Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (numéros de subvention 16K15860 et 19K10471 à T. M., 17K12032 à M. I., et 18K09926 à N. H.) et la SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numéro de subvention 2018.09.10 No 1).

REMARQUE: Génération de S. mutans gtfC, dans lequel toute la région de codage du gène gtfC est remplacée par spcr, doit être complétée avant d'effectuer ces protocoles. Consultez l'article publié pour plus de détails sur la génération5.
1. Conception d'apprêt
<ol><li>
Préparer les amorces pour la construction de S. mutans His-gtfC. REMARQUE:</str...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

La conception des amorces est l'étape la plus critique du protocole. Les séquences des amorces gtfC-reverse et spcr-avantont été automatiquement déterminées en fonction des séquences de la région d'extrémité de 3 degrés de gtfC et de la région de fin de 5 degrés de spcr. Chaque amorce comprend 24 bases complémentaires qui codent un lien GS et une séquence de codage His-tag dans leurs régions de 5'. La perturbation des séquences réglementaires ind...

L'analyse de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches de type sauvage aux souches dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. Une fois que la souche perturbée par le gène est produite, l'ajout exogène du produit génique permet une restauration fonctionnelle.
La méthode la plus courante pour obtenir les produits géniques purifiés requis pour les essais de restauration ultérieures est en effectuant l'expression hétérologue dans Escherichia coli1. Cependant, l'expression des protéines membranaires ou des protéines de masse moléculaire élevée est souvent difficile à l'aide de ce système1. Dans ces cas, la protéine cible est habituellement isolée des cellules qui synthétisent la protéine par une série complexe d'étapes, qui peuvent mener à la perte du produit génique. Pour surmonter ces problèmes, une procédure simple a été développée pour la purification des produits géniques à la suite d'une méthode de perturbation génétique2, pcR à base de méthode d'épissage de l'ADN3 (désigné en deux étapes de fusion PCR), et l'électroporation pour la génétique transformation dans Streptococcus mutans. L'ajout d'une étiquette de polyhistidine (His-tag) au c-terminus du produit génique facilite sa purification par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).
Pour isoler la souche His-tag-expressing, l'ADN génomique entier du gène d'intérêt (dans cette souche son-étiquette-exprimant gène-perturbé) est remplacé par un gène de marqueur antibiorésistant. La procédure pour générer la souche His-tag-exprimant est presque identique à celle pour générer une souche gène-perturbée comme décrit précédemment4,5. Par conséquent, les méthodes de perturbation génétique et d'isolement des produits géniques devraient être effectuées en série d'expériences pour l'analyse fonctionnelle.
Dans le présent travail, une séquence de codage de polyhistidine est attachée à l'extrémité 3 du gène gtfC (GenBank locus tag SMU 1005), codant la glucosyltransferase-SI (GTF-SI) en S. mutans6. Ensuite, des études d'expression chez une espèce streptococcique ont été réalisées. Il est difficile d'atteindre l'expression hétérologue de la gtfC par E. coli, probablement en raison de la masse moléculaire élevée de GTF-SI. Cette souche est nommée S. mutans His-gtfC. Une illustration schématique représentant l'organisation de la cassette de gène de résistance à la gtfC et à la spectinomycine (spcr)7 loci dans le type sauvage S. mutans (S. mutans WT) et ses dérivés est montrée dans Figure 1. Le GTF-SI est une protéine sécrétrice qui contribue au développement du biofilm dentaire cariogénique6. Sous la présence du saccharose, un biofilm adhérent est observé sur une surface de verre lisse dans la souche WT S. mutans, mais pas dans la souche S. mutans gtfC-perturbée (S. mutans 'gtfC)2,5 . La formation de biofilms est restaurée dans S. mutans -gtfC après l'ajout exogène du GTF-SI recombinant. La souche, S. mutans His-gtfC, est ensuite utilisé pour produire le GTF-SI recombinant.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

L'élucidation de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches et souches de type sauvage dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. La perte de fonction à la suite d'une perturbation génétique est ensuite rétablie par l'ajout exogène du produit du gène perturbé. Cela aide à déterminer la fonction du gène. Une méthode précédemment décrite consiste à générer une souche de Streptococcus mutans perturbée par le gène gtfC. Ici, une méthode peu exigeante est décrite pour purifier le produit de gène de gtfC de la souche nouvellement produite de S. mutans suivant la perturbation de gène. Il s'agit de l'ajout d'une séquence de codage de polyhistidine à l'extrémité 3 du gène d'intérêt, ce qui permet une simple purification du produit génique à l'aide d'une chromatographie d'affinité métallique immobilisée. Aucune réaction enzymatique autre que PCR n'est requise pour la modification génétique de cette méthode. La restauration du produit génique par ajout exogène après la rupture des gènes est une méthode efficace pour déterminer la fonction génique, qui peut également être adaptée à différentes espèces.

La figure 3 montre la taille de chaque amplicon du premier PCR (Figure 3A) et du deuxième PCR (Figure 3B). La taille de chaque amplicon correspondait à la taille prévue, tel que décrit dans le tableau 1. La figure 4A montre des colonies de S. mutans transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d'agar BHI contenant...

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Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Décrit ici est une méthode simple pour la purification d'un produit génique dans Streptococcus mutans. Cette technique peut être avantageuse dans la purification des protéines, en particulier les protéines membranaires et les protéines de masse moléculaire élevée, et peut être utilisée avec diverses autres espèces bactériennes.

Purification d'une protéine de masse moléculaire élevée chez Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie telles que la façon dont un produit génétique difficile à exprimer dans E.Coli purifie. Les principaux avantages de cette technique sont qu’aucune réaction enzymatique, autre que pcr, n’est le porteur, et des applications communes pour la purification de protéine peuvent être employées. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la purification des protéines chez les mutagés streptocoques, elle peut également être une connaissance d’autres espèces de microbiotes.Le Dr Mamiko Yamashita, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera la procédure. Après la conception de l’amorce et l’extraction de l’ADN génomique à partir de streptocoques mutans, effectuer le premier PCR en utilisant le streptocoque mutans de type sauvage et GFC perturbé le génome streptococcus mutans que les modèles PCR. Amplifiez les régions abritant la partie aval du gène gtfC et celles abritant le gène de résistance à la spectinomycine à l’aide de l’amorce préparée gtfC-forward et inverse et de l’amorce spc r-forward et inverse.Ensuite, électrophorese chaque produit PCR sur 1% gel agarose. Utilisez un coupe-gel pour exciser les fragments d’ADN désirés d’environ 1000 paires de base et de 2000 paires de base du gel en tubes de microcentrifugeuse. Ajouter 500 microlitres de tampon solubilisant dans chaque tube et les incuber pendant 10 minutes à 56 degrés Celsius pour dissoudre les tranches de gel.Purifier les fragments à l’aide d’une méthode d’extraction de gel à base de silice à base de membrane. Effectuez un deuxième PCR en utilisant les produits du premier PCR comme modèles PCR avec les amorces imbriquées vers l’avant et imbriquées. Lorsque le deuxième produit PCR ne peut pas être confirmé par électrophoresis, la paire d’une autre amorce imbriquée doit être conçue.électrophorese cinq microlitres du mélange de PCR sur le gel d’agarose. Confirmez la généra tion de l’amplicon approprié d’environ 3000 paires de base par image de coloration de gel de bromure d’éthidium et procédez selon le manuscrit. Maintenant, mélangez cinq microlitres du deuxième produit concentré de PCR à l’aloquot de 50 microlitres des cellules muettes froides et compétentes de type sauvage de streptococcus mutan, congelées précédemment.Ajouter le mélange dans une cuvette d’électroporation et placer la cuvette dans la chambre de cuvette de l’appareil d’électroporation. Donnez une seule impulsion électrique de 1,8 kilovolts, 600 ohms et 10 microfarades pendant 2,5 millisecondes aux cellules. Ajouter 500 microlitres de bouillon d’infusion cerveau-coeur dans la cuvette.Étendre immédiatement 10 à 100 microlitres de la suspension sur des plaques d’auger d’infusion cerveau-coeur contenant de la spectinomycine. Incuber les plaques pendant deux à six jours à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies aient suffisamment grandi pour être ramassées. Après la génération de streptocoques mutans polyhistidine séquence de codage incorporé souche et l’inoculation pendant la nuit sans spectinomycine selon le manuscrit, centrifuger la suspension de la culture bactérienne pendant 20 minutes à 10.000 fois g à quatre degrés Celsius.Transférez le supernatant de culture dans un bécher en verre de trois litres. Pour concentrer les protéines de la culture supernatant, placez le supernatant de deux litres sur un agitateur magnétique et commencez à remuer vigoureusement. Ajouter 1 122 grammes de sulfate d’ammonium et laisser le précipité se former en remuant vigoureusement à quatre degrés Celsius sur une période de quatre heures ou pendant la nuit. prochain.centrifugeuse le sulfate d’ammonium a précipité la solution à 15 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnatant. À l’aide d’une spatule, recueillir le précipité et le transférer dans un bécher en verre de 200 millilitres.Resuspendez les granulés en 35 millilitres de tampon de liaison. Ensuite, transférez chacun environ 25 millilitres de suspension dans un tube de dialyse à cellulose régénéré. Placez le tube de dialyse en 2,5 litres du tampon de liaison en remuant sur un agitateur à quatre degrés Celsius pour dialyser la suspension.Remplacez la solution de dialyse après deux heures et continuez la dialyse pendant la nuit. Ensuite, transférez la suspension dialysée du tube aux tubes de centrifugeuse et placez les tubes dans la centrifugeuse à 20 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Avec l’équipement de filtration de section, versez le supernatant sur un filtre de membrane de 0,2 micromètre pour filtrer.Transférer le filtrate dans un flacon de 75 millilitres. Pour fractionner le gtfSI marqué en polyhistidine de la suspension filtrée, préparez d’abord une chromatographie d’affinité métallique immobilisée. Après avoir équilibré la résine selon le manuscrit, fermez la bite hoffman pincée.Ajouter cinq millilitres de la suspension filtrée dans la colonne pour faire un lisier. Ensuite, transférez toute la boue à la suspension filtrée restante et faites tourbillonner doucement le mélange pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Chargez le mélange dans la colonne.Ouvrez la bite hoffman pincement pour enlever la suspension par le flux de gravité. Lavez la résine IMAC avec 20 millilitres de tampon de liaison, puis, elute 20 millilitres de tampon d’élitution pour obtenir le gtfSI recombinant. Après cela, charger l’allongement dans un tube centrifuge ultra filtration et centrifugeuse la solution à 2000 fois g pendant une à cinq minutes pour concentrer la solution.Videz le contenant de filtrate et ajoutez 15 millilitres de tampon de stockage dans le tube. Centrifugez l’échantillon à nouveau et répétez le processus deux fois supplémentaires. La solution gtfSI recombinante est finalement concentrée à environ un millilitre.Transférer le concentré dans un tube de microcentrifugeuse et le conserver à quatre degrés Celsius. Continuez avec le protocole de restauration fonctionnelle de repos. Dans ce protocole, l’électrophorèse de gel d’agarose montre que la taille de chaque amplicon du premier PCR et du deuxième PCR a correspondu à la taille prévue.Les colonies de streptocoques mutans ont été transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d’auger d’infusion cerveau-coeur contenant de la spectinomycine. Les produits Colony PCR fonctionnent sur le gel agarose montre que chaque amplicon était de la taille prévue. La protéine purifiée avec la chromatographie immobilisée d’affinité de métal a été observée en tant que bande simple par SDS-PAGE.La tache occidentale, effectuée à l’aide de l’anticorps antihistidine, a confirmé que la bande observée était la protéine prévue de 160 kilodaltons marquée par la polyhistidine. La capacité de formation de biofilm dérivée du saccharose n’a été vue qu’avec le streptocoque mutans de type sauvage et le streptocoque mutans His-gtfC, qui a formé un biofilm adhérent sur la paroi du tube en présence de 1% de saccharose. Ceci n’a pas été observé dans streptococcus mutans delta gtfC.Cependant, l’ajout de 25 microgrammes du gtfSI recombinant a restauré la capacité de formation de biofilm adhérente dans le delta gtfC de delta de streptococcus mutans. Puisque le succès de cette méthode dépend de la deuxième amplification pcr, le deuxième produit PCR doit être confirmé par électrophoresis. Déjà, la protéine de type histidine obtenue par cette méthode se convoque également à des acides fonctionnels, tels que les interactions protéines-protéines.Après son développement, cette technique, combinée à la perturbation génétique, a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la fonction génétique.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Recherche

Immunologie et infection

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield purification de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Une étape négative de purification chromatographique<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En mode batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

ARN Purification de Intracellulairement Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Dans les cellules macrophages

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...