Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for genregulering, da den muliggør centrale promotor og forstærker opdagelse ved hjælp af små mængder af udgangsmateriale. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver upartisk, genom-dækkende enkelt nukleotid opløsning kortlægning af RNA polymerase II transskriptionelle start steder ved hjælp af kun 10 nanogram af samlede RNA. CAGE har vist sig at være uvurderlig for at afdække sygdomsrelaterede transskription start steder, der kan bruges som diagnostiske markører.
SLIC-CAGE udvider disse opdagelser til at skalere prøver såsom vævsbiopsier. SLIC-CAGE er ideel til dybdegående og høj opløsning promotor analyse af skrøbelige celletyper, herunder tidlige embryonale udviklingsstadier eller embryonale væv fra en bred vifte af model organismer. Da der er mange trin i denne protokol, er det afgørende at minimere prøvetab i hvert trin ved at passe på at hente så meget materiale som muligt, når du overfører mellem rør.
Start med at forberede PCR-mixet til hver skabelon. Kombiner buffer, dNTPs, unikke forward primer, skabelon plasmid med den syntetiske luftfartsselskab gen, og fusion polymerase i henhold til manuskript retninger. Bland reagenser ved pipettering.
Tilføj 90 mikroliter af PCR-blandingen til 10 mikroliter af hver omvendt primer og bland. Se manuskriptet til termocyklingsforhold. Udfør omvendt transskription eller RT på RNA af interesse.
Kombiner en mikroliter af omvendt transskriptionsprimer, 10 nanogram RNA og 4.990 nanogram bæreblanding i et samlet volumen på 10 mikroliter. Bland ved pipettering op og ned. Varm blandingen til 65 grader Celsius i fem minutter og derefter straks placere den på is.
Forbered RT mix i henhold til manuskriptet retninger og tilsæt 28 mikroliter af blandingen til 10 mikroliter af RNA. Rørindholdet i røret blandes ved at pipettere, indtil det er homogent. Kør RT i en termocykler.
Når omvendt transskription er færdig, rense produktet med DNase og RNase-fri SPRI magnetiske perler. Tilsæt perlerne til RT mix ved et volumenforhold på 1,8 til en og bland godt ved pipettering. Lad blandingen sidde ved stuetemperatur i fem minutter.
Derefter placere perlerne på en magnetisk stå og lad dem adskille i fem minutter. Kassér supernatanten og tilsæt 200 mikroliter frisklavet 70% ethanol til perlerne. Bland ikke perlerne eller tag dem af den magnetiske stativ og fjern ethanolen umiddelbart efter tilsætning.
Hold røret på magnetstanden, og fjern alle spor af ethanol ved at skubbe eventuelle resterende dråber ud med en P10-pipette. Øjeblikkelig tilsættes 42 mikroliter vand, og pipette op og ned 60 gange for at elute prøve, idet pas på ikke at forårsage skumdannelse. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i fem minutter uden låget og adskiv derefter perlerne på den magnetiske stander.
Derefter overføre supernatant til et nyt sæt rør, der tager sig af at hente alle supernatant men undgå perle fremfør. Efter behandling med RNase I blandes 45 mikroliter af prøven med 105 mikroliter af tilberedte streptavidinperler og inkuberes ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Under inkubationen pipettes prøven hvert 10.
Derefter adskille perlerne på den magnetiske stativ og fjern supernatanten. Vask perlerne med buffere A, B og C.Starting med buffer A, resuspend perlerne i 150 mikroliter af buffer. Separat på den magnetiske stå i to til tre minutter, og derefter fjerne supernatant.
Forvarm buffere B og C til 37 grader Celsius og gentag vasketrinnene. For at fjerne alle ikke-udjævnede RNA, er det afgørende at vaske streptavidin perler og rørvægge grundigt og helt at fjerne vaskebufferen, før du tilføjer den næste. For at frigive cDNA, resuspend perlerne i 35 mikroliter af 1X RNase I buffer og inkubere ved 95 grader Celsius i fem minutter.
Efter inkubation, straks placere perlerne på is i to minutter. Adskiv perlerne på en magnetisk stativ og overfør supernatanten til et nyt sæt rør. Opsalpende perlerne i 30 mikroliter af 1X RNase I buffer og derefter adskille på en magnetisk stand.
Kombiner supernatanten med den tidligere indsamlede supernatant for et samlet volumen på omkring 65 mikroliter. Udfør qPCR for at bestemme antallet af PCR-cyklusser til forstærkning af målbiblioteket. Forbered qPCR master mix til at forstærke hele biblioteker af DNA fra bæreren.
Indstil termocyklingsbetingelser i henhold til manuskriptretninger, og forstærkere den forberedte prøve. SLIC-CAGE-protokollen gør det muligt at få sekvenseringsklare biblioteker fra nanogram af start RNA-materiale. Fragmentets længde i det endelige bibliotek varierer mellem 200 og 2.000 basispar.
Kortere fragmenter er PCR-artefakter og kan forårsage sekventeringsproblemer ned ad linjen. Yderligere runder af størrelse valg kan udføres for at fjerne dem. Sammenlignet med NanoCAGE udviser SLIC-CAGE betydeligt bedre ydeevne ved identifikation af transskriptionssted, hvilket fremgår af modtagerens driftskarakteristikakurver af de to teknikker, der udføres på forskellige mængder S.cerevisiae total RNA.
Når du udfører denne protokol, er det vigtigt at huske på, at eksempeltab kan føre til biblioteker med lav kompleksitet. For at forhindre det skal der anvendes lavbindende pipettespidser og rør. Uden SLIC-CAGE har promotoranalyse af forskellige celletyper hidtil været utilgængelig.
Dette omfatter analyse af embryonale udviklingsstadier eller embryonale væv fra en lang række modelorganismer.
