Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (números de concesión 16K15860 y 19K10471 a T. M., 17K12032 a M. I., y 18K9926 a N. H.) y la Fundación de Ciencia y Tecnología SECOM (SECOM) (número de concesión 2018.09.10 No. 1).

NOTA: La generación de S. mutans gt-fC, en la que toda la región de codificación del gen gtfC se sustituye por spcr, debe completarse antes de realizar estos protocolos. Consulte el artículo publicado para obtener más información sobre la generación5.
1. Diseño de imprimación
<ol><li>
Preparar imprimaciones para la construcción de S. mutans His-gtfC. <strong...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. 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(128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

El diseño de imprimadores es el paso más crítico en el protocolo. Las secuencias de las imprimaciones gtfC-reverse y spcr-forward se determinaron automáticamente en función de las secuencias de la región final de 3o de gtfC y de la región final de 5o de spcr. Cada imprimación incluye 24 bases complementarias que codifican un vinculador GS y una secuencia de codificación His-tag en sus regiones de 5'. La interrupción de las secuencias reglamentarias nativ...

El análisis de la función de un gen generalmente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas de tipo salvaje con cepas en las que el gen de interés se ha interrumpido. Una vez producida la cepa interrumpida por genes, la adición exógena del producto genético permite la restauración funcional.
El método más común para obtener productos genéticos purificados necesarios para ensayos de restauración posteriores es mediante la realización de expresiones hetólogas en Escherichia coli1. Sin embargo, la expresión de proteínas de membrana o proteínas de alta masa molecular es a menudo difícil utilizando este sistema1. En estos casos, la proteína diana generalmente se aísla de las células que sintetiza la proteína de forma nativa a través de una serie compleja de pasos, que pueden conducir a la pérdida del producto genético. Para superar estos problemas, se ha desarrollado un procedimiento sencillo para la purificación de productos genéticos siguiendo un método de interrupción genética2,el método de empalme de ADN basado en PCR3 (designado PCR de fusión en dos pasos) y la electroporación para la genética transformación en Streptococcus mutans. La adición de una etiqueta de polihistidina (su etiqueta) a la terminal C del producto genético facilita su purificación mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC).
Para aislar la cepa que expresa su etiqueta, todo el ADN genómico del gen de interés (en esta cepa interrumpida genéticamente his-tag-expressing) se reemplaza por un gen marcador resistente a los antibióticos. El procedimiento para generar la cepa His-tag-expressing es casi idéntico al de generar una cepa interrumpida genéticamente como se describió anteriormente4,5. Por lo tanto, los métodos para la interrupción genética y el aislamiento de productos genéticos deben realizarse como experimentos en serie para el análisis funcional.
En el presente trabajo, se adjunta una secuencia de codificación de polihistidina al extremo de 3o del gen gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosiltransferasa-SI (GTF-SI) en S. mutans6. Luego, se realizaron estudios de expresión en una especie estreptocócica. Lograr la expresión heterotróloga de gtfC por E. coli es difícil, probablemente debido a la alta masa molecular de GTF-SI. Esta variedad se llama S. mutans His-gtfC. Una ilustración esquemática que representa la organización del casete genético de resistencia a gtfC y espectromicina (spcr)7 loci en sándalo S. mutans (S. mutans WT) y sus derivados se muestra en Figura 1. El GTF-SI es una proteína secretor que contribuye al desarrollo de biofilm dental cariogénico6. Bajo la presencia de sacarosa, se observa una biopelícula adherente en una superficie de vidrio liso en la cepa WT S. mutans pero no en la cepa interrumpida de S. mutans gtfC(S. mutans ágtfC)2,5 . La formación de biopelículas se restaura en S. mutans ágtfC tras la adición exógena del GTF-SI recombinante. La cepa, S. mutans His-gtfC, se utiliza para producir el GTF-SI recombinante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

El esclarecimiento de la función de un gen típicamente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas y cepas de tipo salvaje en las que el gen de interés se ha interrumpido. La pérdida de la función después de la interrupción del gen se restaura posteriormente mediante la adición exógena del producto del gen alterado. Esto ayuda a determinar la función del gen. Un método descrito anteriormente implica la generación de una cepa de Streptococcus mutans interrumpida por el gen gtfC. Aquí, se describe un método poco exigente para purificar el producto del gen gtfC de la cepa s. mutans recién generada después de la interrupción del gen. Implica la adición de una secuencia de codificación de polihistidina en el extremo de 3o del gen de interés, que permite una simple purificación del producto genético mediante cromatografía de afinidad de metalinmovilizado. No se requieren reacciones enzimáticas que no sean PCR para la modificación genética en este método. La restauración del producto genético por adición exógena después de la interrupción del gen es un método eficaz para determinar la función génica, que también puede adaptarse a diferentes especies.

El cuadro 3 muestra el tamaño de cada amplicon del primer PCR(figura 3A)y del segundo PCR(figura 3B). El tamaño de cada amplificador correspondió al tamaño pronosticado, como se describe en el Cuadro 1. La Figura 4A muestra las colonias de S. mutans transformadas con el segundo producto PCR y chapadas en las placas de agar BHI que contienen ...

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Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Aquí se describe un método simple para la purificación de un producto genético en Streptococcus mutans. Esta técnica puede ser ventajosa en la purificación de proteínas, especialmente proteínas de membrana y proteínas de alta masa molecular, y se puede utilizar con varias otras especies bacterianas.

Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, tales como, cómo un producto genético que es difícil de expresar en E. coli purifica. Las principales ventajas de esta técnica son que ninguna reacción enzimática, aparte de la PCR, es el portador, y se pueden utilizar aplicaciones comunes para la purificación de proteínas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la purificación de proteínas en estreptococos mutanos, también puede ser un informado de otras especies de microbiota.Demostrando el procedimiento estará el Dr.Mamiko Yamashita, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Después del diseño de imprimación y la extracción de ADN genómico de estreptococos mutans, realice la primera PCR utilizando el estreptococo mutans de tipo salvaje y GFC interrumpió el estreptococo mutan genoma como las plantillas de PCR. Amplificar las regiones que albergan la parte aguas abajo del gen gtfC y las que albergan el gen de resistencia a la espectinomicina utilizando la imprimación gtfC hacia adelante y hacia atrás preparada y la imprimación r-forward y reverse de 200.A continuación, electrofores y cada producto PCR en gel de 1% de agarosa. Utilice un cortador de bandas de gel para extirpar los fragmentos de ADN deseados de aproximadamente 1.000 pares de bases y 2.000 pares de bases del gel en tubos de microcentrífuga. Añadir 500 microlitros de tampón solubilizante en cada tubo e incubarlos durante 10 minutos a 56 grados Celsius para disolver las rodajas de gel.Purificar los fragmentos utilizando el método de extracción de gel a base de membrana de sílice. Realice un segundo PCR utilizando los productos del primer PCR como plantillas de PCR con las imprimaciones anidadas hacia adelante y anóteles.reverse. Cuando el segundo producto PCR no puede ser confirmado por electroforesis, se debe diseñar otro par de imprimación anidada.electroforos cinco microlitros de la mezcla de PCR en el gel de agarosa. Confirme la generación del amplicon adecuado de aproximadamente 3.000 pares base mediante la imagen de tinción de gel de bromuro de etidio y proceda según el manuscrito. Ahora, mezcle cinco microlitros del segundo producto PCR concentrado en la aloculinación de 50 microlitros de células de estreptococo mutan de tipo silvestre competentes, congeladas previamente.Agregue la mezcla en una cubeta de electroporación y coloque la cubeta en la cámara de la cubeta del aparato de electroporación. Dar un solo pulso eléctrico de 1,8 kilovoltas, 600 ohmios y 10 microfaradios durante 2,5 milisegundos a las células. Agregue 500 microlitros de caldo de infusión cerebro-corazón en la cubeta.Extienda inmediatamente de 10 a 100 microlitros de la suspensión sobre placas de sinfín de infusión cerebral-corazón que contienen espectinomicina. Incubar las placas durante dos a seis días a 37 grados centígrados hasta que las colonias hayan crecido lo suficiente como para ser recogidas. Después de la generación de secuencia de codificación de polihistidina estreptococo muta incorporada cepa y inoculación durante la noche sin espectinomicina según el manuscrito, centrifugar la suspensión de cultivo bacteriano durante 20 minutos a 10.000 veces g a cuatro grados centígrados.Transfiera el sobrenadante de cultivo en un vaso de vidrio de tres litros. Para concentrar las proteínas del sobrenadante de cultivo, coloque el sobrenadante de dos litros en un agitador magnético y comience a agitar vigorosamente. Añadir 1, 122 gramos de sulfato de amonio y dejar que el precipitado se forme con agitación vigorosa a cuatro grados centígrados durante un período de cuatro horas o durante la noche. próximo.centrifugar la solución precipitada de sulfato de amonio a 15.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante. Con una espátula, recoger el precipitado y transferirlo a un vaso de vidrio de 200 mililitros.Resuspender los pellets en 35 mililitros de tampón de unión. A continuación, transfiera cada uno aproximadamente 25 mililitros de la suspensión a un tubo de diálisis de celulosa regenerado. Coloque el tubo de diálisis en 2,5 litros del tampón de unión de agitación en un agitador a cuatro grados centígrados para marcar la suspensión.Reemplace la solución de diálisis después de dos horas y continúe la diálisis durante la noche. A continuación, transfiera la suspensión dializada del tubo a los tubos centrífugos y coloque los tubos en la centrífuga a 20.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con el equipo de filtración de sección, vierta el sobrenadante sobre un filtro de membrana de 0,2 micrómetros para filtrar.Transfiera el filtrado a un matraz de 75 mililitros. Para fraccionar el gtfSI con etiqueta de polihistidina de la suspensión filtrada, primero prepare una cromatografía de afinidad metálica inmovilizada. Después de equilibrar la resina según el manuscrito, cierre la polla de pellizcar Hoffman.Agregue cinco mililitros de la suspensión filtrada en la columna para hacer una suspensión. A continuación, transfiera toda la suspensión a la suspensión filtrada restante y gire suavemente la mezcla durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a cargar la mezcla en la columna.Abra la polla de pellizcar Hoffman para quitar la suspensión por el flujo de gravedad. Lave la resina IMAC con 20 mililitros de tampón de unión y luego, elulice 20 mililitros de tampón de elución para obtener el gtfSI recombinante. Después de eso, cargue el eluido en un tubo de ultrafiltración centrífuga y centrifugar la solución a 2.000 veces g durante uno a cinco minutos para concentrar la solución.Vacíe el envase del filtrado y agregue 15 mililitros de tampón de almacenamiento en el tubo. Centrifugar la muestra de nuevo y repita el proceso dos veces adicionales. La solución gtfSI recombinante finalmente se concentra en aproximadamente un mililitro.Transfiera el concentrado a un tubo de microcentrífuga y guárdelo a cuatro grados centígrados. Continúe con el protocolo de restauración funcional del resto. En este protocolo, la electroforesis de gel de agarosa muestra que el tamaño de cada amplicon del primer PCR y el segundo PCR correspondía con el tamaño previsto.Las colonias de Streptococcus mutans se transformaron con el segundo producto PCR y se encasinaron en las placas de sinfín de infusión cerebro-corazón que contienen espectinomicina. Los productos de PCR de colonia se ejecutan en el gel de agarosa muestra que cada amplicon era del tamaño pronosticado. La proteína purificada con cromatografía de afinidad de metal inmovilizado se observó como una sola banda por SDS-PAGE.Western blot, realizada con el anticuerpo anti-polihistidina, confirmó que la banda observada era la proteína etiquetada con polihistidina esperada de 160 kilodaltons. La capacidad de formación de biopelículas derivada de la sacarosa sólo se vio con estreptococos mutans de tipo salvaje y estreptococo muta Su-gtfC, que formó una biopelícula adherente en la pared del tubo en presencia de 1%sacarosa. Esto no se observó en estreptococo mutans delta gtfC.Sin embargo, la adición de 25 microgramos del gtfSI recombinante restauró la capacidad de formación de biopelículas adherentes en estreptococo mutans delta gtfC. Dado que el éxito de este método depende de la segunda amplificación de PCR, el segundo producto PCR debe ser confirmado por electroforesis. Ya, la proteína de tipo histidina obtenida por este método también se está reuniendo a los ácidos funcionales, como las interacciones proteína-proteína.Después de su desarrollo, esta técnica, en combinación con la alteración de genes, allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran la función génica.

Research

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de tintes fluorescentes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...