Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) (гранты 16K15860 и 19K10471 до Т. М., 17K12032 до М. И., и 18K09926 н. Х.) и SECOM Научно-технический фонд (SECOM) (грант No 2018.09.

ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение S. mutans sgtfC, в котором вся область кодирования гена gtfC заменяется spcr, должна быть завершена до выполнения этих протоколов. Обратитесь к опубликованной статье для получения подробной информации о поколении5.
<p class="jove_tit...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

Конструкция грунтовок является наиболее важным шагом в протоколе. Последовательности gtfC-обратнойи spcr-forwardпраймеры были автоматически определены на основе последовательностей как 3 "конец области gtfC и 5" конец области spcr. Каждый праймер включает в себя 24 д...

Анализ функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа с штаммами, в которых ген интереса был нарушен. Как только ген-нарушенный напряжение произведено, экзогенное добавление продукта гена позволяет функциональное восстановление.
Наиболее распространенным методом получения очищенных генных продуктов, необходимых для последующего восстановления анализов является выполнение гетерологического выражения в Escherichia coli1. Однако, выражение мембранных белков или белков высокой молекулярной массы часто трудно использовать эту систему1. В этих случаях, целевой белок, как правило, изолированы из клеток, которые родно синтезирует белок через комплекс ряд шагов, которые могут привести к потере генного продукта. Чтобы преодолеть эти проблемы, простая процедура была разработана для очистки генного продукта после метода нарушения гена2,ПЦР на основе метода сращивания ДНК3 (обозначенный двухступенчатый фьюжн ПЦР), и электропорации для генетической преобразование в Streptococcus mutans. Добавление тега полихистидина (His-tag) к C-термину с генным продуктом облегчает его очистку путем обездвижения хроматографии сродства металла (IMAC).
Чтобы изолировать его-тег-выражение штамма, вся геномная ДНК гена интереса (в этом Его-тег-выражение гена нарушенных штамма) заменяется антибиотикорезистентный маркер гена. Процедура для генерации Его-тег-выражение strainis почти идентичны, что для генерации гена нарушенных штамма, как описано ранее4,5. Поэтому методы нарушения генов и изоляции генного продукта должны выполняться в качестве последовательных экспериментов для функционального анализа.
В настоящей работе, последовательность политистидина-кодирования прилагается к 3 "конец gtfC (GenBank локус тег SMU-1005) ген, кодирование glucosyltransferase-SI (GTF-SI) в S. mutans6. Затем были проведены экспрессионные исследования стрептококковых видов. Достижение гетерологичного выражения gtfC E. coli затруднено, вероятно, из-за высокой молекулярной массы GTF-SI. Этот штамм называется S. mutans His-gtfC. Схематическая иллюстрация, изображающая организацию кассеты гена gtfC и spectomycin resistance(spcr)7 локусов в диком типе S. mutans (S. mutans WT) и его производных показана в Рисунок 1. GTF-SI является секреторным белком, который способствует развитию кариогенной стоматологической биопленки6. При наличии сахарозы, адепт биопленка наблюдается на гладкой стеклянной поверхности в WT S. mutans штамма, но не в S. mutans gtfC-нарушенныйштамм (S. mutans s gtfC)2,5 . Формирование биопленки восстанавливается в S. mutans sgtfC при экзогенном добавлении рекомбинантного GTF-SI. Штамм, S. mutans His-gtfC, затем используется для производства рекомбинантных GTF-SI.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

Разочаивание функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа и штаммов, в которых ген интереса был нарушен. Потеря функции после нарушения гена впоследствии восстанавливается экзогенным добавлением продукта нарушенного гена. Это помогает определить функцию гена. Метод, описанный ранее включает в себя генерацию gtfC гена нарушенных Streptococcus мутанов штамма. Здесь описан нетребовательный метод для очистки генного продукта gtfC от недавно сгенерированного штамма S. mutans после нарушения гена. Она включает в себя добавление последовательность полихиститидина кодирования на 3 "конец гена интереса, что позволяет простой очистки гена продукта с использованием иммобилизованных хроматографии сродства металла. Для генетической модификации этого метода не требуется никаких ферментативных реакций, кроме ПЦР. Восстановление генного продукта путем экзогенного добавления после нарушения гена является эффективным методом определения функции гена, который также может быть адаптирован к различным видам.

На рисунке 3 показан размер каждого ампромтона от первого ПЦР(рисунок 3A)и второго ПЦР(рисунок 3B). Размер каждого амблона соответствовал прогнозируемому размеру, как описано в таблице 1. На рисунке 4A</str...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Описан опростываемый здесь простой метод очистки генного продукта в Streptococcus mutans. Этот метод может быть выгодным в очищении белков, особенно мембранных белков и белков высокой молекулярной массы, и может быть использован с различными другими бактериальными видами.

Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как, как генный продукт, который трудно выразить в E.Coli очищается. Основными преимуществами этого метода является то, что никакая энзиматическая реакция, кроме ПЦР, не является носителем, и общие приложения для очистки белка могут быть использованы. Хотя этот метод может обеспечить понимание очистки белка в стрептококковых мутанов, он также может быть проинформирован о других видов микробиоты.Демонстрация процедуры будет д-р Мамико Ямасита, аспирант из нашей лаборатории. После грунтовки дизайна и геномной извлечения ДНК из стрептококковых мутанов, выполните первый ПЦР с использованием стрептококкового мутана дикого типа и GFC нарушенного генома стрептококка мутанов в качестве шаблонов ПЦР. Усилить регионов укрывательство вниз по течению часть гена gtfC и тех, укрывательство спектромицина сопротивления гена с помощью подготовленных gtfC-вперед и обратной грунтовки и spc R-вперед и обратной грунтовки.Затем, электрофорез каждого продукта ПЦР на 1%agarose гель. Используйте гелеобразуя, чтобы вырезать желаемые фрагменты ДНК примерно 1000 пар основания и 2000 базовых пар из геля в микроцентрифуг трубки. Добавьте 500 микролитров solubilizing буфера в каждую трубку и инкубировать их в течение 10 минут при 56 градусах по Цельсию, чтобы растворить ломтики геля.Очистить фрагменты с помощью кремнезема мембраны на основе метода извлечения геля. Выполните второй ПЦР, используя продукты первого ПЦР в качестве шаблонов ПЦР с вложенными вперед и вложенными реверсами. Когда второй продукт ПЦР не может быть подтвержден электрофорезом, должна быть разработана другая вложенная грунтовка.электрофорезе пять микролитров смеси ПЦР на агарозовом геле. Подтвердите генерацию соответствующего ампликона из примерно 3000 базовых пар изображением окрашивания бромистого геля этидия и продолжайте в соответствии с рукописью. Теперь смешайте пять микролитров концентрированного второго продукта ПЦР с 50-микролитровой алоцитой ледяных, компетентных клеток стрептококка дикого типа, замороженных ранее.Добавьте смесь в куветт электропорации и поместите кюветт в камеру cuvette аппарата электропорации. Дайте одному электрическому импульсу 1,8 киловольты, 600 ом и 10 микрофарадов в течение 2,5 миллисекунд к клеткам. Добавьте в куветт 500 микролитров бульона для инфузии головного сердца.Сразу же распространение от 10 до 100 микролитров подвески на мозг сердца инфузии овека пластин, содержащих спектромицин. Инкубировать пластины в течение двух-шести дней при 37 градусах по Цельсию, пока колонии выросли достаточно, чтобы быть подобраны. После генерации стрептококка мутанов полихистидин кодирования последовательности включены штамма и ночной прививки без спектромицина в соответствии с рукописью, центрифуга бактериальной культуры подвески в течение 20 минут при 10000 раз г при четырех градусах по Цельсию.Перенесите культурный супернатант в трехлитровый стеклянный стакан. Чтобы сконцентрировать белки из культурного супернатанта, поместите двухлитровый супернатант на магнитный мешалку и начните энергичное перемешивание. Добавьте 1, 122 грамма сульфата аммония и дайте осадку сформироваться с энергичным перемешиванием при четырех градусах Цельсия в течение четырех часов или на ночь. Следующий.центрифуга сульфата аммония осаждается раствор при 15 000 раз г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Декант супернатант. С помощью шпателя соберите осадок и перенесите его в стеклянный стакан на 200 миллилитров.Повторное производство гранул в 35 миллилитров связывающего буфера. Затем перенесите каждый примерно 25 миллилитров суспензии в регенерированный целлюлозный диализ. Поместите диализную трубку в 2,5 литра перемешивающего буфера на мешалки при четырех градусах по Цельсию, чтобы облизать подвеску.Замените раствор диализа через два часа и продолжайте диализ на ночь. Затем перенесите диалированную суспензию из трубки в центрифуги и поместите трубки в центрифугу при 20 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью оборудования для фильтрации секций залейте супернатант 0,2-микрометровым мембранным фильтром для фильтрации.Перенесите фильтрат в 75-миллилитровую колбу. Чтобы фракционировать полихистидин-тегом gtfSI из фильтровательной подвески, сначала подготовить иммобилизованный металл сродства хроматографии. После равновесия смолы в соответствии с рукописью, закрыть Хоффман щепотку петух.Добавьте пять миллилитров фильтрованной подвески в столбец, чтобы сделать суспензию. Затем перенесите всю суспензию на оставшуюся фильтрованную подвеску и осторожно закружить смесь в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Загрузите смесь обратно в столбец.Откройте Hoffman щепотку петух, чтобы удалить подвеску гравитационным потоком. Вымойте смолу IMAC с 20 миллилитров связывающего буфера, а затем, elute 20 миллилитров элюционного буфера для получения рекомбинантного gtfSI. После этого загрузите элуат в центробежную ультрафильтральную трубку и центрифугайте раствор 2000 раз г в течение одной-пяти минут, чтобы сконцентрировать раствор.Освободите фильтратный контейнер и добавьте в трубку 15 миллилитров буфера хранения. Центрифугировать образец снова и повторить процесс еще два раза. Рекомбинантный раствор gtfSI, наконец, концентрируется примерно до одного миллилитра.Перенесите концентрат в трубку микроцентрифуга и храните при четырех градусах Цельсия. Продолжить с остальным функциональным протоколом восстановления. В этом протоколе электрофорез агарозного геля показывает, что размер каждого ампликона от первого ПЦР и второго ПЦР соответствовал прогнозируемому размеру.Колонии стрептококковых мутанов были преобразованы со вторым продуктом ПЦР и покрыны на пластинах инфузионных овсяных пластин мозга, содержащих спектромицин. Колония ПЦР продукты работают на агарозный гель показывает, что каждый amplicon был предсказанного размера. Белок, очищенный от иммобилизованной хроматографии сродства металла, был замечен как единая полоса SDS-PAGE.Западная помарка, выполненная с использованием анти-полихистидина антитела, подтвердила, что наблюдаемая полоса была ожидаемым полинистидин-помеченным белком 160 килодалтонов. Биопленка, полученная из сахарозы, была замечена только со стрептококком мутанов дикого типа и стрептококковыми мутанами His-gtfC, которые образовывались на стенке трубки в присутствии 1% сахарозы. Этого не наблюдалось в стрептококке mutans delta gtfC.Однако добавление 25 микрограммов рекомбинантного gtfSI восстановило способность адептиента к формированию биопленки в стрептококке mutans delta gtfC. Поскольку успех этого метода зависит от второго усиления ПЦР, второй продукт ПЦР должен быть подтвержден электрофорезом. Уже, гистидин типа белка, полученного с помощью этого метода также созыва функциональных кислот, таких как белково-белковые взаимодействия.После своего развития, этот метод, в сочетании с нарушением гена, проложил путь для исследователей в области микробиологии, чтобы исследовать функцию генов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Живая изображений Ячейка Сенная Bacillus И Пневмококк С использованием средства аварийного Покадровый микроскопии

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Всего экстракции белка и 2-D электрофореза в геле Методы<em&gt; Burkholderia</em&gt; Вид

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Мониторинг изменения мембранного полярность, мембраны целостности и внутриклеточных концентрации ионов в<em&gt; Пневмококк</em&gt; Использование флуоресцентных красителей

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Высокая доходность Очистка<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; Мерозоиты для использования в Opsonizing антитела анализы

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Неинвазивная Визуализация врожденного иммунного ответа в данио рерио личинок модели<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Инфекция

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em&gt; Хеликобактерной</em&gt; Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; В пакетном режиме

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

РНК Очистка от внутриклеточно Grown<em&gt; листерий</em&gt; В клетках макрофагальной

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Мышиной модели группы B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Вагинальный Колонизация

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...