Resuspend de pellets in 35 milliliter bindende buffer. Breng vervolgens elk ongeveer 25 milliliter van de suspensie over in een geregenereerde cellulosedialysebuis. Plaats de dialysebuis in 2,5 liter van de roerende bindingsbuffer op een roerder bij vier graden Celsius om de suspensie te dialyseren.Vervang de dialyseoplossing na twee uur en ga 's nachts verder met dialyse. Breng vervolgens de gedialyseerde suspensie van de slang naar centrifugebuizen en plaats de buizen in de centrifuge op 20.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Met sectiefiltratieapparatuur giet u de supernatant over een membraanfilter van 0,2 micrometer om te filteren.Breng het filtraat over in een kolf van 75 milliliter. Om de polyhistidine-tagged gtfSI uit de gefiltreerde suspensie te fractioneren, moet u eerst een geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie voorbereiden. Na het equilibrating van de hars volgens het manuscript, sluit de Hoffman knijp pik.Voeg vijf milliliter van de gefilterde suspensie toe aan de kolom om een drijfmest te maken. Breng vervolgens alle drijfmest over op de resterende gefilterde suspensie en draai het mengsel voorzichtig gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Laad het mengsel terug in de kolom.Open de Hoffman pinch pik om de suspensie te verwijderen door de zwaartekracht stroom. Was de IMAC-hars met 20 milliliter bindingsbuffer en vervolgens 20 milliliter elutie buffer om de recombinant gtfSI te verkrijgen. Laad daarna het eluaat in een centrifugale ultrafiltratiebuis en centrifugeer de oplossing op 2.000 keer g gedurende één tot vijf minuten om de oplossing te concentreren.Leeg de filtraat container en voeg 15 milliliter opslagbuffer in de buis. Centrifugeren het monster opnieuw en herhaal het proces twee keer extra. De recombinant gtfSI oplossing is uiteindelijk geconcentreerd op ongeveer een milliliter.Breng het concentraat in een microcentrifugebuis en bewaar op vier graden Celsius. Ga verder met het restfunctioneel restauratieprotocol. In dit protocol toont de agarose gel elektroforese aan dat de grootte van elke amplicon van de eerste PCR en de tweede PCR overeenkwam met de voorspelde grootte.Streptococcus mutans kolonies werden getransformeerd met het tweede PCR-product en verguld op de hersenen-hart infusie vijzel platen met spectinomycine. Kolonie PCR producten draaien op de agarose gel laat zien dat elke amplicon was van de voorspelde grootte. Eiwit gezuiverd met geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie werd waargenomen als een enkele band door SDS-PAGE.Westerse vlek, uitgevoerd met behulp van het anti-polyhistidine antilichaam, bevestigde dat de waargenomen band het verwachte polyhistidine-gelabelde eiwit van 160 kilodaltons was. De sucrose-afgeleide biofilm vormen vermogen werd alleen gezien met streptococcus mutans wild-type en streptococcus mutans His-gtfC, die een aanhangende biofilm op de buiswand gevormd in aanwezigheid van 1%sucrose. Dit werd niet waargenomen in streptococcus mutans delta gtfC.Echter, de toevoeging van 25 microgram van de recombinant gtfSI herstelde de aanhangende biofilm vorming vermogen in streptococcus mutans delta gtfC. Aangezien het succes van deze methode afhangt van de tweede PCR-versterking, moet het tweede PCR-product worden bevestigd door elektroforese. Reeds, histidine-type eiwit verkregen door deze methode is ook bijeenkomen voor functionele zuren, zoals eiwit-eiwit interacties.Na de ontwikkeling maakte deze techniek, in combinatie met genverstoring, de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van microbiologie om de genfunctie te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em&gt; Burkholderia</em&gt; Soorten

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Een stap Negatieve Chromatografische zuivering van<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofiel-activerend eiwit overexpressie in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In Batchmodus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Zuivering van Intracellulair Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofaag-cellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Een muizenmodel van groep B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginale Kolonisatie

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...