Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for Promotion of Science (JSP) (Grant tall 16K15860 og 19K10471 til T. M., 17K12032 til M. I., og 18K09926 til N. H.) og SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (Grant nummer 2018.09.10 nr. 1).

Merk: Generasjon S. mutans ∆gtfC, der hele kodings området av det gtfC genet er erstattet med SPCr, må være fullført før du utfører disse protokollene. Se den publiserte artikkelen for detaljer om generasjon5.
1. primer design
<ol><li>
Forbered grunning for bygging av S. mutans hans-gtfC. Merk: Primer sekvensene som brukes i denne protokollen,...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

Utformingen av grunning er det mest kritiske trinnet i protokollen. Sekvensene av gtfC-revers og SPCr-Forward primere ble automatisk bestemt basert på sekvenser av både 3 ' end regionen gtfC og 5 ' end regionen i SPCr. Hver primer inneholder 24 komplementære baser som koder en GS linker og en hans-tag-koding sekvens på sine 5 ' regioner. Forstyrrelse av de innfødte regulatoriske sekvenser ligger i oppstrøms flankerer regionene kan unngås ved tilsetning av h...

Analyse av et gen funksjon innebærer vanligvis sammenligning av fenotypiske trekk av vill-type stammer til belastninger der genet av interesse har blitt forstyrret. Når gen-forstyrret belastning er produsert, eksogene tillegg av genet produktet tillater funksjonell restaurering.
Den vanligste metoden for å skaffe renset gen produkter som kreves for påfølgende restaurering analysene er ved å utføre heterologous uttrykk i Escherichia coli1. Imidlertid er uttrykket av membran proteiner eller høy molekyl masse proteiner ofte vanskelig å bruke dette systemet1. I disse tilfellene er mål proteinet vanligvis isolert fra cellene som opprinnelig syntetiserer proteinet gjennom en komplisert serie med trinn, noe som kan føre til tap av gen produktet. For å løse disse problemene, en enkel prosedyre er utviklet for gen produkt rensing etter et gen avbrudd metode2, PCR-basert DNA skjøting metode3 (utpekt to-trinns fusjon PCR), og electroporation for genetisk transformasjon i Streptococcus mutans. Tilsetting av en polyhistidinhale tag (hans-tag) til C-Terminus av genet produktet Letter sin rensing av immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC).
For å isolere hans-tag-uttrykke belastning, hele genomisk DNA av genet av interesse (i denne His-tag-uttrykke genet-forstyrret belastning) er erstattet med en antibiotika-resistente markør genet. Prosedyren for å generere hans-tag-uttrykker strainis nesten identisk med det for å generere et gen-forstyrret belastning som beskrevet tidligere4,5. Derfor bør metodene for gen avbrudd og gen produkt isolasjon utføres som serielle eksperimenter for den funksjonelle analysen.
I dagens arbeid, en polyhistidinhale-koding sekvensen er festet til 3 ' slutten av gtfC (GenBank GEOMETRISKE tag SMU_1005) genet, koding GLUCOSYLTRANSFERASE-si (GTF-si) i S. mutans6. Deretter ble det utført uttrykks studier i en streptokokk art. Oppnå heterologous gtfC uttrykk ved E. coli er vanskelig, sannsynligvis på grunn av den høye molekylære MASSEN av GTF-si. Denne belastningen heter S. mutans hans-gtfC. En skjematisk illustrasjon som skildrer organiseringen av gtfC og spectinomycin motstands gen kassett (SPCr)7 Loci i vill-type S. mutans (s. mutans WT) og dets derivater er vist i Figur 1. GTF-SI er et sekretoriske protein som bidrar til utviklingen av cariogenic Dental biofilm6. Under tilstedeværelsen av sukrose, en tilhenger biofilm er observert på en glatt glass overflate i WT S. mutans belastning, men ikke i S. mutans gtfC-forstyrret belastning (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biofilm formasjon er gjenopprettet i S. mutans ΔgtfC upon EKSOGENE tillegg av rekombinant GTF-si. Belastningen, S. mutans hans-gtfC, brukes deretter til å produsere rekombinant GTF-si.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

Elucidation av et gen funksjon innebærer vanligvis sammenligning av fenotypiske trekk av vill-type stammer og belastninger der genet av interesse har blitt forstyrret. Tap av funksjon etter genet avbrudd er senere restaurert av eksogene tillegg av produktet av forstyrret genet. Dette bidrar til å bestemme funksjonen av genet. En metode tidligere beskrevet innebærer å generere en gtfC Gene-forstyrret Streptococcus mutans belastning. Her er en lite krevende metode som er beskrevet for rensing av gtfC Gene produktet fra den nylig genererte S. mutans stamme etter gen forstyrrelsen. Det innebærer tillegg av en polyhistidinhale-koding sekvens på 3 ' slutten av genet av interesse, som tillater enkel rensing av genet produktet ved hjelp immobilisert metall affinitet kromatografi. Ingen enzymatisk reaksjoner enn PCR er nødvendig for genetisk modifisering i denne metoden. Restaurering av genet produktet ved eksogene tillegg etter gen avbrudd er en effektiv metode for å bestemme gen funksjon, som også kan tilpasses ulike arter.

Figur 3 viser størrelsen på hver amplicon fra den første PCR (figur 3a) og andre PCR (figur 3b). Størrelsen på hver amplicon tilsvarte den anslåtte størrelsen, som beskrevet i tabell 1. Figur 4a viser S. mutans kolonier TRANSFORMERT med det andre PCR-produktet og belagt på BHI agar plater som inneholder spectinomycin. Koloni PCR-produkte...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Beskrevet her er en enkel metode for rensing av et gen produkt i Streptococcus mutans. Denne teknikken kan være fordelaktig i rensing av proteiner, spesielt membran proteiner og høy molekyl masse proteiner, og kan brukes med ulike andre bakterielle arter.

Rensing av en High Molecular Mass protein i Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i mikrobiologifeltet, for eksempel hvordan et genprodukt som er vanskelig å uttrykke i E.Coli renser. De viktigste fordelene med denne teknikken er at ingen enzymatisk reaksjon, annet enn PCR, er bæreren, og vanlige applikasjoner for proteinrensing kan brukes. Selv om denne metoden kan gi innsikt i proteinrensing i streptokokker mutaner, kan den også være en apprised til andre mikrobiotaarter.Å demonstrere prosedyren vil være Dr.Mamiko Yamashita, en gradstudent fra laboratoriet vårt. Etter primer design og genomisk DNA ekstraksjon fra streptokokker mutans, utføre den første PCR ved hjelp av vill-type streptococcus mutans og GFC forstyrret streptococcus mutans genom som PCR maler. Forsterk regionene som huser den nedstrøms delen av GTFC-genet og de som huser spectinomycinresistensgenet ved hjelp av den forberedte GTFC-fremover og omvendt primer og spc r-forward og omvendt primer.Deretter elektroforeder hvert PCR-produkt på 1% agarose gel. Bruk en gelbandcutter til å avgiftsde ønskede DNA-fragmenter av ca. 1000 basispar og 2000 basispar fra gelen til mikrocentrifugerør. Tilsett 500 mikroliter med oppløsende buffer i hvert rør og inkuber dem i 10 minutter ved 56 grader Celsius for å oppløse gelskivene.Rens fragmentene ved hjelp av silikamembranbasert gelekstraksjonsmetode. Utfør en annen PCR ved hjelp av produktene til den første PCR som PCR-maler med de nestede fremover og nestede-reverse primere. Når det andre PCR-produktet ikke kan bekreftes av elektroforese, bør et annet nestet primerpar utformes.elektroforese fem mikroliter av PCR-blandingen på agarose gel. Bekreft genereringen av riktig amplicon på ca 3000 basepar med ethidium bromid gel farging bilde og fortsett i henhold til manuskriptet. Nå blander du fem mikroliter av det konsentrerte andre PCR-produktet til 50-mikroliter aloquot av iskalde, kompetente wild-type streptococcus mutanceller, frosset tidligere.Tilsett blandingen i en elektroporasjonscuvette og legg cuvette i cuvettekammeret til elektroporasjonsapparatet. Gi en enkelt elektrisk puls på 1,8 kilovolt, 600 ohm og 10 mikrofarader for 2,5 millisekunder til cellene. Tilsett 500 mikroliter hjernehjerteinfusjonsbuljong i cuvette.Spre straks 10 til 100 mikroliter av suspensjonen på hjernehjerteinfusjonsskruerplater som inneholder spectinomycin. Inkuber platene i to til seks dager ved 37 grader Celsius til koloniene har vokst tilstrekkelig til å bli plukket opp. Etter generering av streptokokker mutans polyhistidin koding sekvens innlemmet belastning og overnatting inokulasjon uten spectinomycin i henhold til manuskriptet, sentrifugere bakteriell kultur suspensjon i 20 minutter på 10,000 ganger g ved fire grader Celsius.Overfør kulturen overnaturlig til et tre-liters glassbeger. For å konsentrere proteinene fra kulturen supernatant, legg to liters supernatant på en magnetisk rører og begynn kraftig omrøring. Tilsett 1, 122 gram ammoniumsulfat og la bunnsmontet dannes med kraftig omrøring ved fire grader Celsius over en fire-timers periode eller over natten. Neste.sentrifuge ammoniumsulfatutfelt oppløsning ved 15.000 ganger g i 20 minutter ved fire grader Celsius. Dekanter det overnaturlige. Med en slikkepott, samle utløsning og overføre den til en 200-milliliter glassbeger.Resuspend pellets i 35 milliliter bindingbuffer. Deretter overfører du hver ca 25 milliliter av suspensjonen til en regenerert cellulosedialyserør. Plasser dialyseslangen i 2,5 liter av rørebindingsbufferen på en røre ved fire grader Celsius for å dialyze suspensjonen.Bytt dialyseløsningen etter to timer og fortsett dialyse over natten. Deretter overfører dialysed suspensjon fra slangen til sentrifuge rør og plasser rørene i sentrifuge på 20, 000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Med seksjon filtrering utstyr, hell supernatant over en 0,2-mikrometer membran filter for å filtrere.Overfør filtratet til en 75-milliliter kolbe. For å fraksjonere polyhistidin-merket gtfSI fra den filtrated suspensjon, først forberede en immobilisert metall affinitet kromatografi. Etter å ha likevektig harpiksen i henhold til manuskriptet, lukk Hoffman klype kuk.Legg til fem milliliter av den filtrerte suspensjonen i kolonnen for å lage en slurry. Deretter overfører du all slurry til gjenværende filtrert suspensjon og virvler blandingen forsiktig i 30 minutter ved fire grader Celsius. Legg blandingen tilbake i kolonnen.Åpne Hoffman klype kuk for å fjerne suspensjonen ved tyngdekraften flyten. Vask IMAC-harpiksen med 20 milliliter bindingsbuffer, og elute deretter 20 milliliter elutionbuffer for å oppnå rekombinant gtfSI. Deretter laster du eluatet inn i et sentrifugal ultrafiltreringsrør og sentrifugerer løsningen på 2000 ganger g i ett til fem minutter for å konsentrere løsningen.Tøm filtratbeholderen og tilsett 15 milliliter lagringsbuffer i røret. Sentrifuger prøven igjen og gjenta prosessen to ganger til. Den rekombinante gtfSI-løsningen er endelig konsentrert til ca. en milliliter.Overfør konsentratet til et mikrocentrifugerør og oppbevar ved fire grader Celsius. Fortsett med resten funksjonell restaureringsprotokoll. I denne protokollen viser agarose gel elektroforese at størrelsen på hver amplicon fra den første PCR og den andre PCR korresponderte med den forventede størrelsen.Streptococcus mutans kolonier ble forvandlet med det andre PCR-produktet og belagt på hjerne-hjerte infusjon auger plater som inneholder spectinomycin. Koloni PCR produkter kjører på agarose gel viser at hver amplicon var av den forventede størrelsen. Protein renset med immobilisert metall affinitet kromatografi ble observert som et enkelt bånd av SDS-PAGE.Vestlig flekk, utført ved hjelp av anti-polyhistidin antistoff, bekreftet at det observerte bandet var det forventede polyhistidin-merkede proteinet på 160 kilodaltonn. Den sukrose-avledede biofilmformingsevnen ble bare sett med streptokokker mutans villtype og streptokokker mutans His-gtfC, som dannet en tilhenger biofilm på rørveggen i nærvær av 1% sukrose. Dette ble ikke observert i streptokokker mutans delta gtfC.Imidlertid gjenopprettet tillegg av 25 mikrogram av rekombinant gtfSI tilhengerbiofilmformasjonsevnen i streptokokker mutans delta gtfC. Siden suksessen til denne metoden avhenger av den andre PCR-forsterkningen, må det andre PCR-produktet bekreftes av elektroforese. Allerede, histidin-type protein oppnådd ved denne metoden er også innkalling til funksjonelle syrer, som protein-protein interaksjoner.Etter utviklingen banet denne teknikken, i kombinasjon med genforstyrrelser, veien for forskere innen mikrobiologi for å utforske genfunksjonen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastsettelse av Molecular Structures av HIV Konvolutt glykoproteiner bruker Cryo-Electron Tomography og Automated Sub-tomogram gjennomsnitt

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totalt Protein Extraction og 2-D-gel-elektroforese Metoder<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Overvåking Endringer i Membrane polaritet, Membran Integrity, og intracellulær ionekonsentrasjoner i<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Ved hjelp av fluorescerende fargestoffer

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rensing av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites For bruk i Opsonizing Antistoff Analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasiv Imaging av det medfødte immunrespons i en Sebrafisk Larve Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infeksjon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Ett-trinns Negativ kromatografiske rensing i<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende Protein overuttrykkes i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification fra intracellulært Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En Murine modell av gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...