Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
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이 작품은 일본과학진흥회(JSPS)(교부금 번호 16K15860 및 19K10471~T.M., 17K12032~M.I., 18K0926~N.H.) 및 SECOM 과학기술재단(SECOM)(보조금 번호 2010.10.19.19.1.1.19)에 의해 지원되었습니다.

참고: gtfC 유전자의 전체 코딩 영역이 spcr로 대체되는 S. 뮤탄스 □gtfC의 생성은 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 완료되어야 한다. 5세대에대한 자세한 내용은 게시된 문서를 참조하십시오.
1. 프라이머 디자인
<ol><li>
S. 뮤탄스 그의gtfC의건설을위한 프라이머를 준비합니다. ...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

프라이머의 설계는 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. gtfC-reverse 및 spcr-forward프라이머의 시퀀스는 gtfC의 3′ 끝 영역과 spcr의5′ 끝 영역의 시퀀스에 따라 자동으로 결정되었습니다. 각 프라이머에는 GS 링커와 5' 영역에서 His-tag 코딩 시퀀스를 인코딩하는 24개의 보완 베이스가 포함되어 있습니다. 상류 측면 영역에 위치한 네이티브 조절 시퀀스의 중...

유전자의 기능의 분석은 일반적으로 관심있는 유전자가 중단된 균주에 야생 형 긴장의 표현형 특성의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 균주가 생성되면, 유전자 제품의 외인성 추가는 기능적 복원을 허용한다.
후속 복원 검사에 필요한 정제된 유전자 제품을 얻는 가장 일반적인 방법은 대장균1에서이종 발현을 수행하는 것이다. 그러나, 막 단백질 또는 고분자 질량 단백질의 발현은 종종 이 시스템을 사용하여 어렵다1. 이러한 경우에, 표적 단백질은 일반적으로 유전자 생성물의 손실로 이끌어 낼 수 있는 단계의 복잡한 시리즈를 통해 단백질을 기본적으로 종합하는 세포에서 단리됩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 파괴 방법2,PCR 기반 DNA 접합 방법3(지정 2단계 융합 PCR) 및 유전적 용 전기 천공에 따른 유전자 생성물 정제를 위한 간단한 절차가 개발되었습니다. 연쇄상 구균 뮤탄의변환 . 유전자 생성물의 C-말단에 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 첨가하면 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 그 정제가 용이합니다.
그의 태그 발현 긴장을 격리하기 위하여는, 관심 있는 유전자의 전체 게놈 DNA (이 그의 꼬리표 발현 유전자 중단한 긴장에서)는 항생 저항하는 마커 유전자로 대체됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 유전자 중단 균주를 생성하는 것과 거의 동일한 그의 태그 발현 균주를 생성하는 절차4,5. 따라서, 유전자 파괴 및 유전자 생성물 분리를 위한 방법은 기능분석을 위한 직렬 실험으로서 수행되어야 한다.
본 작에서, 폴리히스티딘 코딩 서열은 gtfC(GenBank 궤적 태그 SMU_1005) 유전자의 3′ 말단에 부착되고, 글루코실트랜스퍼라제-SI(GTF-SI)를 S. 뮤탄스6에인코딩한다. 이어서, 연쇄상 구균 종에서 발현 연구가 수행되었다. 대장균에 의한 이종 gtfC 발현을 달성하는 것은 어렵고, 이는 GTF-SI의 높은 분자량 때문에 가능성이 높다. 이 균주는 S. mutans 그의- gtfC라는 이름입니다. 야생형 S. 뮤탄스(S. 뮤탄스 WT)의 gtfC 및 스펙티노마이신 내성 유전자 카세트(spcr)7로 의 조직을 묘사한 개략적 그림과 그 유도체가 그림 1. GTF-SI는 카리오제닉 치과 용 생물막6의개발에 기여하는 분비 단백질입니다. 자당의 존재 하에, 부착 생물막은 WT S. 뮤탄스 균주에서 매끄러운 유리 표면에서 관찰되지만 S. 뮤탄스 gtfC-중단 균주(S. mutans ΔgtfC)2,5 . 생물막 형성은 재조합GTF-SI의 외인성 첨가 시 S. 뮤탄스 Δ gtfC에서 회복된다. 변형, S. 뮤탄스 그의-gtfC,다음 재조합 GTF-SI를 생산하는 데사용됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

유전자의 기능의 해명이 전형적으로 관심의 유전자가 중단된 야생 형 긴장 및 긴장의 표현형 형질의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 다음 기능의 손실은 이후에 중단된 유전자의 산물의 외인성 첨가에 의해 회복된다. 이것은 유전자의 기능을 결정하는 것을 돕습니다. 앞서 설명한 방법은 gtfC 유전자-중단된 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것을 포함한다. 여기서, 유전자 파괴 에 이어 새로 생성된 S. 뮤탄스 균주로부터 gtfC 유전자 생성물을 정제하기 위한 까다로운 방법이 기술된다. 그것은 관심있는 유전자의 3′끝에서 폴리히스티딘 코딩 서열을 첨가하는 것을 포함하며, 이는 고정 된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유전자 생성물의 간단한 정제를 허용합니다. 이 방법의 유전자 변형에는 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않습니다. 유전자 중단 후 외인성 첨가에 의한 유전자 생성물의 복원은 유전자 기능을 결정하는 효율적인 방법이며, 이는 또한 다른 종에 적용될 수 있다.

도 3은 제1 PCR(도3A)및 제2 PCR(도3B)으로부터의각 앰플리컨의 크기를 나타낸다. 각 앰플리곤의 크기는 표 1에설명된 바와 같이 예측된 크기와 일치합니다. 도 4A는 S. 뮤탄스 콜로니가 두 번째 PCR 제품으로 변형되고 스펙토마이신을 함유하는 BHI 한천 플레이트상에 도?...

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Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

이 방법은 E.Coli에서 표현하기 어려운 유전자 제품이 어떻게 정화되는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 PCR 이외의 효소 반응이 없는 담체이며 단백질 정화를 위한 일반적인 응용을 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 연쇄상 구균 뮤탄의 단백질 정제에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 다른 미생물 종에 감사 될 수있다.이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 졸업생인 야마시타 마사미코 박사가 될 것입니다. 프리머 설계 및 연쇄상 구균 뮤탄에서 유전체 DNA 추출 후, 야생 형 연쇄상 구균 뮤탄및 GFC는 PCR 템플릿으로 연쇄상 구균 뮤탄게놈을 방해하여 첫 번째 PCR을 수행합니다. gtfC 유전자의 하류 부분을 수용하는 지역과 준비된 gtfC-forward 및 역 프라이머 및 spc r-forward 및 역 프라이머를 사용하여 스펙티노마이신 저항 유전자를 수용하는 영역을 증폭시한다.이어서, 각 PCR 제품은 1%아가로즈 젤에. 젤 밴드커터를 사용하여 젤에서 약 1, 000개의 베이스 쌍및 2, 000개의 베이스 쌍을 마이크로센트심분리기 튜브로 소비합니다. 각 튜브에 용광화 버퍼 500 마이크로리터를 추가하고 젤 슬라이스를 용해시키기 위해 섭씨 56도에서 10 분 동안 배양하십시오.실리카 멤브레인 기반 젤 추출 방법을 사용하여 조각을 정화합니다. 중첩 된 방향 및 중첩 된 역 프라이머가있는 첫 번째 PCR 의 제품을 PCR 템플릿으로 사용하여 두 번째 PCR을 수행합니다. 전기 전도에 의해 두 번째 PCR 제품을 확인할 수 없는 경우 중첩 된 프라이머의 쌍을 설계해야합니다.아가로즈 젤상PCR 혼합물의 5개의 마이크로리터. 에디듐 브로마이드 겔 염색 영상에 의해 약 3, 000염기 쌍의 적절한 앰플리톤의 생성을 확인하고 원고에 따라 진행한다. 지금, 이전에 냉동 얼음 감기, 유능한 야생 형 연쇄상 구균 뮤탄 세포의 50 마이크로 리터 알로쿼트에 농축 된 제 2 PCR 제품의 5 마이크로 리터를 혼합.혼합물을 전기 기공 큐벳에 넣고 큐벳을 전기 기공 장치의 큐벳 챔버에 놓습니다. 세포에 2.5 밀리초 동안 1.8 킬로볼트, 600 옴 및 10 마이크로패라드의 단일 전기 펄스를 제공합니다. 500 마이크로리터의 뇌 심장 주입 국물을 큐벳에 넣습니다.즉시 10~100마이크로리터의 서스펜션을 스펙트럼마이신을 함유한 뇌심장 주입 오거 플레이트에 즉시 퍼집니다. 식민지가 충분히 성장 할 때까지 섭씨 37도에서 2 ~ 6 일 동안 접시를 배양하십시오. 원고에 따르면 연쇄상 구균 뮤탄의 생성 후 폴리히스티딘 코딩 서열은 4섭씨에서 10, 000배에서 20분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리하여 스펙티노마이신없이 변형및 야간 접종을 통합하였다.문화 상체를 3리터 유리 비커로 옮기습니다. 배양상에서 단백질을 농축하려면 2리터 상체를 자기 교반기위에 놓고 격렬한 교반을 시작합니다. 1, 122 그램의 황산암모늄을 추가하고 침전이 4 시간 동안 또는 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 활발한 교반으로 형성되도록합니다. 다음.심모늄 황산염 침전용액을 섭씨 4도에서 20분 동안 000배, 000배에서 원심분리합니다. 상체를 장식합니다. 주걱으로 침전물을 모아 200밀리리터 유리 비커로 옮기습니다.결합 버퍼의 35 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이어서, 현탁액의 약 25밀리리터를 재생셀룰로오스 투석 튜브로 옮기다. 투석 튜브를 교반 결합 버퍼의 2.5 리터에 넣고 섭씨 4도의 교반에 놓아 서스펜션을 투석합니다.투석 용액을 2시간 후에 교체하고 밤새 투석을 계속합니다. 다음으로 투석된 서스펜션을 튜브에서 원심분리기로 옮기고, 4°C에서 10분 동안 20, 000배 의 원심분리기에 튜브를 배치합니다. 단면 여과 장비를 사용하면 0.2 마이크로미터 멤브레인 필터 위에 상체를 부어 필터링합니다.여과물을 75밀리리터 플라스크로 옮기세요. 여과 된 서스펜션에서 폴리히스티딘 태그 gtfSI를 분수하려면 먼저 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 준비합니다. 원고에 따라 수지를 보정한 후 호프만 핀치 수탉을 닫습니다.필터된 서스펜션 5밀리리터를 컬럼에 추가하여 슬러리를 만듭니다. 그런 다음, 나머지 여과 된 서스펜션에 모든 슬러리를 전송하고 4 섭씨에서 30 분 동안 부드럽게 혼합물을 소용돌이. 혼합물을 다시 열에 로드합니다.호프만 핀치 수탉을 열어 중력 흐름에 의해 서스펜션을 제거합니다. IMAC 수지와 결합 버퍼 20 밀리리터를 세척한 다음, 용출 버퍼의 20 밀리리터를 재조합 gtfSI를 얻습니다. 그 후, 용액을 원심 울트라 여과 튜브에 넣고 용액을 1~5분 동안 2, 000배 g에서 원심분리하여 용액을 농축한다.여과 용기를 비우고 튜브에 15 밀리리터의 저장 버퍼를 추가합니다. 샘플을 다시 원심 분리하고 프로세스를 두 번 추가로 반복합니다. 재조합 gtfSI 솔루션은 마침내 약 1 밀리리터에 농축됩니다.농축액을 미세원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에 보관하십시오. 나머지 기능 복원 프로토콜을 계속 합니다. 본 프로토콜에서, 아가로즈 겔 전기포진은 제1 PCR 및 제2 PCR로부터의 각 앰플리턴의 크기가 예측된 크기에 대응하는 것을 나타낸다.연쇄상 구균 뮤탄식민지는 두 번째 PCR 제품으로 변형되었고 스펙트럼을 포함하는 뇌 심장 주입 오거 플레이트에 도금되었습니다. 아가로즈 젤에서 실행되는 콜로니 PCR 제품은 각 앰플리턴이 예측 된 크기의 것을 보여줍니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피로 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 단일 대역으로 관찰되었다.항 폴리히스티딘 항체를 사용하여 수행된 서양 블롯은 관찰된 밴드가 160킬로달톤의 폴리히스티딘 태그 단백질임을 확인했습니다. 자당 유래 생물막 형성 능력은 1%의 자당이 있는 튜브 벽에 부착된 생물막을 형성한 연쇄상 구균 뮤탄과 연쇄상 구균 뮤탄스 His-gtfC로만 볼 수 있었다. 이것은 연쇄상 구균 mutans 델타 gtfC에서 관찰되지 않았습니다.그러나, 재조합 gtfSI의 25 마이크로그램을 첨가하여 연쇄상 구균 돌연변이 델타 gtfC에서 부착된 생물막 형성 능력을 회복시켰습니다. 이 방법의 성공은 두 번째 PCR 증폭에 따라 달라지므로 두 번째 PCR 제품은 전기 전구에 의해 확인되어야합니다. 이미, 이 방법에 의해 얻어진 히스티딘 형 단백질은 단백질 단백질 상호 작용과 같은 기능성 산에 소집되고 있다.개발 후, 이 기술은 유전자 중단과 함께 미생물학 분야의 연구원들이 유전자 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

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사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em&gt; 호중구 - 활성화 단백질 과발현<em&gt; 대장균</em&gt; 배치 모드에서

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...