Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) (números de subvenção 16K15860 e 19K10471 para T. M., 17K12032 a M. I., e 18K09926 a N. H.) e a Fundação de ciência e tecnologia da SECOM (SECOM) (número de subvenção 2018.09.10 n º 1).

Nota: Geração de S. mutans ∆gtfc, em que toda a região codificadora do gene gtfc é substituída por SPCr, deve ser completada antes da realização desses protocolos. Consulte o artigo publicado para obter detalhes sobre a geração5.
1. projeto da primeira demão
<ol><li>
Prepare primers para a construção de S. mutans his-gtfc. Nota: As sequ?...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

O projeto de primers é o passo mais crítico do protocolo. As sequências dos primers gtfc-Reverse e SPCr-Forward foram automaticamente determinadas com base nas sequências da região final de 3 ′ do gtfc e da região final de 5 ′ do SPCr. Cada primer inclui 24 bases complementares que codificam um vinculador GS e uma sequência de codificação his-tag em suas 5 ' regiões. O rompimento das seqüências reguladoras nativas situadas nas regiões flanqueando ...

A análise de um gene ' a função de s envolve geralmente a comparação de traços fenotípicos de estirpes do selvagem-tipo às tensões em que o gene do interesse foi interrompido. Uma vez que a estirpe de gene-disrupted é produzida, a adição exógena do produto do gene permite a restauração funcional.
O método mais comum para a obtenção de produtos gênicos purificados necessários para os ensaios subsequentes de restauração é a realização de expressão heteróloga em Escherichia coli1. No entanto, a expressão de proteínas de membrana ou proteínas de alta massa molecular é muitas vezes difícil usando este sistema1. Nestes casos, a proteína alvo é geralmente isolada das células que sintetiza nativamente a proteína através de uma série complexa de etapas, o que pode levar à perda do produto genético. Para superar estas edições, um procedimento simples foi desenvolvido para a purificação do produto do gene que segue um método2do rompimento do gene, método de emenda PCR-baseado do ADN3 (PCR designado da fusão da dois-etapa), e Electroporation para genético transformação em Streptococcus mutans. A adição de uma etiqueta do polyhistidine (His-tag) ao C-Terminus do produto do gene facilita sua purificação pela cromatografia de afinidade imobilizada do metal (IMAC).
Para isolar a estirpe his-tag-expressando, o ADN genomic inteiro do gene do interesse (neste seu-Tag-expressando a tensão gene-disrupted) é substituído com um gene antibiótico-resistente do marcador. O procedimento para gerar o seu-Tag-expressando strainis quase idêntico àquele para gerar uma tensão gene-interrompida como descrita previamente4,5. Conseqüentemente, os métodos para o rompimento do gene e o isolamento do produto do gene devem ser executados como experimentos seriais para a análise funcional.
No presente trabalho, uma seqüência de codificação de polihistidina é anexada à extremidade 3 ′ do gene Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-si (GTF-si) em S. mutans6. Em seguida, foram realizados estudos de expressão em espécie estreptocócica. Conseguir a expressão heterólogo de gtfc por E. coli é difícil, provável por causa da massa molecular elevada de GTF-si. Esta estirpe chama-se S. mutans his-gtfc. Uma ilustração esquemática que descreve a organização da gaveta do gene da resistência de gtfc e de espectinomicina (SPCr)7 loci em Wild-Type s. mutans (s. mutans WT) e seus derivados é mostrado em Figura 1. O GTF-SI é uma proteína secretora que contribui para o desenvolvimento do biofilme dental cariogênico6. a presença de sacarose, um biofilme aderente é observado em uma superfície de vidro liso na estirpe de WT s. mutans , mas não na estirpe de s. mutans gtfc-disrupted (s. mutans Δgtfc)2,5 . A formação de biofilme é restaurada em S. mutans Δgtfc após adição exógena do GTF-si recombinante. A cepa, S. mutans his-gtfc, é então usada para produzir o GTF-si recombinante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

O elucidation da função de um gene envolve tipicamente a comparação de traços fenotípicos de estirpes e de tensões do selvagem-tipo em que o gene do interesse foi interrompido. A perda da função que segue o rompimento do gene é restaurada subseqüentemente pela adição exógena do produto do gene interrompido. Isso ajuda a determinar a função do gene. Um método descrito anteriormente envolve a geração de uma cepa de Streptococcus mutans com ruptura de gene gtfc . Aqui, um método não exigente é descrito para purificar o produto do gene Gtfc da estirpe de S. mutans recém-gerada após o rompimento do gene. Envolve a adição de uma seqüência da polyhistidine-Coding na extremidade 3 do ′ do gene do interesse, que permite a purificação simples do produto do gene usando a cromatografia de afinidade imobilizada do metal. Não são necessárias reações enzimáticas para além da PCR para a modificação genética neste método. A restauração do produto genético por adição exógena após o rompimento genético é um método eficiente para determinar a função gênica, que também pode ser adaptada a diferentes espécies.

A Figura 3 mostra o tamanho de cada amplicon a partir da primeira PCR (Figura 3a) e da segunda PCR (Figura 3B). O tamanho de cada amplicon correspondeu ao tamanho previsto, conforme descrito na tabela 1. A figura 4a mostra S. as colônias de mutans transformadas com o segundo produto do PCR e chapearam nas placas do agar de BHI que contêm o spe...

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Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia, como, como um produto genético difícil de expressar em E.Coli purifica. As principais vantagens dessa técnica são que nenhuma reação enzimática, além do PCR, é o portador, e aplicações comuns para purificação de proteínas podem ser usadas. Embora este método possa fornecer uma visão sobre a purificação de proteínas em estreptococos mutans, também pode ser um informado para outras espécies de microbiota.Demonstrando o procedimento será o Dr.Mamiko Yamashita, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Após o projeto de primer e extração genômica de DNA de estreptococo mutans, realize o primeiro PCR usando o estreptococo mutans do tipo selvagem e o genoma de estreptococos rompidos como os modelos PCR. Amplie as regiões que abrigam a parte a jusante do gene gtfC e aquelas que abrigam o gene de resistência à especttinomicina usando o gtfC-forward preparado e o primer reverso e o primer spc r-forward e reverso.Em seguida, eletroforese cada produto PCR em gel de 1%agarose. Use um cortador de banda de gel para extirpa os fragmentos de DNA desejados de aproximadamente 1.000 pares de base e 2.000 pares de base do gel em tubos de microcentrifuuge. Adicione 500 microliters de tampão solubilizador em cada tubo e incuba-os por 10 minutos a 56 graus Celsius para dissolver as fatias de gel.Purifique os fragmentos usando o método de extração de gel à base de membrana de sílica. Execute um segundo PCR usando os produtos do primeiro PCR como modelos PCR com os primers aninhados e invertidos aninhados. Quando o segundo produto PCR não pode ser confirmado por eletroforese, outro par de primer aninhado deve ser projetado.eletroforese cinco microlitres da mistura PCR no gel de agarose. Confirme a geração do amplicon apropriado de aproximadamente 3.000 pares de base pela imagem de coloração de gel de brometo de ethidium e prossiga de acordo com o manuscrito. Agora, misture cinco microliters do segundo produto PCR concentrado ao aloquot de 50 microliteres de células de estreptococos de frio e frio e competente, congeladas anteriormente.Adicione a mistura em uma cuvette de eletroporação e coloque a cuvette na câmara de cuvette do aparelho de eletroporação. Dê um único pulso elétrico de 1,8 quilovolts, 600 ohms e 10 microfarádis por 2,5 milissegundos para as células. Adicione 500 microliters de caldo de infusão cérebro-coração na cuvette.Espalhe imediatamente de 10 a 100 microlitadores da suspensão em placas de infusão cérebro-coração contendo espectincina. Incubar as placas por dois a seis dias a 37 graus Celsius até que as colônias tenham crescido o suficiente para serem recolhidas. Após a geração de estreptococo mutans sequência de codificação de polihistidina incorporada tensão e inoculação durante a noite sem espectinomicina de acordo com o manuscrito, centrífuga a suspensão da cultura bacteriana por 20 minutos a 10.000 vezes g a quatro graus Celsius.Transfira a cultura supernante para um copo de vidro de três litros. Para concentrar as proteínas da cultura supernasteante, coloque o supernanato de dois litros em um agitador magnético e comece a mexer vigorosamente. Adicione 1.122 gramas de sulfato de amônio e deixe que o precipitado se forme com agitação vigorosa a quatro graus Celsius durante um período de quatro horas ou durante a noite. Próximo.centrífugas a solução precipitada de sulfato de amônio a 15.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o supernatante. Com uma espátula, pegue o precipitado e transfira-o para um copo de vidro de 200 mililitros.Resuspenda as pelotas em 35 mililitros de tampão de ligação. Em seguida, transfira cada um aproximadamente 25 mililitros da suspensão para um tubo de diálise de celulose regenerada. Coloque a tubulação de diálise em 2,5 litros do amortecedor de ligação em um agitador a quatro graus Celsius para dilisar a suspensão.Substitua a solução de diálise após duas horas e continue a diálise durante a noite. Em seguida, transfira a suspensão dialisada da tubulação para tubos de centrífuga e coloque os tubos na centrífuga a 20.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Com o equipamento de filtragem da seção, despeje o supernascer sobre um filtro de membrana de 0,2 micrômetro para filtrar.Transfira o filtrado para um frasco de 75 mililitros. Para fracionar o gtfSI marcado por polihistidina da suspensão filtrada, primeiro prepare uma cromatografia de afinidade metálica imobilizada. Depois de equilibrar a resina de acordo com o manuscrito, feche o pau de beliscar Hoffman.Adicione cinco mililitros da suspensão filtrada na coluna para fazer um chorume. Em seguida, transfira todo o chorume para a suspensão filtrada restante e gire a mistura suavemente por 30 minutos a quatro graus Celsius. Coloque a mistura de volta na coluna.Abra o pau de beliscar Hoffman para remover a suspensão pelo fluxo de gravidade. Lave a resina IMAC com 20 mililitros de tampão de ligação e, em seguida, elute 20 mililitros de tampão de elução para obter o gtfSI recombinante. Depois disso, carregue o eluato em um tubo de ultra filtração centrífugas e centrifugar a solução a 2.000 vezes g por um a cinco minutos para concentrar a solução.Esvazie o recipiente de filtragem e adicione 15 mililitros de tampão de armazenamento no tubo. Centrifugar a amostra novamente e repetir o processo duas vezes adicionais. A solução gtfSI recombinante está finalmente concentrada em aproximadamente um mililitro.Transfira o concentrado para um tubo de microcentrifuagem e armazene a quatro graus Celsius. Continue com o protocolo de restauração funcional restante. Neste protocolo, a eletroforese do gel agarose mostra que o tamanho de cada amplicon do primeiro PCR e do segundo PCR correspondia ao tamanho previsto.As colônias de estreptococos mutans foram transformadas com o segundo produto PCR e banhadas nas placas de infusão cérebro-coração que continham espectinicina. Os produtos de PCR colônia executados no gel de agarose mostram que cada amplicon era do tamanho previsto. A proteína purificada com cromatografia de afinidade metálica imobilizada foi observada como uma única banda pela SDS-PAGE.A mancha ocidental, executada usando o anticorpo anti-polihistidina, confirmou que a banda observada era a proteína esperada com marca de polihistidina de 160 kilodaltons. A capacidade de formação de biofilme derivado da sacarose só foi vista com estreptococo mutans do tipo selvagem e estreptococo mutans His-gtfC, que formou um biofilme aderente na parede do tubo na presença de 1% de sacarose. Isso não foi observado em estreptococos mutans delta gtfC.No entanto, a adição de 25 microgramas do gtfSI recombinante restaurou a capacidade de formação de biofilme aderente em estreptococo mutans delta gtfC. Uma vez que o sucesso deste método depende da segunda amplificação pcr, o segundo produto PCR deve ser confirmado por eletroforese. Já a proteína do tipo histidina obtida por este método também está se reunindo para ácidos funcionais, como interações proteína-proteína.Após seu desenvolvimento, essa técnica, em combinação com a disrupção genética, abriu caminho para pesquisadores do campo da microbiologia explorarem a função genética.

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Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando corantes fluorescentes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em Modo Batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...