Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numeri di sovvenzione 16K15860 e 19K10471 a T. M., da 17K12032 a M. I., e da 18K09926 a N. H.) e dalla SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numero di sovvenzione 2018.09.10 n. 10).

NOT:</</c0> Generazione di S. mutans -gtfC, in cui l'intera area di codifica del gene gtfC viene sostituita con spcr, deve essere completata prima di eseguire questi protocolli. Fare riferimento all'articolo pubblicato per informazioni dettagliate sulla generazione5.
1. Progettazione di Primer
<ol><li>
Preparare primer per la costruzione di S. mutans His-gtfC. <stron...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. 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La progettazione dei primer è il passo più critico del protocollo. Le sequenze dei primer gtfC-reverse e spcr-forward sono state determinate automaticamente in base alle sequenze sia della regione finale 3 di gtfC che della regione finale 5 di spcr. Ogni primer include 24 basi complementari che codificano un linker GS e una sequenza His-tag-coding nelle loro regioni 5'. L'interruzione delle sequenze normative native situate nelle regioni di fianco a monte può e...

L'analisi della funzione di un gene di solito comporta il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi di tipo selvaggio ai ceppi in cui il gene di interesse è stato interrotto. Una volta prodotto il ceppo dirompente genico, l'aggiunta esogena del prodotto genetico consente il ripristino funzionale.
Il metodo più comune per ottenere i prodotti genici purificati necessari per il successivo restauro è eseguendo un'espressione eterologa in Escherichia coli1. Tuttavia, l'espressione di proteine della membrana o di proteine di massa molecolari elevate è spesso difficile da usare in questo sistema1. In questi casi, la proteina bersaglio è solitamente isolata dalle cellule che sintetizzano nativamente la proteina attraverso una complessa serie di passaggi, che possono portare alla perdita del prodotto genetico. Per superare questi problemi, è stata sviluppata una semplice procedura per la purificazione del prodotto genico a seguito di un metodo di interruzione genica2, del metodo di giunzione del DNA basato su PCR3 (PCR di fusione in due fasi) e dell'elettroporazione per la genetica trasformazione in Streptococcus mutans. L'aggiunta di un tag polihisinoso (His-tag) al capo-terminus del prodotto genetico ne facilita la purificazione mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC).
Per isolare il ceppo che esprime tag His, l'intero DNA genomico del gene di interesse (in questo ceppo disgregazione genica che esprime i suoi tag) viene sostituito da un gene marcatore resistente agli antibiotici. La procedura per generare la varietà His-tag-expressing è quasi identica a quella per generare un ceppo genico-interrotto come descritto in precedenza4,5. Pertanto, i metodi per la perturbazione genica e l'isolamento del prodotto genico dovrebbero essere eseguiti come esperimenti seriali per l'analisi funzionale.
Nel lavoro attuale, una sequenza di codifica della polihisina è collegata al gene gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-SI (GTF-SI) in S. mutans6. Quindi, sono stati eseguiti studi di espressione in una specie streptococcale. Raggiungere l'espressione eteologa di gtfC da parte di E. coli è difficile, probabilmente a causa dell'alta massa molecolare di GTF-SI. Questo ceppo si chiama S. mutans His-gtfC. Un'illustrazione schematica raffigurante l'organizzazione della cassetta del gene gtfC e della spettromica (spcr)7 loci in Wild-type S. mutans (S. mutans WT) e i suoi derivati è mostrato in Figura 1. Il GTF-SI è una proteina secretoria che contribuisce allo sviluppo del biofilm dentale cariogenico6. Sotto la presenza di saccarosio, un biofilm aderente è osservato su una superficie di vetro liscia in WT S. mutans ceppo ma non nella deformazione S. mutans gtfC-interrotto (S. mutans -gtfC)2,5 . La formazione di biofilm viene ripristinata in S. mutans gt -fC dopo l'aggiunta esogena del ricombinante GTF-SI. Il ceppo, S. mutans His-gtfC, viene quindi utilizzato per produrre il ricombinante GTF-SI.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

La chiarificazione della funzione di un gene comporta in genere il confronto dei tratti fenotipici dei ceppi e dei ceppi di tipo selvaggio in cui il gene di interesse è stato interrotto. La perdita di funzione dopo l'interruzione genica viene successivamente ripristinata mediante l'aggiunta esogena del prodotto del gene interrotto. Questo aiuta a determinare la funzione del gene. Un metodo descritto in precedenza comporta la generazione di un ceppo Streptococcus mutans interrotto dal gene gtfC. Qui, viene descritto un metodo poco impegnativo per purificare il prodotto genico gtfC dal ceppo S. mutans appena generato dopo la rottura genica. Si tratta dell'aggiunta di una sequenza di codifica della polihistidina alla fine del gene di interesse, che consente una semplice purificazione del prodotto genetico utilizzando la cromatografia dell'affinità metallica immobilizzata. Non sono necessarie reazioni enzimatiche diverse da PCR per la modificazione genetica in questo metodo. Il ripristino del prodotto genetico mediante aggiunta esogena dopo la perturbazione genica è un metodo efficace per determinare la funzione genica, che può anche essere adattata a diverse specie.

Figura 3 Mostra la dimensione di ogni amplificatore dal primo PCR (Figura 3A) e secondo PCR (Figura 3B). La dimensione di ogni amplificatore corrispondeva alla dimensione prevista, come descritto nella Tabella 1. La figura 4A mostra le colonie di S. mutans trasformate con il secondo prodotto PCR e placcate sulle piastre di agar BHI contenenti sp...

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Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Descritto qui è un metodo semplice per la purificazione di un prodotto genetico in Streptococcus mutans. Questa tecnica può essere vantaggiosa nella purificazione delle proteine, in particolare le proteine della membrana e le proteine ad alta massa molecolare, e può essere utilizzata con varie altre specie batteriche.

Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia come, come purifica un prodotto genetico difficile da esprimere in E.Coli. I principali vantaggi di questa tecnica sono che nessuna reazione enzimatica, diversa dalla PCR, è il vettore e possono essere utilizzate applicazioni comuni per la purificazione delle proteine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla purificazione proteica negli streptococcus mutans, può anche essere un informato di altre specie di microbiota.A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Mamiko Yamashita, una studentessa del nostro laboratorio. Dopo la progettazione del primer e l'estrazione genomica del DNA dagli streptococcus mutans, eseguire il primo PCR utilizzando gli streptococcus mutans di tipo selvaggio e il genoma di streptococcus mutans interrotto dal GFC come modelli PCR. Amplificare le regioni che ospitano la parte a valle del gene gtfC e quelle che ospitano il gene di resistenza alla spectinomicina usando il primer gtfC-forward e reverse preparato e il primer spc r-forward e reverse.Quindi, elettrofora ogni prodotto PCR su gel di agarosio all'1%. Utilizzare un taglia-gel per asportare i frammenti di DNA desiderati di circa 1.000 coppie di basi e 2.000 coppie di basi dal gel in tubi a microcentrifugo. Aggiungere 500 microlitri di tampone solubilizzante in ogni tubo e incubarli per 10 minuti a 56 gradi Celsius per sciogliere le fette di gel.Purificare i frammenti utilizzando il metodo di estrazione del gel a base di membrana di silice. Eseguire un secondo PCR utilizzando i prodotti del primo PCR come modelli PCR con i primer nidificati in avanti e nidificati. Quando il secondo prodotto PCR non può essere confermato dall'elettroforesi, deve essere progettata la coppia di un altro primer annidato.elettroforesi cinque microlitri della miscela PCR sul gel di agarosio. Confermare la generazione dell'amplicon appropriato di circa 3.000 coppie di basi mediante immagine di colorazione del gel di bromuro di etidio e procedere secondo il manoscritto. Ora, mescolare cinque microlitri del secondo prodotto PCR concentrato con l'aloquot di 50 microlitri di cellule mutagene di streptococco di tipo selvatico freddo e competenti, congelate in precedenza.Aggiungere la miscela in una cuvetta di elettroporazione e posizionare la cuvetta nella camera di cuvetta dell'apparecchio di elettroporazione. Dare un singolo impulso elettrico di 1,8 kilovolt, 600 ohm e 10 microfarad per 2,5 millisecondi alle cellule. Aggiungere 500 microlitri di brodo per infusione cervello-cuore nella cuvetta.Stendere immediatamente da 10 a 100 microlitri della sospensione su piastre di coclea per infusione cervello-cuore contenenti spectinomicina. Incubare le piastre per due o sei giorni a 37 gradi Celsius fino a quando le colonie non sono cresciute a sufficienza per essere raccolte. Dopo la generazione di streptococcus mutans sequenza codificante poliistidina incorporato ceppo e inoculazione notturna senza spettromicina secondo il manoscritto, centrifugare la sospensione della coltura batterica per 20 minuti a 10.000 volte g a quattro gradi Celsius.Trasferire il supernatante della coltura in un bicchiere da tre litri. Per concentrare le proteine dal supernatante di coltura, posizionare il supernatante da due litri su un agitatore magnetico e iniziare a mescolare vigorosamente. Aggiungere 1.122 grammi di solfato di ammonio e lasciare che il precipitato si formi con agitazione vigorosa a quattro gradi Celsius per un periodo di quattro ore o durante la notte. prossimo.centrifugare la soluzione precipitata di solfato di ammonio a 15.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il supernatante. Con una spatola, raccogli il precipitato e trasferiscilo in un bicchiere da 200 millilitri.Resuspend i pellet in 35 millilitri di tampone di legame. Quindi, trasferire ciascuno circa 25 millilitri della sospensione in un tubo di dialisi in cellulosa rigenerata. Posizionare il tubo di dialisi in 2,5 litri del tampone legante agitazione su un agitatore a quattro gradi Celsius per dializzare la sospensione.Sostituire la soluzione di dialisi dopo due ore e continuare la dialisi durante la notte. Successivamente trasferire la sospensione dializzata dai tubi ai tubi di centrifuga e posizionare i tubi nella centrifuga a 20.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Con l'apparecchiatura di filtrazione a sezione, versare il supernatante su un filtro a membrana da 0,2 micrometri per filtrare.Trasferire il filtrato in un pallone da 75 millilitri. Per frazionare il gtfSI taggato in poliistidina dalla sospensione filtrata, preparare prima una cromatografia di affinità metallica immobilizzata. Dopo aver equilibrato la resina secondo il manoscritto, chiudi il cazzo hoffmanno.Aggiungere cinque millilitri della sospensione filtrata nella colonna per creare un liquame. Quindi, trasferire tutto il liquame alla sospensione filtrata rimanente e ruotare delicatamente la miscela per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Caricare di nuovo la miscela nella colonna.Apri il cazzo hoffman pinch per rimuovere la sospensione dal flusso di gravità. Lavare la resina IMAC con 20 millilitri di tampone legante e quindi eludere 20 millilitri di tampone di eluizione per ottenere il gtfSI ricombinante. Successivamente, caricare l'eluato in un tubo centrifugo ultra filtrante e centrifugare la soluzione a 2.000 volte g per uno o cinque minuti per concentrare la soluzione.Svuotare il contenitore del filtrato e aggiungere 15 millilitri di tampone di stoccaggio nel tubo. Centrifugare nuovamente il campione e ripetere il processo due volte in più. La soluzione gtfSI ricombinante viene infine concentrata a circa un millilitro.Trasferire il concentrato in un tubo di microcentrifugo e conservare a quattro gradi Celsius. Continuare con il protocollo di ripristino funzionale del resto. In questo protocollo, l'elettroforesi del gel di agarosio mostra che la dimensione di ogni amplicone della prima PCR e della seconda PCR corrispondeva alla dimensione prevista.Le colonie di Streptococcus mutans sono state trasformate con il secondo prodotto PCR e placcate sulle piastre di coclea per infusione cervello-cuore contenenti spectinomicina. I prodotti PCR colony eseguiti sul gel di agarosio mostrano che ogni amplicone era della dimensione prevista. Proteine purificate con cromatografia ad affinità metallica immobilizzata sono state osservate come una singola banda da SDS-PAGE.Western blot, eseguita utilizzando l'anticorpo anti-poliistidina, ha confermato che la banda osservata era la proteina prevista con tag poliistidina di 160 kilodaltoni. La capacità di formatura del biofilm derivata dal saccarosio è stata osservata solo con streptococcus mutans di tipo selvatico e streptococcus mutans His-gtfC, che ha formato un biofilm aderente sulla parete del tubo in presenza dell'1% di saccarosio. Questo non è stato osservato nello streptococco mutans delta gtfC.Tuttavia, l'aggiunta di 25 microgrammi della gtfSI ricombinante ha ripristinato la capacità di formazione di biofilm aderenti in streptococcus mutans delta gtfC. Poiché il successo di questo metodo dipende dalla seconda amplificazione PCR, il secondo prodotto PCR deve essere confermato dall'elettroforesi. Già, la proteina di tipo istidina ottenuta con questo metodo sta anche convocando acidi funzionali, come le interazioni proteina-proteina.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica, in combinazione con l'interruzione genica, ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la funzione genica.

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During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per<em&gt; Burkholderia</em&gt; Specie

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo di tinture fluorescenti

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Un passo negativo cromatografica Purificazione di<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In modalità batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purificazione da nella cellula Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofagi

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...