Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة Wellcome Trust (106954) التي منحت لـ B. L. ولمجلس البحوث الطبية (MRC) التمويل الأساسي (MC-A652-5QA10). (ج) دعم ت. وقد تلقى E. P. الدعم من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة. B. L. كان مدعوما من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MC UP 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

وقد تم ملء براءة اختراع للناقل القابل للتحلل RNA/DNA.

من المهم جداً استخدام النصائح والأنابيب المنخفضة الربط لمنع فقدان العينات بسبب الامتصاص. في جميع الخطوات التي تنطوي على استرجاع supernatant، فمن المستحسن لاسترداد حجم العينة بأكمله. بما أن البروتوكول له عدة خطوات، فإن فقدان العينة المستمر يؤدي إلى مكتبات غير ناجحة.
إذا لم يتم تنفيذ CAGE (nAnT-iCAGE) بشكل روتيني، فمن الأفضل اختبار SLIC-CAGE بكميات مدخلات مختلفة (10 نانوغرام، 20 نانوغرام، 50 نانوغرام، 100 نانوغرام، 200 نانوغرام) من نفس عينة الحمض النووي الريبي الإجمالي ومقارنة المكتبات nAnT-iCAGE التي يتم إعدادها باستخدام 5 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي. إذا كانت مكتبة nAnT-iCAGE غير ناجحة (أقل من 0.5-1 نانوغرام من مكتبة DNA التي تم الحصول عليها لكل عينة)، من غير المحتمل أن يعمل SLIC-CAGE، ويلزم تقليل فقدان العينة.
وثمة خطوة حاسمة لضمان وجود مكتبات عالية الجودة خالية من الحمض النووي الريبي المتردي أو RRNA غير المغطى هو تحديد الغطاء الموصوف في القسم 7. من المهم جدا أن يتم إعادة تعليق الخرز ستربتينين تماما في المخازن المؤقتة غسل وأن تتم إزالة المخازن العازلة غسل قبل الاستمرار في الخطوة التالية غسل أو الإلتواء من cDNA.
إذا كانت النتائج من qPCR بعد الجولة الأولى من تدهور الناقل لا تظهر أي فرق بين استخدام التمهيديات adaptor_f1 وcarrier_f1، لا يزال يوصى بمواصلة البروتوكول. إذا كان الفرق في قيم Ct أقل من خمسة بعد الجولة الثانية من تدهور الناقل، يوصى بإجراء جولة ثالثة من تدهور الناقل. لم نجد أبدا جولة ثالثة من التدهور اللازمة، وإذا حدث ذلك، فمن المستحسن أن تحل محل الأسهم ايندونوكلليز.
قد يتم إضافة جولات إضافية من تضخيم PCR إلى البروتوكول إذا كان المبلغ النهائي للمكتبة التي تم الحصول عليها غير كافية للتسلسل. ويمكن بعد ذلك تعيين تضخيم PCR بعدد ضئيل من دورات التضخيم اللازمة لإنتاج ما يكفي من المواد للتسلسل، مع الأخذ بعين الاعتبار فقدان العينة التي لا يمكن تجنبها في تحديد الحجم. ثم ينبغي إجراء تنقية أو اختيار الحجم باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI حتى تتم إزالة جميع الشظايا الصغيرة (<200 bp) (إذا لزم الأمر، استخدم 0.6:1 حبة إلى نسبة العينة)، وينبغي تحديد حجم المكتبة باستخدام بيكوغرين.
يمكن تسلسل المكتبات في وضع أحادي الطرف أو في وضع مزدوج. باستخدام تسلسل المقترنة نهاية، يمكن الحصول على معلومات حول isoforms النص. وبالإضافة إلى ذلك، كما يتم إجراء النسخ العكسي باستخدام التمهيدي عشوائي (TCT-N6، N6 كونها hexamer عشوائي)، يمكن استخدام المعلومات من 3'-end متسلسلة كمعرفات جزيئية فريدة (UMI) لانهيار مكررة PCR. كما يستخدم عدد معتدل من دورات تضخيم PCR (تصل إلى 18)، وقد وجد سابقا استخدام UMIs أن تكون غير ضرورية.
كما أن جوهر البروتوكول يعتمد على nAnT-iCAGE11، يستخدم SLIC-CAGE ثمانية الباركود. لذلك، تعدد النماذج أكثر من ثمانية حاليا ً غير معتمد. وبالإضافة إلى ذلك، كل من SLIC-CAGE وnAnT-iCAGE ليست مناسبة لالتقاط RNAs أقصر من 200 نقطة أساس، كما تم تصميم البروتوكولات لإزالة الروابط والتحف PCR من خلال حجم الاستبعاد مع حبات AMPure XP.
SLIC-CAGE هو الأسلوب الوحيد غير المتحيز منخفض الإدخال أحادي النواة لخرائط مواقع بدء بدء النسخ باستخدام نانوغرام من مجموع مادة الحمض النووي الريبي. تعتمد الطرق البديلة على نشاط التحويل للقالب من النسخ العكسي إلى الرمز الشريطي المغطى RNA بدلاً من غطاء التراكب (على سبيل المثال، NanoCAGE15 و NanoPARE16). بسبب تبديل القالب، تعرض هذه الأساليب تحيزات خاصة بالتسلسل في الكشف عن نظام الخدمة الذاتية، مما يؤدي إلى زيادة أعداد TSSs الإيجابية الكاذبة وانخفاض أعداد TSSs 9و10.

تحليل كاب التعبير الجيني (CAGE) هو طريقة تستخدم لدقة واحدة النيوكليوتيد رسم الخرائط على نطاق الجينوم من RNA البوليميراز الثاني النسخ المواقع بداية (TSS)1. كما أن طبيعته الكمية تسمح بتنميط التعبير المركز 5'-end. المناطق المحيطة TSSs (حوالي 40 bp المنبع والمصب) هي المروجين الأساسية وتمثل الموقع المادي حيث RNA بوليميراز الثاني وعوامل النسخ العامة ملزمة (تمت مراجعتهسابقا2،3). ويمكن استخدام المعلومات المتعلقة بالمواقع الدقيقة للخدمات والخدمات والخدمات الخاصة لاكتشاف المروج الأساسي ولرصد ديناميات المروج. وبالإضافة إلى ذلك، حيث أن المُعزّرين النشطين يعرضون توقيعات النسخ ثنائي الاتجاه، يمكن أيضاً استخدام بيانات CAGE في اكتشاف محسن ومراقبة ديناميكيات محسن4. وقد زادت مؤخرا CAGE منهجية شعبية نظرا لتطبيقها واسعة واستخدامها في مشاريع البحوث رفيعة المستوى مثل ترميز5، modEncode6، ومشاريع FANTOM7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معلومات خدمات الخدمات والخدمات والخدمات التي تثبت أيضا ً أنها مهمة لتمييز الأنسجة الصحية والمريضة، حيث يمكن استخدام هذه الفحوصات لأغراض التشخيص8.
على الرغم من أن عدة طرق لرسم الخرائط TSS متوفرة (CAGE، RAMPAGE، STRT، nanoCAGE، nanoCAGE-XL، oligo-capping)، وقد أظهرت لنا وآخرون مؤخرا أن CAGE هو الأسلوب الأكثر غير متحيزة لالتقاط TSSS صحيح مع أقل عدد من الإيجابيات كاذبة9 , 10.البروتوكول قفص الأخيرة, nAnT-iCAGE11, هو البروتوكول الأكثر غير متحيزة لالتنميط TSS, كما أنه يتجنب قطع شظايا إلى علامات قصيرة باستخدام الإنزيمات تقييد ولا يستخدم PCR تضخيم. وثمة قيد على بروتوكول nAnT-iCAGE هو اشتراط كمية كبيرة من مواد البداية (على سبيل المثال، 5 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي لكل عينة). وللإجابة على أسئلة محددة ذات صلة بيولوجياً، غالباً ما يستحيل الحصول على كميات عالية من المواد الأولية (مثلاً بالنسبة للخلايا التي تم فرزها من قبل الخلايا المسلحة في مرحلة مراقبة الأصول أو المراحل الجنينية المبكرة). وأخيراً، إذا نجحت nAnT-iCAGE، فإن 1-2 نانوغرام فقط من مواد مكتبة الحمض النووي متوفرة من كل عينة، مما يحد من عمق التسلسل القابل للتحقيق.
لتمكين التنميط TSS باستخدام نانوغرام فقط من مجموع الجيش الملكي النيبالي، قمنا مؤخرا بتطوير فائقة منخفضة الإدخال الناقل-CAGE10 (SLIC-CAGE، الشكل 1). يتطلب SLIC-CAGE فقط 10 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي للحصول على مكتبات عالية التعقيد. يعتمد بروتوكولنا على الناقل RNA الاصطناعية مصممة بعناية وأضاف إلى الجيش الملكي النيبالي من الفائدة لتحقيق ما مجموعه 5 ميكروغرام من المواد RNA. الناقل الاصطناعية يحاكي مكتبة الحمض النووي المستهدفة في توزيع الطول لتجنب التحيزات المحتملة التي يمكن أن تسببها جزيئات متجانسة في الزائدة. ويستند تسلسل الناقل على تسلسل الجين الإشريكية القولونية الكريات البيضاء-tRNAsynthetase (الجدول 1) لسببين. أولا، أي بقايا الناقل في المكتبة النهائية، حتى لو تسلسل، لن خريطة إلى جينوم eukaryotic. ثانيا، كما E. القولونية هو نوع المتوسطة، يتم تحسين الجينات التدبير المنزلي لنطاق درجة الحرارة المناسبة لSLIC-CAGE. كما أن تسلسل الحامل مضمّن مع مواقع التعرف على الإندوكليز للسماح بتحلل معين للحمض النووي المشتق من جزيئات الحمض النووي الريبي الناقل. يبقى الهدف, مكتبة [تمد-سيند] مصونة, بما أنّ ال [هووينغ] [إيندونكلس] تمييز موقعات طويلة ([إي-كوي] = 27 [بب]; I-SceI + 18 نقطة أساس) ومن غير المرجح إحصائيا أن تكون موجودة في الجينوم eukaryotic. بعد تدهور محدد للناقل وإزالة الشظايا حسب استبعاد الحجم، يتم تضخيم المكتبة المستهدفة لـ PCR وجاهزة لتسلسل الجيل التالي. اعتمادا ً على كمية RNA البداية (1-100 نانوغرام)، بين 13-18 من المتوقع أن تكون هناك حاجة دورات التضخيم PCR. وتتراوح الكمية النهائية من الحمض النووي لكل عينة بين 5-50 نانوغرام، مما ينتج عنه ما يكفي من المواد لتسلسل عميق جداً. عند استخدام 1-2 نانوغرام فقط من مجموع الحمض النووي الريبي، يمكن الكشف عن TSS صحيح; ومع ذلك، من المتوقع أن تكون المكتبات أقل تعقيدا. وأخيراً، بما أن SLIC-CAGE يستند إلى بروتوكول nAnT-iCAGE11،فإنه يتيح تعدد الإرسال من ما يصل إلى ثمانية عينات قبل التسلسل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

تحليل كاب التعبير الجيني (CAGE) هو طريقة تستخدم للكشف عن دقة النيوكليوتيد واحد من RNA البوليميراز الثاني النسخ المواقع بداية (TSS). الكشف الدقيق عن TSSs يعزز تحديد واكتشاف المروجين الأساسية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن أجهزة محسنة نشطة من خلال توقيعات بدء النسخ ثنائي الاتجاه. ويرد هنا بروتوكول لأداء فائقة منخفضة المدخلات الناقل-CAGE (SLIC-CAGE). يقلل هذا التكييف SLIC من بروتوكول CAGE خسائر الجيش الملكي النيبالي عن طريق زيادة مصطنعة كمية الجيش الملكي النيبالي من خلال استخدام مزيج الناقل RNA في المختبر التي تضاف إلى عينة من الفائدة، وبالتالي تمكين إعداد مكتبة من نانوغرام كميات من المجموع الجيش الملكي النيبالي (أي الآلاف من الخلايا). وتحاكي الناقلة التوزيع المتوقع لطول جزء من مكتبة الحمض النووي، مما يزيل التحيزات التي يمكن أن تنجم عن وفرة الناقل المتجانس. في المراحل الأخيرة من البروتوكول، يتم إزالة الناقل من خلال التدهور مع الهوابينغ endonucleases ويتم تضخيم المكتبة المستهدفة. وتحمي مكتبة العينات المستهدفة من التدهور، حيث أن مواقع التعرف على الإندوكليز طويلة (بين 18 و27 نقطة أساس)، مما يجعل احتمال وجودها في الجينوم اتويافيمنخفض جداً. والنتيجة النهائية هي مكتبة الحمض النووي جاهزة لتسلسل الجيل التالي. يمكن إكمال جميع الخطوات في البروتوكول، حتى التسلسل، في غضون 6 أيام. ويقتضي إعداد الناقل يوم عمل كامل؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون مستعدة بكميات كبيرة وأبقى المجمدة في -80 درجة مئوية. وبمجرد تسلسلها، يمكن معالجة القراءات للحصول على دقة النيوكليوتيد الواحد على نطاق الجينوم TSSs. يمكن استخدام هذه القراءات في اكتشاف المروج أو محسن الأساسية، مما يوفر نظرة ثاقبة على تنظيم الجينات. وبمجرد تجميعها للمروجين، يمكن أيضا ً استخدام البيانات لتحديد سمات التعبير التي تركز على 5'.

يصف هذا التقرير البروتوكول الكامل لـ SLIC-CAGE للحصول على مكتبات جاهزة للتسلسلمن نانوغرام من مواد RNA الكلية (الشكل 1). للحصول على مزيج الناقل الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية، أولا، قوالب الناقل PCR تحتاج إلى أن تكون مستعدة وهلام تنقية للقضاء على المنتجات الجانبية PCR (الشكل2A). يتم إنتاج كل قالب PCR (عشرة في المجموع) باستخدام مشترك إلىالأمام، ولكن التمهيدي العكسي مختلفة (الجدول 2)، مما يؤدي إلى أطوال مختلفة من قالب PCR لتمكين تقلب حجم الناقلين RNA الاصطناعية. مرة واحدة تنقية، وتستخدم قوالب PCR للنسخ في المختبر من جزيئات الناقل. ومن المتوقع منتج حامل RNA واحد إذا كانت القوالب هي هلام تنقية (انظر ممثل هلام التحليل في الشكل 2B). ويمكن رفع مستوى إعداد الناقل اعتمادا على الحاجة، وعند إعداده، مختلطة ومجمدة في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
باستخدام الحد الأدنى الموصى به من عينة مجموع الحمض النووي الريبي (10 نانوغرام) جنبا إلى جنب مع دورات 16-18 من تضخيم PCR، يمكن تحقيق عالية التعقيد SLIC-CAGE المكتبات. ويعتمد عدد دورات PCR المطلوبة لتضخيم المكتبة النهائية إلى حد كبير على كمية إجمالي المدخلات التي يستخدمها الجيش الملكي النيبالي (يعرض العدد المتوقع للدورات في الجدول4).
بعد الجولة الأولى من التدهور، في نتائج qPCR (الخطوة 17)، الفرق المتوقع بين القيم Ct التي تم الحصول عليها باستخدام adaptor_f1 أو التمهيدي carrier_f1 هو 1-2، مع قيم Ct التي تم الحصول عليها مع adaptor_f1 أقل من مع carrier_f1.
توزيع أطوال جزء في المكتبة النهائية بين 200-2،000 نقطة أساس مع حجم جزء متوسط من 700-900 نقطة أساس (استنادا إلى تحليل المنطقة باستخدام Bioanalyzer البرمجيات، الشكل 4B، D). شظايا أقصر، كما هو معروض في الشكل 4A، C، يجب إزالتها بجولات إضافية من استبعاد الحجم (الخطوات 20-21). هذه الأجزاء القصيرة هي قطع أثرية تضخيم PCR وليس المكتبة المستهدفة. لاحظ أن أجزاء أقصر الكتلة بشكل أفضل على تسلسل تدفق الخلايا وقد يسبب مشاكل التسلسل.
والكمية المتوقعة من مواد المكتبة التي يتم الحصول عليها لكل عينة تتراوح بين 5-50 نانوغرام. وتدل المبالغ الأقل بكثير على فقدان العينة أثناء البروتوكول. إذا كانت الكمية المنخفضة التي تم الحصول عليها كافية للتسلسل (2-3 ng من المكتبات المجمعة مطلوبة)، قد تكون المكتبات أقل تعقيداً (انظر أدناه).
اعتماداً على آلة التسلسل، قد تحتاج كمية المكتبة المحملة على خلية التدفق إلى تحسين. باستخدام Illumina HiSeq 2500، تحميل 8-12 pM SLIC-CAGE يعطي المكتبات في المتوسط 150-200 مليون يقرأ، مع > 80٪ من يقرأ تمرير درجة الجودة Q30 كعتبة.
ثم يتم تعيين القراءات التي تم الحصول عليها إلى الجينوم المرجعي [لقراءات 50 نقطة ب المائة، يمكن استخدام Bowtie212 مع المعلمات الافتراضية التي تسمح بعدم تطابق صفر لكل تسلسل البذور (22 نقطة أساس)]. وتعتمد الكفاءات المتوقعة في رسم الخرائط على إجمالي كمية مدخلات الحمض النووي الريبي، وهي معروضة في الجدول5. ويمكن بعد ذلك تحميل القراءات المعينة بشكل فريد في بيئة الحوسبة الرسومية والإحصائيةR 13 ومعالجتها باستخدام CAGEr (حزمة الموصلات الحيوية14). يسهل اتباع المقالة المصغرة للحزمة وتشرح سير العمل ومعالجة البيانات المعينة بالتفصيل. وسهولة التحكم البصري في تعقيد المكتبة هو توزيع عرض المروج، حيث أن المكتبات ذات التعقيدات المنخفضة سيكون لها مروجون ضيقون بشكل مصطنع (الشكل5A،مكتبة SLIC-CAGE المستمدة من 1 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، للحصول على التفاصيل انظر السابقة 10ةيلاب ةيلاب ةيلاب ومع ذلك، حتى المكتبات SLIC-CAGE منخفضة التعقيد تسمح بتحديد CTSS صحيح، مع دقة أكبر من الأساليب البديلة لرسم الخرائط TSS منخفضة/ متوسطة الدخل (الشكل5B،C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> الشكل 1: الخطوات في بروتوكول SLIC-CAGE. يتم خلط عينة الجيش الملكي النيبالي مع مزيج الناقل RNA لتحقيق 5 ميكروغرام من مجموع المواد RNA. يتم توليف cDNA من خلال النسخ العكسي ويتم أكسدة الغطاء باستخدام الصوديوم periodate. يسمح الأكسدة بإرفاق البيوتين بالغطاء باستخدام البيوتين هيدرازيد. البيوتين يحصل تعلق على نهاية MRNA 3′, كما أنها أكسدة أيضا باستخدام الصوديوم periodate. للقضاء على البيوتين من مرنا: cDNA الهجينة مع cDNA توليفها بشكل غير كامل ومن 3′ نهايات من مرنا, يتم التعامل مع العينات مع RNase I. cDNA التي وصلت إلى نهاية 5′ من مرنا ثم يتم اختيارها عن طريق تنقية التقارب على الخرز المغناطيسي streptavidin ( كاب- فخ). بعد إطلاق ال [كدنا], 5′- و [3-لينكرس] [لبيتد]. وتتدهور جزيئات المكتبة التي تنشأ من الناقل باستخدام I-SceI وI-CeuI homing endonucleases ويتم إزالة الشظايا باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. ثم يتم تضخيم المكتبة PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> الشكل 2: تحليل الجل التمثيلي لقوالب الناقل PCR والنسخ المستعملة في المختبر. (أ) قوالب الناقل PCR قبل تنقية هلام: البئر الأول يحتوي على علامة 1 كيلوبت في الثانية، تليها الناقل PCR قوالب 1، 1-10. (ب) الناقل في النصوص في المختبر: البئر الأول يحتوي على علامة 1 كيلوبت في الثانية، تليها نسخ الناقل 1-10. وقد تم تشويه نسخ الناقل عن طريق التدفئة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية قبل التحميل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> الشكل 3: تتبع SLIC-CAGE قبل الجولة الأولى من تدهور الناقل ة من نوع الحمض النووي (رقاقة الحمض النووي عالية الحساسية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> الشكل 4: آثار نوعية الحمض النووي التمثيلي (رقاقة الحمض النووي عالية الحساسية) لمكتبات SLIC-CAGE بعد تضخيم PCR. (A) مكتبة SLIC-CAGE التي تتطلب اختيار حجم إضافية لإزالة أجزاء قصيرة. (ب) SLIC-CAGE مكتبة بعد حجم اختيار باستخدام 0.6x SPRI الخرز إلى نسبة العينة. (C) مكتبة SLIC-CAGE من كمية الإخراج أقل التي تتطلب تحديد حجم لإزالة جزء قصير. (د) SLIC-CAGE مكتبة أقل كمية الإخراج بعد حجم اختيار باستخدام 0.6:1 SPRI الخرز إلى نسبة العينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> الشكل 5: التحقق من صحة مكتبات SLIC-CAGE. (أ) توزيع عرض علامة الكتلة بين الجوانتيل في مكتبات SLIC-CAGE التي أعدت من 1 أو 5 أو 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الكلي S. cerevisiae، وفي مكتبة nAnT-iCAGE التي أعدت من 5 ميكروغرام من S. سيريفيسياي مجموع الجيش الملكي النيبالي. يشير مقدار كبير من الكتل العلامات الضيقة في مكتبة SLIC-CAGE 1 ng إلى تعقيدها المنخفض. (B) منحنيات ROC لتعريف CTSS في مكتبات S. cerevisiae SLIC-CAGE. جميع S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs كانت تستخدم كمجموعة حقيقية. (C) منحنيات ROC لتحديد CTSS في مكتبات S. cerevisiae nanoCAGE. جميع S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs كانت تستخدم كمجموعة حقيقية. مقارنة منحنيات ROC تبين أن SLIC-CAGE يتفوق بقوة nanoCAGE في تحديد CTSS. تم استخدام البيانات من صفيف Express E-MTAB-6519. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: تسلسل المورّثة الاصطناعية الناقل. مواقع I-SceI جريئة ومائلة باللون الأرجواني، ومواقع التعرف على I-CeuI خضراء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الناقل</td>
			<td colspan="2">عكس التمهيدي 5'-3'</td>
			<td>طول المنتج PCR / bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGGAGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGTGTGTGAGGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNNNGCCGTCGATAACTGTGTGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGGCGCGTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAGAAGAATGTGTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGCCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGGTGTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* التمهيدي إلى الأمام هو نفسه لجميع قوالب الناقل. يتم وضع خط تحت تسلسل المروج T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNCAGCGTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: القوالب الأولية لتضخيم قالب الحامل. التمهيدي إلى الأمام هو نفسه لجميع قوالب الناقل. يتم وضع خط تحت تسلسل المروج T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTCGCTA. باستخدام التمهيديات العكسية المختلفة، يتم إنتاج قوالب PCR وبالتالي RNA الناقل من طول مختلفة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الناقل</td>
			<td>طول</td>
			<td>غير مغلّف/ميكروغرام</td>
			<td>متوج / ميكروغرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8.36</td>
			<td>0.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3.08</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2.64</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2-2</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: مزيج الناقل RNA. في المجموع 49 ميكروغرام من مزيج الناقل 0.3-1 كيلو بت في الثانية: غير محدد = 44 ميكروغرام، توج = 5 ميكروغرام.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>إجمالي المدخلات RNA / NG</td>
			<td>دورات PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 نانوغرام</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 نانوغرام</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 نانوغرام</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 نانوغرام</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 نانوغرام</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 نانوغرام</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 نانوغرام</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4: العدد المتوقع من دورات PCR في الاعتماد على عينة من مجموع المدخلات RNA. ويستند عدد تقريبي من دورات على التجارب التي أجريت باستخدام سكريروميسيس سيريفيسياي, Drosophila الميلانوجاستر, وMUS MUS MUSCULUS مجموع الجيش الملكي النيبالي.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مجموع المدخلات في الحمض النووي الريبي/ng</td>
			<td>النسبة المئوية الإجمالية للتعيين</td>
			<td>% تعيين فريد</td>
			<td>النسبة المئوية للناقل</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 نانوغرام</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 نانوغرام</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 نانوغرام</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 نانوغرام</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 نانوغرام</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 نانوغرام</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 نانوغرام</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 5: الكفاءة المتوقعة لرسم الخرائط واعتماد إجمالي كمية المدخلات في الجيش الملكي النيبالي. يتم تقديم الأرقام التقريبية وتستند إلى التجارب التي أجريت باستخدام Saccharomyces سيريفيسياي وMus musculus مجموع الجيش الملكي النيبالي.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

تحليل كاب للتعبير الجيني (CAGE) هو طريقة لرسم الخرائط الكمية على نطاق الجينوم من mRNA 5'ends لالتقاط RNA البوليميراز الثاني النسخ المواقع بداية في قرار نيوكليوتيد واحد. يصف هذا العمل بروتوكول منخفض الإدخال (SLIC-CAGE) لتوليد مكتبات عالية الجودة باستخدام كميات نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي.

النسخ بدء تعيين الموقع باستخدام فائقة منخفضة الإدخال الناقل-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تنظيم الجينات ، لأنها تمكن المروج الأساسي واكتشاف محسن باستخدام كميات منخفضة من المواد الأولية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح غير متحيزة، الجينوم على نطاق واحد مسح النيوكليوتيد القرار من RNA بوليمراسي الثاني مواقع بدء النسخ باستخدام 10 نانوغرام فقط من مجموع الحمض النووي الريبي. كيج يثبت أن لا تقدر بثمن للكشف عن مواقع بدء النسخ المرتبطة بالمرض التي يمكن استخدامها كعلامات التشخيص.SLIC-CAGE يمتد هذه الاكتشافات إلى عينات النطاق مثل خزعات الأنسجة. SLIC-CAGE هو مناسب بشكل مثالي لتحليل المروج المتعمق وعالي الدقة لأنواع الخلايا الضعيفة، بما في ذلك مراحل النمو الجنينية المبكرة أو الأنسجة الجنينية من مجموعة واسعة من الكائنات العضوية النموذجية. منذ هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان للحد من فقدان العينة في كل خطوة عن طريق الحرص على استرداد أكبر قدر ممكن من المواد عند نقل بين الأنابيب.ابدأ بإعداد مزيج PCR لكل قالب. الجمع بين العازلة، dNTPs، التمهيدي إلى الأمام فريدة من نوعها، قالب بلاسميد مع الجين الناقل الاصطناعية، وبوليميراز الانصهار وفقا لاتجاهات المخطوطات. خلط الكواشف عن طريق الأنابيب.إضافة 90 ميكرولترات من مزيج PCR إلى 10 ميكرولترات من كل التمهيدي العكسي ومزيج. راجع المخطوطة لمعرفة ظروف الدراجات الحرارية. تنفيذ النسخ العكسي أو RT على الجيش الملكي النيبالي من الفائدة.الجمع بين ميكرولتر واحد من النسخ العكسي التمهيدي، 10 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، و 4، 990 نانوغرام من مزيج الناقل في حجم إجمالي من 10 ميكرولترات. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. سخني الخليط إلى 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم وضعه على الجليد على الفور.إعداد مزيج RT وفقا لاتجاهات المخطوطة وإضافة 28 ميكرولترات من هذا المزيج إلى 10 ميكرولترات من RNA. خلط محتويات الأنبوب عن طريق الأنابيب حتى تجانس. تشغيل RT في ثيركلوفير.بمجرد اكتمال النسخ العكسي ، قم بتنقية المنتج باستخدام حبات SPRI المغناطيسية الخالية من RNase و RNase. إضافة الخرز إلى مزيج RT في نسبة حجم 1.8 إلى واحد ويخلط جيدا عن طريق الأنابيب. دع الخليط يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.ثم، ضع الخرز على حامل مغناطيسي واتركه منفصلاً لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير وأضف 200 ميكرولترات من الإيثانول الطازجة المعدة بنسبة 70٪إلى الخرز. لا تخلط الخرز أو تأخذها من موقف مغناطيسي وإزالة الإيثانول مباشرة بعد إضافة.الحفاظ على أنبوب على موقف المغناطيسي وإزالة جميع آثار الإيثانول عن طريق دفع أي قطرات المتبقية مع ماصة P10. إضافة فوري 42 ميكرولترات من الماء، وماصات صعودا وهبوطا 60 مرة إلى عينة مائل، مع الحرص على عدم التسبب في رغوة. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق دون غطاء ومن ثم فصل الخرز على المنصة المغناطيسية.ثم، نقل افرانت إلى مجموعة جديدة من الأنابيب، مع الحرص على استرداد جميع فائق ولكن تجنب حمل حبة. بعد العلاج RNase الأول، مزيج 45 ميكرولترات من العينة مع 105 ميكرولترات من الخرز streptavidin أعدت واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال الحضانة، ماصة العينة كل 10 دقيقة لخلط.ثم، فصل الخرز على الحامل المغناطيسي وإزالة افرا. غسل الخرز مع المخازن المؤقتة A، B، وC.البدء مع العازلة A، resuspend الخرز في 150 ميكرولترات من العازلة. فصل على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، ثم إزالة ناظر.سخني العازلين B و C إلى 37 درجة مئوية وكرر خطوات الغسيل. لإزالة جميع الحمض النووي الريبي غير المغطاة، فمن الأهمية بمكان لغسل الخرز streptavidin والجدران أنبوب بدقة وإزالة تماما العازلة غسل قبل إضافة واحد المقبل. لإطلاق سراح cDNA، resuspend الخرز في 35 ميكرولترات من 1X RNase I العازلة واحتضان في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.بعد الحضانة، ضع على الفور الخرز على الجليد لمدة دقيقتين. فصل الخرز على موقف مغناطيسي ونقل ناظر إلى مجموعة جديدة من الأنابيب. Resuspend الخرز في 30 ميكرولترات من 1X RNase أنا العازلة ومن ثم منفصلة على موقف مغناطيسي.الجمع بين المابير مع ناظر التي تم جمعها سابقا لحجم إجمالي يبلغ حوالي 65 ميكرولترات. تنفيذ qPCR لتحديد عدد دورات PCR لتضخيم المكتبة المستهدفة. إعداد خلطات سيد qPCR لتضخيم مكتبات كاملة من الحمض النووي من الناقل.تعيين ظروف الدراجات الحرارية وفقا لاتجاهات المخطوطات وتضخيم العينة المعدة. بروتوكول SLIC-CAGE يجعل من الممكن الحصول على المكتبات الجاهزة التسلسل من نانوجرامات من المواد RNA بدء. يتراوح طول الجزء في المكتبة النهائية بين 200 و2,000 زوج أساسي.شظايا أقصر هي القطع الأثرية PCR ويمكن أن يسبب مشاكل التسلسل أسفل الخط. يمكن إجراء جولات إضافية من تحديد الحجم لإزالتها. بالمقارنة مع NanoCAGE ، SLIC-CAGE معارض أفضل بكثير الأداء في النسخ بدء تحديد الموقع ، وهو واضح من منحنيات التشغيل المتلقي من التقنيات اثنين من تنفيذها على كميات مختلفة من S.cerevisiae مجموع RNA.أثناء تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن فقدان العينة قد يؤدي إلى مكتبات منخفضة التعقيد. لمنع ذلك، يجب استخدام نصائح الأنابيب والميصة المنخفضة الملزمة. دون SLIC-CAGE، لم يكن من المتعذر الوصول إلى تحليل المروج لأنواع مختلفة من الخلايا حتى الآن.ويشمل ذلك تحليل مراحل النمو الجنينية أو الأنسجة الجنينية من مجموعة واسعة من الكائنات العضوية النموذجية.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

تحليل إنهاء النسخ عن طريق النسخ على تشغيل (TRO) نهج BrUTP حبلا محددة

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

شاشات الهجين واحد الخميرة المحسنة لتحديد عامل النسخ ملزمة لتسلسل الحمض النووي البشري

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...