Name: purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det japanska sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS) (Grant nummer 16K15860 och 19K10471 till T. M., 17K12032 till M. I. och 18K09926 till N. H.) och SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (bidrags nummer 2018.09.10 nr 1).

Anmärkning: Generering av S. mutans ∆gtfc, där hela kodnings området för gtfc -genen ersätts med SPCr, måste slutföras innan dessa protokoll utförs. Mer information om generering5finns i den publicerade artikeln.
1. primer design
<ol><li>
Förbered primers för byggandet av S. mutans his-gtfc. Anmärkning: De primer-sekvenser som används i ...

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).</li><li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans:+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product.">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).</li><li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning.">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Gel+Electrophoresis.">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Purification.">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate.">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li></ol>

Utformningen av primers är det mest kritiska steget i protokollet. Sekvenser av gtfc-Reverse och SPCr-Forward primers bestämdes automatiskt baserat på sekvenser av både 3 regionen gtfc och 5 region SPCr. Varje primer innehåller 24 kompletterande baser som kodar en GS-länkare och en his-tag-kodning sekvens i deras 5 ' regioner. Störningar av de infödda reglerande sekvenser som finns i uppströms kompletterande regioner kan undvikas genom tillägg av hans-ta...

Analys av en genfunktion innebär vanligtvis jämförelser av fenotypiska drag av vildtyp stammar till stammar där genen av intresse har störts. När den gen-störd stam produceras, exogent tillägg av genprodukten möjliggör funktionell restaurering.
Den vanligaste metoden för att erhålla renade genprodukter som krävs för efterföljande restaurerings analyser är genom att utföra heterologt uttryck i Escherichia coli1. Men, uttrycket av membranproteiner eller högmolekylära massa proteiner är ofta svårt att använda detta system1. I dessa fall är målproteinet vanligtvis isolerat från de celler som inbyggt syntetiserar proteinet genom en komplex serie av steg, vilket kan leda till förlust av genprodukten. För att övervinna dessa frågor har ett enkelt förfarande tagits fram för rening av genprodukter efter en gen störnings metod2, PCR-baserad DNA-skarvning metod3 (betecknat två-stegs fusion PCR) och elektroporation för genetiska omvandling i Streptococcus mutans. Tillsats av en polyhistidin tagg (his-tag) till C-terminus av genprodukten underlättar dess rening genom immobiliserade metallaffinitetskromatografi (IMAC).
För att isolera hans-tag-uttrycker stam, är hela genomisk DNA av genen av intresse (i detta hans-tag-uttrycker gen-störd stam) ersätts med en antibiotikaresistent markörgen. Förfarandet för att generera sin-tag-uttrycker strainis nästan identisk med den för att generera en gen-störd stam som beskrivs tidigare4,5. Därför bör metoderna för gen störningar och genprodukt isolering utföras som serie experiment för funktionell analys.
I det nuvarande arbetet, en polyhistidin-kodning sekvens är knuten till 3 ′ slutet av Gtfc (genbank Locus tag SMU_1005) gen, kodning glukosyltransferas-si (GTF-SI) i S. mutans6. Därefter utfördes uttrycks studier i en streptokockart. Att uppnå heterologa gtfc uttryck genom E. coli är svårt, sannolikt på grund av den höga molekylära massan av GTF-si. Denna stam heter S. mutans his-gtfc. En Schematisk illustration som skildrar organisationen av gtfc och Spektinomycin Resistance Gene kassett (SPCr)7 loci i Wild-Type S. mutans (s. mutans WT) och dess derivat visas i Figur 1. GTF-SI är ett sekretoriskt protein som bidrar till utvecklingen av cariogenic Dental biofilm6. Under närvaron av sackaros, en anhängare biofilmobserveras på en slät glasyta i WT S. mutans stam men inte i s. mutans gtfc-störd stam (s. mutans Δgtfc)2,5 . Biofilmformation återställs i S. mutans Δgtfc vid exogent tillägg av rekombinant GTF-si. Stammen, S. mutans his-gtfc, används sedan för att producera den rekombinanta GTF-si.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NE-AG02</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His-Tag monoclonal antibody</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D291-7</td>
			<td>HRP-conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2032</td>
			<td>Buffer replacement and protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>7780II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane clamp</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>21-153-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>As One</td>
			<td>2-316-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA sequencing</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5060</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>311-90075</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>315-90051</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29083461</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-00015</td>
			<td>Binding buffer and elution buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>EZ-022</td>
			<td>Temperature setting: 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LH-100-RDS</td>
			<td>Temperature setting: 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td>0.2 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td>3740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-02815</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td>Preparation of binding buffer and elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-06737</td>
			<td>Ammonium sulfate precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-charged resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1560133</td>
			<td>For IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0381</td>
			<td>For SDS-PAGE and western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent filtration apparatus</td>
			<td>As One</td>
			<td>FH-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics; use at 100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>0.22 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>gtfC replaced with spcr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans UA159</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50 &#215; )</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-90035</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>314-90065</td>
			<td>Tris-EDTA buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of a high molecular mass protein in streptococcus mutans

Klargörande av en gens funktion innebär vanligtvis jämförelser av fenotypiska egenskaper hos vildtyp stammar och stammar där genen av intresse har störts. Funktionsbortfall efter gen rubbning återställs därefter genom exogent tillägg av produkten av den störde genen. Detta hjälper till att bestämma funktionen av genen. En metod som tidigare beskrivits innebär att generera en Gtfc gen-störd Streptococcus mutans stam. Här beskrivs en krävande metod för rening av Gtfc -genprodukten från den nygenererade S. mutans stammen efter gen störningen. Det innebär tillsats av en polyhistidin-kodning sekvens vid 3 ′ slutet av genen av intresse, vilket möjliggör enkel rening av genprodukten med immobiliserade metallaffinitetskromatografi. Inga enzymatiska reaktioner än PCR krävs för den genetiska modifieringen i denna metod. Återställandet av genprodukten genom exogent tillägg efter gen rubbning är en effektiv metod för bestämning av genfunktion, som också kan anpassas till olika arter.

Figur 3 visar storleken på varje amplikon från den första PCR (figur 3a) och den andra PCR (figur 3b). Storleken på varje amplikon motsvarade den förväntade storleken, enligt beskrivningen i tabell 1. Figur 4a visar S. mutans kolonier transformerade med den andra PCR-produkten och pläterade på BHI-agar-plattorna som innehåller spectinom...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans at JoVE.com

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Beskrivs här är en enkel metod för rening av en genprodukt i Streptococcus mutans. Denna teknik kan vara fördelaktigt vid rening av proteiner, särskilt membranproteiner och högmolekylära massa proteiner, och kan användas med olika andra bakteriearter.

Rening av ett högt molekylärt Mass protein i Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom mikrobiologi området såsom, hur en gen produkt som är svår att uttrycka i E.Coli renar. De främsta fördelarna med denna teknik är att ingen enzymatisk reaktion, förutom PCR, är bäraren, och vanliga tillämpningar för proteinrening kan användas. Även om denna metod kan ge insikt i proteinrening i streptokocker mutans, det kan också vara en apprised till andra mikrobiota arter.Demonstrera förfarandet kommer att Dr.Mamiko Yamashita, en grad student från vårt laboratorium. Efter primer design och genomisk DNA-extraktion från streptococcus mutans, utföra den första PCR med hjälp av vild-typ streptococcus mutans och GFC störd streptococcus mutans genom som PCR-mallar. Förstärka de regioner som hyser nedströms delen av gtfC genen och de som hyser spectinomycin resistens genen med hjälp av den beredda gtfC-framåt och omvänd primer och spc r-framåt och omvänd primer.Därefter, elektrofors varje PCR produkt på 1%agaros gel. Använd en gel bandcutter att punktskatt de önskade DNA-fragment av cirka 1, 000 baspar och 2, 000 baspar från gelen i mikrocentrifugrör. Tillsätt 500 mikroliter solubiliserande buffert i varje rör och inkubera dem i 10 minuter vid 56 grader Celsius för att lösa upp gelskivorna.Rena fragmenten med hjälp av kiselhinnabaserad gelextraktionsmetod. Utför en andra PCR med hjälp av produkterna i den första PCR som PCR-mallar med de kapslade framåt- och kapslade-omvända primersna. När den andra PCR-produkten inte kan bekräftas med elektrofores, bör en annan kapslad primers par utformas.elektrofors fem mikroliter av PCR-blandningen på agarosgeln. Bekräfta genereringen av lämplig amplikon av cirka 3, 000 baspar genom ethidiumbromid gel färgning bild och fortsätt enligt manuskriptet. Nu, blanda fem mikroliter av den koncentrerade andra PCR produkten till 50-microliter aloquot av iskall, kompetenta vild-typ streptokocker mutan celler, fryst tidigare.Tillsätt blandningen i en elektroporations cuvette och placera cuvette i cuvette kammaren av elektroporationsapparaten. Ge en enda elektrisk puls på 1,8 kilovolt, 600 ohm, och 10 microfarads för 2,5 millisekunder till cellerna. Tillsätt 500 mikroliter av hjärnan-hjärta infusion buljong i cuvette.Sprid omedelbart 10 till 100 mikroliter av suspensionen på hjärn-hjärta infusions auger plattor som innehåller spectinomycin. Inkubera plattorna i två till sex dagar vid 37 grader Celsius tills kolonier har vuxit tillräckligt för att plockas upp. Efter generering av streptococcus mutans polyhistidine kodning sekvens införlivas stam och över natten inokulering utan spectinomycin enligt manuskriptet, centrifug den bakteriella kulturen suspension i 20 minuter vid 10, 000 gånger g vid fyra grader Celsius.Överför kulturen supernatant i en tre-liters glasbägare. För att koncentrera proteinerna från kulturen supernatant, placera två-liters supernatant på en magnetisk omrörare och börja kraftig omrörning. Tillsätt 1, 122 gram ammoniumsulfat och låt fällningen bildas med kraftig omrörning vid fyra grader Celsius under en fyratimmarsperiod eller över natten. Nästa.centrifugera ammoniumsulfatet utfälld lösning vid 15, 000 gånger g i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Dekantera supernatanten. Med en spatel, samla utfällningen och överföra den till en 200-milliliter glasbägare.Resuspend pelletsen i 35 milliliter av bindande buffert. Sedan överför vardera cirka 25 milliliter av suspensionen till en regenererad cellulosadialysrör. Placera dialysrör i 2,5 liter omrörning bindande buffert på en omrörare vid fyra grader Celsius för att dialyze suspensionen.Byt ut dialyslösningen efter två timmar och fortsätt dialysen över natten. Nästa överföra dialyserad suspension från slangen till centrifugrör och placera rören i centrifugen på 20, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Med sektionsfiltreringsutrustning häller du supernatanten över ett 0,2-mikrometermembranfilter för att filtrera.Överför filtratet till en 75-milliliterkolv. För att fractionate den polyhistidine-taggade gtfSI från den smutsiga suspensionen, först förbereda en immobiliserad metall affinitet kromatografi. Efter equilibrating harts enligt manuskriptet, stäng Hoffman nypa kuk.Tillsätt fem milliliter av den filtrerade suspensionen i kolonnen för att göra en slurry. Överför sedan all flytgödsel till den återstående filtrerade suspensionen och snurra blandningen försiktigt i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Ladda blandningen tillbaka i kolonnen.Öppna Hoffman nypa kuk för att ta bort suspensionen av gravitationen flödet. Tvätta IMAC-kådan med 20 milliliter bindningsbuffert och därefter, eluera 20 milliliter elueringsbuffert för att erhålla den rekombinanta gtfSI. Därefter, ladda eluatet i ett centrifugal ultrafiltreringsrör och centrifugera lösningen vid 2, 000 gånger g i en till fem minuter för att koncentrera lösningen.Töm filtratebehållaren och tillsätt 15 milliliter lagringsbuffert i röret. Centrifugera provet igen och upprepa processen två ytterligare gånger. Den rekombinanta gtfSI-lösningen är slutligen koncentrerad till ungefär en milliliter.Överför koncentratet till ett mikrocentrifugrör och förvara i fyra grader Celsius. Fortsätt med resten funktionella restaurering protokollet. I detta protokoll visar agarosgelelektroforesen att storleken på varje amplikon från den första PCR och den andra PCR motsvarade den förutsagda storleken.Streptococcus mutans kolonier förvandlades med den andra PCR produkten och pläterade på hjärnan-hjärta infusions auger plattor som innehåller spectinomycin. Colony PCR produkter körs på agaros gel visar att varje amplicon var av den förutsagda storleken. Protein renas med immobiliserade metall affinitet kromatografi observerades som ett enda band av SDS-PAGE.Western blot, utförs med anti-polyhistidine antikropp, bekräftade att det observerade bandet var den förväntade polyhistidine-taggade protein av 160 kilodalton. Den sackaros-härledda biofilm formning förmåga sågs endast med streptococcus mutans vild-typ och streptococcus mutans His-gtfC, som bildade en vidhäftande biofilm på röret väggen i närvaro av 1%sackaros. Detta observerades inte i streptococcus mutans delta gtfC.Tillägg av 25 mikrogram av rekombinanta gtfSI återställde dock den vidhäftande biofilmens bildningsförmåga i streptococcus mutans delta gtfC. Eftersom framgången för denna metod beror på den andra PCR-förstärkningen måste den andra PCR-produkten bekräftas av elektrofores. Redan, histidin-typ protein som erhållits genom denna metod är också sammankallande till funktionella syror, såsom protein-protein interaktioner.Efter dess utveckling banade denna teknik, i kombination med genstörningar, vägen för forskare inom mikrobiologin att utforska genfunktionen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastställande av molekylära strukturer av HIV Envelope Glycoproteins med Cryo-elektrontomografi och automatisk Sub-tomogram Snittar

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Levande cell imaging av Bacillus subtilis Och Streptococcus pneumoniae Med hjälp av automatiserade Time-lapse Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Övervaknings Förändringar i Membrane polaritet, Membrane Integritet och intracellulära jonkoncentrationer i<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Med hjälp av fluorescerande färger

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rening av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites för användning i opsoniserande Antibody analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Icke-invasiv avbildning av det medfödda immun Response i en Zebrafish Larv Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Enstegs Negativ kromatografisk rening av<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverande Protein överuttryckt i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-läge

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Rening från Intracellulärt Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En musmodell av grupp B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...