Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
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この研究は、日本学術振興会(JSPS)(助成番号16K15860、19K10471~T.M.、17K12032~N.H.、セコム科学技術振興財団(助成番号201)の支援を受けています。.

注:gtfC遺伝子のコード領域全体をspcrに置き換えるS.mutansの生成は、これらのプロトコルを実行する前に完了する必要があります。ジェネレーション5の詳細については、公開された資料を参照してください。
1. プライマーデザイン
<ol><li>
S.ミュータンの建設のためのプライマーを準備する彼<em...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

プライマーの設計は、プロトコルの最も重要なステップです。gtfC -リバースプライマーとspcr-forward プライマーのシーケンスは、gtfC の 3'終了領域とspcrの 5′ 終了領域の両方のシーケンスに基づいて自動的に決定されました。各プライマーには、GS リンカーと 5' リージョンの His タグ コーディング シーケンスをエンコードする 24 の相補ベースが含?...

遺伝子の機能の分析は、通常、目的の遺伝子が破壊された株に野生型株の表現形質の比較を含む。遺伝子破壊株が産生されると、遺伝子産物の外因性添加が機能的回復を可能にする。
その後の修復アッセイに必要な精製遺伝子産物を得るための最も一般的な方法は、大腸菌1で異種発現を行うことである。しかしながら、膜タンパク質または高分子量タンパク質の発現は、このシステム1を用いて困難であることが多い。これらの場合、標的タンパク質は、通常、複雑な一連のステップを通じてタンパク質をネイティブに合成する細胞から単離され、遺伝子産物の損失につながる可能性があります。これらの問題を克服するために、遺伝子破壊法2、PCRベースのDNAスプライシング法3(指定2段階融合PCR)、遺伝子のエレクトロポレーションに続く遺伝子産物精製のための簡単な手順が開発されました。連鎖球菌変異体の変換.遺伝子産物のC終産にポリヒスチジンタグ(His-tag)を添加すると、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による精製が容易になります。
Hisタグ発現株を単離するために、目的の遺伝子のゲノムDNA全体(このHisタグ発現遺伝子破壊株)は、抗生物質耐性マーカー遺伝子に置き換えられる。Hisタグ発現株を生成する手順は、前述の4,5のように遺伝子破壊株を生成する手順とほぼ同じである。したがって、遺伝子破壊および遺伝子産物単離の方法は、機能解析のための連続実験として行われるべきである。
本研究では、ポリヒスチジンコード配列がgtfC(GenBank遺伝子座タグSMU_1005)遺伝子の3'末端に付着し、S.ミュータンス6にグルコシルトランスフェラーゼ-SI(GTF-SI)をコードする。次いで、連鎖球菌種における発現研究を行った。大腸菌による不一相gtfC発現の達成は困難であり、GTF-SIの分子量が高いためである可能性が高い。この株はS.ミュータンスHis-gtfCと名付けられています。野生型S.mutans(S.mutans WT)およびその誘導体におけるgtfCおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子カセット(spc r)7遺伝子の組織を示す概略図図 1.GTF-SIは、カリオ原性歯科バイオフィルム6の開発に貢献する分泌タンパク質です。ショ糖の存在下では、接着性バイオフィルムはWT S.ミュータンス株の滑らかなガラス表面で観察されるが、S.mutans gtfC-破壊株(S.mutans ΔgtfC)2、5では観察されない。.バイオフィルム形成は、組換えGTF-SIの外因性添加時にS.ミュータンスΔgtfCで復元される。 株、S.ミュータンスHis-gtfCは、次いで組換えGTF-SIを生成するために使用されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

遺伝子の機能の解明は、通常、目的の遺伝子が破壊された野生型株と株の表現型形質の比較を含む。遺伝子破壊後の機能の喪失は、その後、破壊された遺伝子の生成物の外因性添加によって回復される。これは、遺伝子の機能を決定するのに役立ちます。前述の方法は、gtfC遺伝子破壊連鎖球菌株を生成することを含む。ここで、遺伝子破壊に続いて新たに生成されたS.ミュータン株からgtfC遺伝子産物を精製するための要求の厳しい方法が記載されている。目的の遺伝子の3'末端にポリヒスチジンコード配列を添加することを含み、固定化金属親和性クロマトグラフィーを用いて遺伝子産物を簡単に精製することができます。この方法では、PCR以外の酵素反応は必要ありません。遺伝子破壊後の外因性添加による遺伝子産物の回復は、遺伝子機能を決定するための効率的な方法であり、異なる種に適応することもできる。

図3は、第1PCR(図3A)および第2PCR(図3B)からの各アンプリコンのサイズを示す。各アンプリコンのサイズは、表1に説明するように、予測サイズに対応しました。図4Aは、第2のPCR産物で形質転換し、スペクチノマイシンを含むBHI寒天プレート上にメッキされたS.ミュー?...

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Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

ここで説明する、連鎖球菌変異体における遺伝子産物の精製のための簡単な方法である。この技術は、タンパク質、特に膜タンパク質および高分子量タンパク質の精製に有利であり、かつ様々な他の細菌種と共に使用することができる。

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

この方法は、大腸菌で発現しにくい遺伝子製品がどのように精製されるのかなど、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、PCR以外の酵素反応が担体ではなく、タンパク質精製のための一般的な用途が使用できることです。この方法は、レンサ球菌突然変異体におけるタンパク質精製に関する洞察を提供することができるが、他の微生物叢種にも鑑たることができる。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生である山下真美子博士です。レンサ球菌変異体からのプライマー設計およびゲノムDNA抽出後、野生型レンサ球菌変異体およびGFC破壊ストレプトコッカス・ミュータンスゲノムをPCRテンプレートとして使用して最初のPCRを行う。調製したgtfC-フォワードおよびリバースプライマーおよびspc r-フォワードおよびリバースプライマーを使用して、gtfC遺伝子の下流部分を収容する領域およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を収容する領域を増幅する。次いで、1%アガロースゲル上の各PCR産物をエレクトロフォレス化した。ゲルバンドカッターを使用して、ゲルからマイクロ遠心チューブに約1,000塩基対と2,000塩基対の所望のDNA断片を切除します。各チューブに500マイクロリットルの可溶化バッファーを加え、56°Cで10分間インキュベートしてゲルスライスを溶解します。シリカ膜ベースのゲル抽出法を用いて断片を精製する。最初の PCR の産物を、ネストフォワードおよびネストされた逆のプライマーを含む PCR テンプレートとして使用して、2 番目の PCR を実行します。2番目のPCR産物が電気泳動で確認できない場合は、別のネストされたプライマーのペアを設計する必要があります。アガロースゲル上のPCR混合物の5マイクロリットルのエレクトロフォレス。エチジウムブロマイドゲル染色像により約3,000塩基対の適当なアンプリコンの生成を確認し、原稿に従って進める。今、濃縮された第二PCR産物の5マイクロリットルを氷冷、有能な野生型レンサ球菌突然変異細胞の50マイクロリットルのアロクォートに混合し、以前に凍結した。混合物をエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーション装置のキュベットチャンバーにキュベットを入れます。1.8キロボルト、600オーム、10マイクロファラドを2.5ミリ秒の単一の電気パルスを細胞に与えます。キュベットに500マイクロリットルの脳・心注入スープを加えます。すぐに10〜100マイクロリットルの懸濁液を、スペチノマイシンを含む脳-心輸液オーガープレートに広げる。コロニーが十分に成長して拾われるまで、37°Cで2〜6日間プレートをインキュベートします。ストレプトコッカス・ミュータンスポリヒスチジンコード配列の生成後、原稿による分光マイシンを伴わない菌株および一晩の接種を組み込み、摂氏4度で10,000倍gで20分間細菌培養懸濁液を遠心分離する。培養上清を3リットルガラスビーカーに移します。培養上清からタンパク質を濃縮するには、2リットルの上清を磁気攪拌機に置き、激しい攪拌を開始します。硫酸アンモニウム1、122グラムを加え、沈殿物を4時間または一晩にわたって摂氏4度で激しく攪拌して形成させます。次に。硫酸アンモニウム沈殿液を摂氏4度で20分間15,000回沈殿させた。上清をデカントします。ヘラで、沈殿物を収集し、200ミリリットルのガラスビーカーに移します。ペレットを35ミリリットルの結合バッファーに再懸濁します。次いで、約25ミリリットルの懸濁液を再生したセルロース透析管に移す。透析チューブを攪拌結合バッファーの 2.5 リットルに入れ、攪拌機の 4°C でサスペンションを透析します。2時間後に透析液を交換し、一晩透析を続けてください。次に、チューブから透析したサスペンションを遠心分離チューブに移し、チューブを20,000倍gの遠心分離機に摂氏4度で10分間置きます。セクションろ過装置では、上清を0.2マイクロメートルの膜フィルターで注ぎ、フィルターを付けます。濾液を75ミリリットルのフラスコに移します。濾過懸濁液からポリヒスチジンタグ付きgtfSIを分画するために、まず固定化された金属親和性クロマトグラフィーを調製する。原稿に従って樹脂を平衡化した後、ホフマンピンチコックを閉じます。フィルターした懸濁液を5ミリリットルのカラムに加え、スラリーを作ります。その後、残りの濾過された懸濁液にすべてのスラリーを移し、4°Cで30分間穏やかに混合物を渦巻きます。混合データを列にロードして戻します。ホフマンピンチコックを開き、重力の流れでサスペンションを取り除きます。IMAC樹脂を20ミリリットルの結合バッファーで洗浄し、次いで、溶出バッファーの20ミリリットルを溶出して組換えgtfSIを得た。その後、遠心超濾過チューブに溶出液を積み込み、溶液を2,000回gで遠心分離し、溶液を濃縮して1〜5分間濃縮します。濾液容器を空にし、15ミリリットルの貯蔵バッファーをチューブに加えます。サンプルを再び遠心分離し、さらに2回繰り返します。組換えgtfSI溶液は、最終的に約1ミリリットルに濃縮される。濃縮物をマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度で保管します。残りの機能復元プロトコルを続行します。このプロトコルにおいて、アガロースゲル電気泳動は、第1PCRおよび第2PCRからの各アンプリコンのサイズが予測サイズに対応していることを示している。ストレプトコッカスミュータンスコロニーは、第2のPCR産物で形質転換し、スペチノマイシンを含む脳心注入オーガープレートにメッキした。アガロースゲル上で実行されるコロニーPCR産物は、各アンプリコンが予測サイズであったことを示している。固定化された金属親和性クロマトグラフィーで精製されたタンパク質は、SDS-PAGEにより単一バンドとして観察された。ウェスタンブロットは、抗ポリヒスチジン抗体を用いて行い、観察されたバンドが160キロダルトンの期待されるポリヒスチジンタグ付きタンパク質であることを確認した。スクロース由来のバイオフィルム形成能は、1%スクロースの存在下でチューブ壁に付着性バイオフィルムを形成したレンサ球菌変異体野生型およびレンサ球菌変異体His-gtfCでのみ見られた。これはレンサ球菌ミュータンスデルタgtfCでは認められなかった。しかし、組換えgtfSIの25マイクログラムを添加すると、レンサ球菌ミュータンスデルタgtfCにおける接着性バイオフィルム形成能が回復した。この方法の成功は、第2のPCR増幅に依存するため、2番目のPCR産物は電気泳動によって確認されなければならない。すでに、この方法により得られたヒスチジン型タンパク質は、タンパク質相互作用などの機能性酸にも連結されている。その開発後、この技術は遺伝子破壊と組み合わせて、微生物学の分野の研究者が遺伝子機能を探求する道を開いた。

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High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

ワンステップの負のクロマトグラフィー精製<em&gt;ヘリコバクター・ピロリ</emで過剰発現&gt;好中球活性化タンパク質<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;バッチモードでの

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

グループBのマウスモデル<em&gt;連鎖球菌</em&gt;膣植民地化

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...