Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Wellcome Trust Grant (106954), der blev tildelt B. L. og medicinsk Forskningsråd (MRC)-kernefinansiering (MC-A652-5QA10). N. C. blev støttet af EMBO Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. blev støttet af Medical Research Council UK; B. L. blev støttet af Medical Research Council UK (MC UP 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

Et patent på nedbrydelig transportør-RNA/DNA er blevet udfyldt.

For vellykkede SLIC-CAGE bibliotek præparater, er det afgørende at bruge lav-bindende tips og rør for at forhindre prøve tab på grund af prøve adsorption. I alle trin, der involverer hentning af supernatanten, anbefales det at inddrive den entiresample volumen. Da protokollen har flere trin, vil kontinuerlig stikprøve tab føre til mislykkede biblioteker.
Hvis CAGE (nAnT-iCAGE) ikke er blevet udført rutinemæssigt, er det bedst at teste SLIC-CAGE med forskellige input mængder (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) af samme totale RNA-prøve og Sammenlign med nAnT-iCAGE-biblioteker, der tilberedes ved hjælp af 5 μg total RNA. Hvis nAnT-iCAGE biblioteket ikke lykkes (mindre end 0,5-1 ng af DNA-biblioteket opnået pr. prøve), SLIC-CAGE er usandsynligt, at arbejde, og prøve tab skal minimeres.
Et vigtigt skridt til at sikre høj kvalitet biblioteker blottet for ikke-under brudt RNA eller rRNA er Cap-fældefangst beskrevet i afsnit 7. Det er meget vigtigt, at streptavidin perler resuspenderes grundigt i vaske buffere, og at vaske bufferne fjernes, før du fortsætter til næste vask trin eller eluering af cDNA.
Hvis resultaterne fra qPCR efter den første runde af bære nedbrydning ikke viser nogen forskel mellem brugen af adaptor_f1 og carrier_f1-primere, anbefales det stadig at fortsætte protokollen. Hvis forskellen i CT-værdier efter anden runde af bære nedbrydning er mindre end fem, anbefales en tredje runde af bære nedbrydning. Vi har aldrig fundet en tredje runde af nedbrydning nødvendig, og hvis det sker, anbefales det at erstatte de homing endonuklease bestande.
Yderligere runder af PCR-forstærkning kan føjes til protokollen, hvis det endelige antal af det opnåede bibliotek ikke er nok til sekventering. PCR-forstærkning kan derefter indstilles med et minimalt antal forstærknings cyklusser, der er nødvendige for at give tilstrækkeligt materiale til sekvensering, under hensyntagen til prøve tabet, der ikke kan undgås i størrelses valget. Rensning eller størrelsesvalg ved hjælp af SPRI-magnetiske perler skal derefter udføres, indtil alle små (< 200 BP) fragmenter fjernes (hvis det er nødvendigt, skal du bruge 0,6:1 perler til prøveforhold), og biblioteket bør kvantificeres ved hjælp af Picogreen.
Biblioteker kan sekvenseres i single-end eller parret-end-tilstand. Ved hjælp af sekvensering af parrings-end-sekvenser kan der indhentes oplysninger om transskription isoformer. Desuden, som reverse transkription udføres ved hjælp af en tilfældig primer (TCT-N6, N6 at være en tilfældig hexamer), oplysninger fra sekvenseret 3 '-end kan bruges som unikke MOLEKYLÆRE identifikatorer (Umi) at kollapse PCR dubletter. Da der anvendes et moderat antal PCR-amplifikationscyklusser (op til 18), er det tidligere blevet konstateret, at brugen af UMIs er unødvendig.
Da kernen i protokollen er baseret på nAnT-iCAGE11, SLIC-Cage bruger otte stregkoder. Derfor understøttes multiplexing af mere end otte prøver ikke i øjeblikket. Desuden er både SLIC-CAGE og nAnT-iCAGE ikke egnet til at opfange RNAs kortere end 200 BP, da protokollerne er designet til at fjerne linkers og PCR artefakter gennem size-udelukkelse med AMPure XP perler.
SLIC-CAGE er den eneste objektive lav-input single-nucleotid opløsning metode til kortlægning transskription start sites ved hjælp af nanogram af det samlede RNA materiale. Alternative metoder er afhængige af den omvendte transkriptases skabelon koblings aktivitet til stregkode udjævnet RNA i stedet for Cap-fældefangst (f. eks. er NanoCAGE15 og nanop16). På grund af skabelon Skift udviser disse metoder sekvens specifikke bias i Tsss-detektion, hvilket fører til et stigende antal falske positive tss'er og et fald i antallet af sande Tsss9,10.

Cap analyse af genekspression (CAGE) er en metode, der anvendes til single-nucleotid opløsning genom-dækkende kortlægning af RNA polymerase II transkription start sites (TSSs)1. Dens kvantitative karakter giver også 5 '-end centreret udtryks profilering. Regioner omkring Tsss (ca. 40 BP upstream og downstream) er kerne promotorer og repræsenterer den fysiske placering, hvor RNA polymerase II og generelle transkription faktorer binder (revideret tidligere2,3). Oplysninger om de nøjagtige placeringer af TSSs kan bruges til Core Promoter opdagelse og til overvågning af promotor dynamik. Desuden, som aktive smagsforstærkere udviser underskrifter af tovejs transskription, Cage data kan også bruges til at øge opdagelsen og overvågning af forstærker dynamik4. CAGE metode er for nylig steget i popularitet på grund af sin brede anvendelse og brug i højt profilerede forskningsprojekter såsom ENCODE5, modencode6, og fantom projekter7. Desuden viser TSS-oplysninger sig også at være vigtige for at skelne sundt og sygt væv, da sygdomsspecifikke Tss'er kan anvendes til diagnostiske formål8.
Selv om flere metoder til TSS kortlægning er tilgængelige (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), vi og andre har for nylig vist, at bur er den mest upartisk metode til at indfange sande TSSs med det mindste antal falske positiver9 , 10. den nylige Cage-protokol, NAnT-icage11, er den mest objektive protokol for TSS-profilering, da den undgår at skære fragmenter til korte mærker ved hjælp af begrænsnings enzymer og ikke bruger PCR-forstærkning. En begrænsning af nAnT-iCAGE-protokollen er kravet om en stor mængde udgangsmateriale (f. eks. 5 μg total RNA for hver prøve). For at besvare specifikke, biologisk relevante spørgsmål er det ofte umuligt at opnå så store mængder af udgangsmateriale (f. eks. til FACS-sorterede celler eller tidlige embryonale stadier). Endelig, hvis nAnT-iCAGE er en succes, kun 1-2 ng af DNA-bibliotek materiale er tilgængelig fra hver prøve, hvilket begrænser den opnåelige sekvensering dybde.
For at aktivere TSS profilering ved hjælp af kun nanogram af total RNA, har vi for nylig udviklet super-low input Carrier-CAGE10 (SLIC-Cage, figur 1). SLIC-CAGE kræver kun 10 ng af total RNA for at opnå høj kompleksitet biblioteker. Vores protokol er afhængig af det omhyggeligt designede syntetiske RNA-luftfartsselskab, der er føjet til RNA af interesse for at opnå i alt 5 μg RNA-materiale. Det syntetiske luftfartsselskab efterligner målet DNA-bibliotek i længde fordeling for at undgå potentielle bias, der kunne være forårsaget af homogene molekyler i overskud. Sekvensen af bæreren er baseret på sekvensen af Escherichia coli leucyl-tRNA syntetase genet (tabel 1) af to årsager. For det første vil eventuelle rester af bæreren i det endelige bibliotek, selv om sekvenseret, ikke knyttes til et eukaryotisk genom. For det andet, da E. coli er en mesofile art, er dens husholdnings gener optimeret til det temperaturområde, der passer til SLIC-Cage. Bære sekvensen er også indlejret med homing endonukleasegenkendelses steder for at tillade specifik nedbrydning af DNA afledt af bære-RNA-molekyler. Det mål, prøve afledte bibliotek forbliver intakt, da de homing endonuklease anerkendelse steder er lange (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) og statistisk usandsynligt at blive fundet i eukaryotisk genomer. Efter specifik nedbrydning af bæreren og fjernelse af fragmenter efter størrelses udelukkelse, er målbiblioteket PCR forstærket og klar til næste generations sekvensering. Afhængigt af start RNA-mængden (1-100 ng) forventes der mellem 13-18 PCR-forstærknings cyklusser. Den endelige mængde DNA pr. prøve spænder mellem 5-50 ng, hvilket giver tilstrækkeligt materiale til meget dyb sekvensering. Når der kun bruges 1-2 ng af det totale RNA, kan der påvises ægte TSSs; bibliotekerne forventes dog at være af mindre kompleksitet. Da SLIC-CAGE er baseret på nAnT-iCAGE-protokol11, giver den mulighed for multiplexing af op til otte prøver før sekventering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

Cap analyse af genekspression (CAGE) er en metode, der anvendes til single-nucleotid opløsning påvisning af RNA polymerase II transkription start sites (TSSs). Nøjagtig detektering af Tss'er øger identifikationen og opdagelsen af kerne promotorer. Desuden kan aktive smagsforstærkere påvises gennem signaturer af tovejs transkription initiering. Beskrevet her er en protokol til udførelse af super-lav input Carrier-bur (SLIC-bur). Denne SLIC-tilpasning af CAGE-protokollen minimerer RNA-tab ved kunstigt at øge RNA-mængden ved hjælp af et in vitro-transskriberet RNA-bæremix, der føjes til stikprøven af interesse, hvilket muliggør Biblioteks klargøring fra nanogram-mængder af total RNA (dvs. tusinder af celler). Bæreren efterligner den forventede fordeling af fragment længden i DNA-biblioteket og eliminerer dermed de skævheder, der kan forårsages af den overflod af en homogen bærer. I de sidste stadier af protokollen, er bæreren fjernes gennem nedbrydning med homing endonukleaser og målbiblioteket forstærkes. Målprøve biblioteket er beskyttet mod nedbrydning, da de homing endonukleasegenkendelses steder er lange (mellem 18 og 27 BP), hvilket gør sandsynligheden for deres eksistens i den eukaryotiske genomer meget lav. Slutresultatet er et DNA-bibliotek, der er klar til næste generations sekvensering. Alle trin i protokollen, op til sekventering, kan fuldføres inden for 6 dage. Bære præparatet kræver en fuld arbejdsdag; Det kan dog tilberedes i store mængder og holdes frosset ved-80 °C. Når den er sekvenseret, kan aflæsninger behandles for at opnå genom-dækkende single-nukleotid-opløsning Tsss. Tsss kan bruges til Core Promoter eller forstærker opdagelse, giver indsigt i gen regulering. Når dataene er aggregeret til initiativtagerne, kan de også bruges til 5 '-centreret udtryks profilering.

I denne rapport beskrives den komplette SLIC-CAGE-protokol til indhentning af sekvensklare biblioteker fra nanogram af udgangs totalt RNA-materiale (figur 1). For at opnå det syntetiske RNA-bæremix skal PCR-bære skabelonerne først forberedes og gel renses for at eliminere PCR-side produkter (figur 2a). Hver PCR skabelon (ti i alt) er produceret ved hjælp af en fælles fremad, men en anden reverse primer (tabel 2), hvilket fører til forskellige LÆNGDER af PCR skabelon for at muliggøre Størrelsesvariation af syntetiske RNA-bærere. Når de er renset, anvendes PCR-skabeloner til in vitro-transkription af bære molekyler. Der forventes et enkelt RNA-bære produkt, hvis skabelonerne er gel-renset (Se repræsentativ gel-analyse i figur 2b). Klargøring af bæreren kan opskaleres afhængigt af behovet, og når de tilberedes, blandes og fryses ved-80 °C til fremtidig brug.
Ved hjælp af den anbefalede minimale mængde af prøve total RNA (10 ng) kombineret med 16-18 cyklusser af PCR-forstærkning, kan der opnås høj kompleksitet SLIC-CAGE biblioteker. Antal PCR-cyklusser, der er nødvendige for at forstærke det endelige bibliotek, afhænger meget af mængden af det samlede input-RNA, der anvendes (det forventede antal cyklusser er vist i tabel 4).
Efter den første runde af nedbrydning, i qPCR resultater (trin 17), den forventede forskel mellem CT værdier opnået ved hjælp af adaptor_f1 eller carrier_f1 primer er 1-2, med CT-værdier opnået med adaptor_f1 lavere end med carrier_f1.
Fordelingen af fragment længder i det endelige bibliotek er mellem 200-2000 BP med den gennemsnitlige fragment størrelse af 700-900 BP (baseret på regionen analyse ved hjælp af Bioanalyzer software, figur 4b, D). Kortere fragmenter, som præsenteret i figur 4a, C, skal fjernes ved yderligere runder af størrelse-udelukkelse (trin 20-21). Disse korte fragmenter er PCR-forstærknings artefakter og ikke målbiblioteket. Bemærk, at kortere fragmenter klynge bedre på sekvensering flow celler og kan forårsage sekvensering problemer.
Den forventede mængde biblioteksmateriale, der er opnået pr. prøve, er mellem 5-50 ng. Betydeligt lavere beløb er vejledende for stikprøve tabet i løbet af protokollen. Hvis den opnåede lave mængde er tilstrækkelig til sekventering (2-3 ng af de poolede biblioteker er nødvendig), kan bibliotekerne være af mindre kompleksitet (se nedenfor).
Afhængigt af sekvente Rings maskinen skal mængden af det bibliotek, der indlæses på flowcellen, muligvis optimeres. Ved hjælp af en Illumina HiSeq 2500, lastning 8-12 pM SLIC-CAGE biblioteker giver i gennemsnit 150-200 millioner læser, med > 80% af læser passerer kvalitet score Q30 som tærskel.
De opnåede læsninger er derefter knyttet til reference genomet [for 50 BP læser, Bowtie212 kan bruges med standardparametre, der tillader nul mismatch per frø sekvens (22 BP)]. Forventet kortlægnings effektivitet afhænger af det totale RNA-input beløb og er vist i tabel 5. Den unikt kortlagte læser kan derefter indlæses i R grafisk og statistisk computing miljø13 og behandles ved hjælp af cager (bioconductor pakke14). Pakke vignetten er nem at følge og forklarer arbejdsprocessen og behandlingen af de tilknyttede data i detaljer. En nem visuel kontrol af bibliotekets kompleksitet er distributionen af promotor bredde, da biblioteker med lav kompleksitet vil have kunstigt smalle promotorer (figur 5a, SLIC-Cage-bibliotek afledt af 1 ng af det totale RNA, for detaljer se tidligere publikation10). Men selv den lave kompleksitet SLIC-CAGE biblioteker tillader identifikation af sande CTSSs, med større præcision end alternative metoder til lav/mellem-input TSS kortlægning (figur 5b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> Figur 1: Trin i SLIC-Cage-protokollen. Prøve-RNA blandes med RNA-bære blandingen for at opnå 5 μg total RNA-materiale. cDNA synteseres gennem omvendt transkription og hætten oxideres ved hjælp af natrium periodate. Oxidation tillader fastgørelse af biotin til hætten ved hjælp af biotin hydrazid. Biotin bliver knyttet til Mrna's 3 ′ ende, da det også oxideres ved hjælp af natrium periodate. For at eliminere biotin fra mRNA: cDNA-hybrider med ufuldstændigt syntetiseret cDNA og fra de 3 ′ ender af mRNA, er prøverne behandlet med RNase I. cDNA, der nåede 5 ′ enden af mRNA vælges derefter ved affinitet rensning på streptavidin magnetiske perler ( Cap-fældefangst). Efter frigivelse af cDNA, 5 ′-og 3 ′-linkers er ligeret. Bibliotekets molekyler, der stammer fra bæreren nedbrydes ved hjælp af I-SceI og I-CeuI homing endonukleaser og fragmenter fjernes ved hjælp af SPRI magnetiske perler. Biblioteket er derefter PCR forstærket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Figur 2: repræsentativ gel-analyse af Carrier PCR-skabeloner og carrier in vitro-udskrifter. (A) Carrier PCR skabeloner før gel rensning: den første brønd indeholder 1 KBP markør, efterfulgt af Carrier PCR skabeloner 1, 1-10. B) transskriptioner af bærestof in vitro: den første brønd indeholder 1 KBP-mærket, efterfulgt af Trans skriptioner 1-10. Carrier transkriptioner blev denatureret ved opvarmning i 5 min ved 95 °C før lastning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Figur 3: repræsentativ DNA-kvalitet (høj følsomhed DNA-chip) spor af SLIC-Cage før første runde af bæreren nedbrydning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Figur 4: repræsentativ DNA-kvalitet (Højfølsom DNA-chip) spor af SLIC-Cage-biblioteker efter PCR-forstærkning. (A) SLIC-bur bibliotek, der kræver yderligere størrelse-valg til fjernelse af korte fragmenter. (B) SLIC-bur bibliotek efter størrelsesvalg ved hjælp af 0,6 x spri perler til prøveforhold. (C) SLIC-Cage bibliotek med lavere output beløb, der kræver størrelsesvalg til fjernelse af kort fragment. D) SPALTE-bur-bibliotek med lavere udgangstal efter størrelsesvalg med 0,6:1 spri-perler til prøveforhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Figur 5: Validering af SLIC-Cage-biblioteker. (A) fordeling af tagklyngens interkvantile bredder i SLIC-Cage-biblioteker fremstillet af 1,5 eller 10 ng af s. cerevisiae total-RNA og i NAnT-icage-biblioteket fremstillet af 5 μg s. cerevisiae total-RNA. En stor mængde smalle tagklynger i biblioteket med 1 ng SLIC-CAGE indikerer dens lave kompleksitet. B) Roc-kurver for CTSS-identifikation i S. cerevisiae SLIC-Cage-biblioteker. Alle S. cerevisiae NAnT-Icage CTSSs blev brugt som et sandt sæt. (C) Roc kurver for CTSS-identifikation i S. cerevisiae nanocage-biblioteker. Alle S. cerevisiae NAnT-Icage CTSSs blev brugt som et sandt sæt. Sammenligning af ROC-kurver viser, at SLIC-CAGE i høj grad overgår nanoCAGE i CTSS-identifikation. Data fra ArrayExpress E-MTAB-6519 blev brugt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tabel 1: sekvens af bære syntetisk gen. I-SceI sites er fed og kursiseret i lilla, og I-CeuI anerkendelser sites er grønne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Luftfartsselskab</td>
			<td colspan="2">omvendt primer 5 '-3 '</td>
			<td>PCR produkt længde/BP</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386 af</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* Forward primer er den samme for alle Carrier skabeloner. Understreget er T7-promotoren. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: grundere til forstærkning af bære skabelonen. Forward primer er den samme for alle bære skabeloner. Understreget er T7-promotoren. PCR_GN5_f1: Taatacgactcactatagnnnnncagcgttcgcta. Ved hjælp af forskellige omvendte grundere, PCR skabeloner og dermed Carrier RNAs af forskellig længde er produceret.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Luftfartsselskab</td>
			<td>Længde</td>
			<td>ikke-reducerede/μg</td>
			<td>øvre grænse/μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034 af</td>
			<td>3,96 af</td>
			<td>0,45 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966 af</td>
			<td>8,36 af</td>
			<td>0,95 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889 af</td>
			<td>4,4 af</td>
			<td>0,5 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821 af</td>
			<td>6,6 af</td>
			<td>0,75 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744 af</td>
			<td>4,4 af</td>
			<td>0,5 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676 af</td>
			<td>3,08 af</td>
			<td>0,35 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599 af</td>
			<td>4,4 af</td>
			<td>0,5 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531 af</td>
			<td>3,96 af</td>
			<td>0,45 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454 af</td>
			<td>2,64 af</td>
			<td>0,3 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386 af</td>
			<td>2,2 af</td>
			<td>0,25 af</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: RNA-bæremix. I alt 49 μg af bæreren mix 0,3-1 KBP: ikke-onapped = 44 μg, udjævnet = 5 μg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samlet RNA-input/ng</td>
			<td>PCR-cyklusser</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng i</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng i</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng i</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng af</td>
			<td>15-16 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng i</td>
			<td>14-15 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14 af</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Forventede antal PCR-cyklusser i afhængighed af total-RNA-input. Omtrentligt antal cyklusser er baseret på eksperimenter udført ved hjælp af Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster og mus musculus total RNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samlet RNA-input/ng</td>
			<td>% samlet kort</td>
			<td>% Entydigt tilknyttet</td>
			<td>% af fragtmand</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng i</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30 af</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng i</td>
			<td>60 af</td>
			<td>20-50 af</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng i</td>
			<td>60-70 af</td>
			<td>40-60 af</td>
			<td>5-10 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng af</td>
			<td>60-70 af</td>
			<td>40-60 af</td>
			<td>5-10 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng i</td>
			<td>65-80 af</td>
			<td>40-70 af</td>
			<td>0-5 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65-80 af</td>
			<td>40-70 af</td>
			<td>0-3 af</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70-85 af</td>
			<td>40-70 af</td>
			<td>0-2 af</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: forventet kortlægnings effektivitet og afhængighed af det totale RNA-input beløb. Omtrentlige tal er præsenteret og baseret på eksperimenter udført ved hjælp af Saccharomyces cerevisiae og mus musculus total RNA.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Cap analyse af gene Expression (CAGE) er en metode til genomdækkende kvantitativ kortlægning af mRNA 5 ' ender til at indfange RNA polymerase II transskription startsteder på en enkelt-nukleotid opløsning. Dette arbejde beskriver en low-input (SLIC-CAGE) protokol til generering af høj kvalitet biblioteker ved hjælp af nanogram-mængder af total RNA.

Transskription start side tilknytning ved hjælp af super-low input Carrier-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for genregulering, da den muliggør centrale promotor og forstærker opdagelse ved hjælp af små mængder af udgangsmateriale. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver upartisk, genom-dækkende enkelt nukleotid opløsning kortlægning af RNA polymerase II transskriptionelle start steder ved hjælp af kun 10 nanogram af samlede RNA. CAGE har vist sig at være uvurderlig for at afdække sygdomsrelaterede transskription start steder, der kan bruges som diagnostiske markører.SLIC-CAGE udvider disse opdagelser til at skalere prøver såsom vævsbiopsier. SLIC-CAGE er ideel til dybdegående og høj opløsning promotor analyse af skrøbelige celletyper, herunder tidlige embryonale udviklingsstadier eller embryonale væv fra en bred vifte af model organismer. Da der er mange trin i denne protokol, er det afgørende at minimere prøvetab i hvert trin ved at passe på at hente så meget materiale som muligt, når du overfører mellem rør.Start med at forberede PCR-mixet til hver skabelon. Kombiner buffer, dNTPs, unikke forward primer, skabelon plasmid med den syntetiske luftfartsselskab gen, og fusion polymerase i henhold til manuskript retninger. Bland reagenser ved pipettering.Tilføj 90 mikroliter af PCR-blandingen til 10 mikroliter af hver omvendt primer og bland. Se manuskriptet til termocyklingsforhold. Udfør omvendt transskription eller RT på RNA af interesse.Kombiner en mikroliter af omvendt transskriptionsprimer, 10 nanogram RNA og 4.990 nanogram bæreblanding i et samlet volumen på 10 mikroliter. Bland ved pipettering op og ned. Varm blandingen til 65 grader Celsius i fem minutter og derefter straks placere den på is.Forbered RT mix i henhold til manuskriptet retninger og tilsæt 28 mikroliter af blandingen til 10 mikroliter af RNA. Rørindholdet i røret blandes ved at pipettere, indtil det er homogent. Kør RT i en termocykler.Når omvendt transskription er færdig, rense produktet med DNase og RNase-fri SPRI magnetiske perler. Tilsæt perlerne til RT mix ved et volumenforhold på 1,8 til en og bland godt ved pipettering. Lad blandingen sidde ved stuetemperatur i fem minutter.Derefter placere perlerne på en magnetisk stå og lad dem adskille i fem minutter. Kassér supernatanten og tilsæt 200 mikroliter frisklavet 70% ethanol til perlerne. Bland ikke perlerne eller tag dem af den magnetiske stativ og fjern ethanolen umiddelbart efter tilsætning.Hold røret på magnetstanden, og fjern alle spor af ethanol ved at skubbe eventuelle resterende dråber ud med en P10-pipette. Øjeblikkelig tilsættes 42 mikroliter vand, og pipette op og ned 60 gange for at elute prøve, idet pas på ikke at forårsage skumdannelse. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i fem minutter uden låget og adskiv derefter perlerne på den magnetiske stander.Derefter overføre supernatant til et nyt sæt rør, der tager sig af at hente alle supernatant men undgå perle fremfør. Efter behandling med RNase I blandes 45 mikroliter af prøven med 105 mikroliter af tilberedte streptavidinperler og inkuberes ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Under inkubationen pipettes prøven hvert 10.Derefter adskille perlerne på den magnetiske stativ og fjern supernatanten. Vask perlerne med buffere A, B og C.Starting med buffer A, resuspend perlerne i 150 mikroliter af buffer. Separat på den magnetiske stå i to til tre minutter, og derefter fjerne supernatant.Forvarm buffere B og C til 37 grader Celsius og gentag vasketrinnene. For at fjerne alle ikke-udjævnede RNA, er det afgørende at vaske streptavidin perler og rørvægge grundigt og helt at fjerne vaskebufferen, før du tilføjer den næste. For at frigive cDNA, resuspend perlerne i 35 mikroliter af 1X RNase I buffer og inkubere ved 95 grader Celsius i fem minutter.Efter inkubation, straks placere perlerne på is i to minutter. Adskiv perlerne på en magnetisk stativ og overfør supernatanten til et nyt sæt rør. Opsalpende perlerne i 30 mikroliter af 1X RNase I buffer og derefter adskille på en magnetisk stand.Kombiner supernatanten med den tidligere indsamlede supernatant for et samlet volumen på omkring 65 mikroliter. Udfør qPCR for at bestemme antallet af PCR-cyklusser til forstærkning af målbiblioteket. Forbered qPCR master mix til at forstærke hele biblioteker af DNA fra bæreren.Indstil termocyklingsbetingelser i henhold til manuskriptretninger, og forstærkere den forberedte prøve. SLIC-CAGE-protokollen gør det muligt at få sekvenseringsklare biblioteker fra nanogram af start RNA-materiale. Fragmentets længde i det endelige bibliotek varierer mellem 200 og 2.000 basispar.Kortere fragmenter er PCR-artefakter og kan forårsage sekventeringsproblemer ned ad linjen. Yderligere runder af størrelse valg kan udføres for at fjerne dem. Sammenlignet med NanoCAGE udviser SLIC-CAGE betydeligt bedre ydeevne ved identifikation af transskriptionssted, hvilket fremgår af modtagerens driftskarakteristikakurver af de to teknikker, der udføres på forskellige mængder S.cerevisiae total RNA.Når du udfører denne protokol, er det vigtigt at huske på, at eksempeltab kan føre til biblioteker med lav kompleksitet. For at forhindre det skal der anvendes lavbindende pipettespidser og rør. Uden SLIC-CAGE har promotoranalyse af forskellige celletyper hidtil været utilgængelig.Dette omfatter analyse af embryonale udviklingsstadier eller embryonale væv fra en lang række modelorganismer.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro-transskription Analyser og deres anvendelse i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analyse af Ophør af Transcription Brug BrUTP-streng-specifikke Transskription Run-on (TRO) indflyvning

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tovejs Retroviral Integration Site PCR Metode og Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Kortlægning af MLV Integration Sites til at definere Cell-specifikke Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genom-dækkende overvågning af transskription fejl i Eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Forbedret gær One-hybrid skærme til at identificere transskription faktor Binding til menneskelige DNA-sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimination og kortlægning af primære og forarbejdede transskriptioner i majs mitokondrier ved hjælp af en cirkulær RT-PCR-baseret strategi

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...