Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Welkom Trust Grant (106954) toegekend aan B. L. en Medical Research Council (MRC) Core funding (MC-A652-5QA10). N. C. werd gesteund door EMBO lange termijn Fellowship (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. werd gesteund door de medische Raad van het onderzoek het UK; B. L. werd gesteund door het medisch Onderzoekraad het UK (MC omhoog 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

Een octrooi voor chemisch afbreekbare drager RNA/DNA is gevuld.

Voor succesvolle SLIC-CAGE bibliotheek voorbereidingen, is het essentieel om lage-bindende uiteinden en buizen te gebruiken om steekproef verlies te verhinderen toe te schrijven aan steekproef adsorptie. In alle stappen met betrekking tot het ophalen van de bovendrijvende, is het raadzaam om het entiresample volume terug te vorderen. Aangezien het protocol meerdere stappen heeft, zal het continue steekproef verlies leiden tot mislukte bibliotheken.
Als CAGE (nAnT-iCAGE) niet routinematig is uitgevoerd, het is best om SLIC-CAGE met verschillende input bedragen (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) van de zelfde totale steekproef van RNA te testen en te vergelijken met de bibliotheken van nAnT-iCAGE die gebruikend 5 µ g van totaal RNA worden voorbereid. Als de bibliotheek nAnT-iCAGE niet succesvol is (minder dan 0.5-1 ng van de bibliotheek van DNA die per steekproef wordt verkregen), is de SLIC-kooi onwaarschijnlijk om te werken, en steekproef verlies moet worden geminimaliseerd.
Een kritieke stap om de bibliotheken van uitstekende kwaliteit te verzekeren verstoken van niet afgetopte gedegradeerd RNA of rRNA is GLB-overlapping die in sectie 7 wordt beschreven. Het is zeer belangrijk dat de streptavidin kralen grondig worden opgehangen in het wassen buffers en dat de wassen buffers worden verwijderd voorafgaand aan de voortzetting van de volgende wassen stap of elutie van cDNA.
Als de resultaten van de qPCR na de eerste ronde van de vervoerder degradatie tonen geen verschil tussen het gebruik van adaptor_f1 en carrier_f1 primers, voortzetting van het protocol is nog steeds aanbevolen. Als na de tweede ronde van de vervoerder degradatie, het verschil in CT-waarden is minder dan vijf, een derde ronde van de vervoerder degradatie wordt aanbevolen. We hebben nooit gevonden een derde ronde van degradatie nodig, en als het zich voordoet, is het raadzaam om de besturen endonuclease voorraden te vervangen.
De extra rondes van PCR versterking kunnen aan het protocol worden toegevoegd als het definitieve bedrag van de verkregen bibliotheek niet genoeg voor het rangschikken is. PCR de versterking kan dan met minimaal aantal versterkings cycli worden geplaatst nodig om genoeg materiaal voor het rangschikken op te leveren, rekening houdend met steekproef verlies dat niet in grootte selectie kan worden vermeden. Reiniging of grootte selectie met behulp van SPRI magnetische kralen moet vervolgens worden uitgevoerd totdat alle kleine (< 200 BP) fragmenten worden verwijderd (indien nodig, gebruik 0.6:1 kralen naar sample ratio), en de bibliotheek moet worden gekwantificeerd met behulp van Picogreen.
Bibliotheken kunnen worden gesequenced in de modus voor eenmalige of gekoppelde einden. Met behulp van gepaarde-einde sequencing, informatie over transcript isovormen kan worden verkregen. Daarnaast, als omgekeerde transcriptie wordt uitgevoerd met behulp van een willekeurige primer (TCT-N6, n6 is een willekeurige hexamer), informatie van de gesequenced 3 '-end kan worden gebruikt als unieke MOLECULAIRE Identifiers (Umi) om PCR duplicaten instorten. Aangezien een gematigd aantal PCR versterkings cycli (tot 18) wordt gebruikt, is het gebruik van UMIs eerder gevonden onnodig te zijn.
Aangezien de kern van het Protocol zich op nAnT-iCAGE11baseert, gebruikt SLIC-Cage acht barcodes. Daarom is multiplexing meer dan acht monsters momenteel niet ondersteund. Bovendien zijn zowel SLIC-CAGE als nAnT-iCAGE niet geschikt voor het vangen van ASE korter dan 200 BP, aangezien de protocollen worden ontworpen om linker en PCR artefacten door grootte te verwijderen-uitsluiting met AMPure XP parels.
SNEETJE-kooi is het uitsluitend onbevooroordeeld loeien-invoer-single-nucleotide voornemen werkwijze voor kartering transcriptie initiatie voorsprong terreinen using nanograms van totaal RNA materiaal. Alternatieve methoden vertrouwen op de template switching activiteit van de omgekeerde transcriptase naar barcode afgetopte RNA in plaats van Cap-trapping (bijv., NanoCAGE15 en NanoPARE16). Wegens malplaatje het schakelen, vertonen deze methodes opeenvolging-specifieke biases in TSSs opsporing, die tot verhoogde aantallen van valse positieve TSSs en verminderde aantallen van ware TSSs9,10leidt.

De analyse van het GLB van de uitdrukking van het gen (kooi) is een methode die voor enig-nucleotide resolutie genoom-brede in kaart brengen wordt gebruikt van RNA polymerase II transcriptie begin plaatsen (TSSs)1. De kwantitatieve aard maakt het ook mogelijk 5 '-end centric Expression profilering. Regio's rond de TSSs (ongeveer 40 BP stroomopwaarts en stroomafwaarts) zijn kern promotors en vertegenwoordigen de fysieke locatie waar RNA polymerase II en algemene transcriptiefactoren binden (herzien eerder2,3). Informatie over de exacte locaties van TSSs kan gebruikt worden voor Core Promoter Discovery en voor het monitoren van promotor dynamiek. Bovendien, als actieve enhancers vertonen handtekeningen van bidirectionele transcriptie, kooi gegevens kunnen ook worden gebruikt voor Enhancer ontdekking en monitoring van Enhancer Dynamics4. De methodologie van de kooi heeft onlangs in populariteit wegens zijn brede toepassing en gebruik in high-profile onderzoekprojecten zoals coderen5, modENCODE6, en Fantom projecten7gestegen. Bovendien, TSS informatie blijkt ook belangrijk te zijn voor het onderscheiden van gezonde en zieke weefsels, zoals ziekte-specifieke TSSs kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden8.
Hoewel verschillende methoden voor TSS mapping beschikbaar zijn (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-aftopping), hebben wij en anderen onlangs aangetoond dat CAGE is de meest onbevooroordeelde methode om echte TSSs te vangen met het minste aantal valse positieven9 , 10. het recente kooi protocol, NAnT-iCAGE11, is het meest onbevooroordeelde protocol voor TSS profilering, aangezien het het snijden van de fragmenten aan korte markeringen vermijdt gebruikend beperkingsenzymen en gebruikt geen PCR versterking. Een beperking van het nAnT-iCAGE protocol is de vereiste voor een grote hoeveelheid van uitgangsmateriaal (b.v., 5 µ g van totaal RNA voor elk steekproef). Om specifieke, biologisch relevante vragen te beantwoorden, is het vaak onmogelijk om zulke hoge hoeveelheden uitgangsmateriaal te verkrijgen (bijv. voor FACS cellen of vroege embryonale stadia). Tot slot als nAnT-iCAGE succesvol is, is slechts 1-2 ng van het materiaal van de bibliotheek van DNA beschikbaar van elk steekproef, daardoor beperkend de haalbare het rangschikken diepte.
Om TSS profilering met behulp van slechts nanograms van Total RNA, hebben we onlangs ontwikkeld super-low input Carrier-CAGE10 (SLIC-Cage, Figuur 1). SLIC-CAGE vereist slechts 10 ng van totaal RNA om hoge ingewikkeldheid bibliotheken te verkrijgen. Ons protocol vertrouwt op de zorgvuldig ontworpen synthetische drager van RNA die aan RNA van belang wordt toegevoegd om een totaal van 5 μg van het materiaal van RNA te bereiken. De synthetische drager bootst de doelbibliotheek van DNA in lengte distributie na om potentiële biases te vermijden die door homogene molecules kunnen worden veroorzaakt in overmaat. De volgorde van de vervoerder is gebaseerd op de volgorde van de Escherichia coli Leucyl-tRNA synthetase gen (tabel 1) om twee redenen. Ten eerste, elke rest van de vervoerder in de definitieve bibliotheek, zelfs indien gesequenced, zal niet kaart om een eukaryotische genoom. Ten tweede, aangezien E. coli een mesofiele soort is, worden zijn huishouden genen geoptimaliseerd voor de temperatuurwaaier geschikt voor SLIC-kooi. De carrier opeenvolging is ook ingebed met het automatisch berijden endonuclease erkenningsplaatsen om specifieke degradatie van DNA toe te staan die uit de molecules van RNA van de drager wordt afgeleid. De doelgroep, sample-afgeleide bibliotheek blijft intact, als de besturen endonuclease herkenning sites zijn lang (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) en statistisch onwaarschijnlijk te vinden in eukaryote genoom. Na specifieke degradatie van de drager en de verwijdering van fragmenten door grootte uitsluiting, wordt de doelbibliotheek PCR versterkt en klaar voor volgende-generatie het rangschikken. Afhankelijk van het beginnende bedrag van RNA (1-100 ng), tussen 13-18 PCR versterkings cycli zouden moeten worden vereist. Het uiteindelijke bedrag van DNA per elk monster varieert tussen 5-50 ng, waardoor voldoende materiaal voor zeer diepe sequencing. Wanneer het gebruiken van slechts 1-2 ng van totaal RNA, kan de ware TSSs worden ontdekt; echter, de bibliotheken zijn naar verwachting van een lagere complexiteit. Tenslotte, zoals sneetje-kooi zit op basis van naar de nAnT-iCAGE protocol11, op in staat stellen multiplexing van tot aan acht steekproef vooraleer voor sequencing.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

De analyse van het GLB van de uitdrukking van het gen (kooi) is een methode die voor enig-nucleotide resolutie opsporing wordt gebruikt van RNA polymerase II transcriptie begin plaatsen (TSSs). De nauwkeurige opsporing van TSSs verbetert identificatie en ontdekking van kern promotors. Daarnaast kunnen actieve enhancers worden gedetecteerd door middel van handtekeningen van bidirectionele transcriptie initiatie. Hier beschreven is een protocol voor het uitvoeren van Super-lage input Carrier-CAGE (SLIC-CAGE). Deze aanpassing SLIC van het kooi protocol minimaliseert de verliezen van RNA door de hoeveelheid van RNA kunstmatig te verhogen door middel van een in vitro getranscribeerde de vervoerder mengeling van RNA die aan de steekproef van belang wordt toegevoegd, waardoor bibliotheek voorbereiding van nanogramgebied-bedragen van totale RNA (dat wil zeggen, duizenden cellen). De vervoerder bootst de verwachte DNA-bibliotheek fragmentlengte verdeling, waardoor het elimineren van vooroordelen die kunnen worden veroorzaakt door de overvloed van een homogene drager. In de laatste stadia van het Protocol, wordt de drager verwijderd door degradatie met het automatisch besturen beperkingsendonucleases en de doelbibliotheek wordt versterkt. De doelsteekproef bibliotheek is beschermd tegen degradatie, aangezien de het besturen endonuclease erkenningsplaatsen lang (tussen 18 en 27 BP) zijn, makend de waarschijnlijkheid van hun bestaan in eukaryotic genoom zeer laag. Het eindresultaat is een DNA-bibliotheek klaar voor de volgende generatie sequencing. Alle stappen in het Protocol, tot sequencing, kunnen binnen 6 dagen worden voltooid. De vervoerder voorbereiding vereist een volledige werkdag; het kan echter worden bereid in grote hoeveelheden en bevroren gehouden bij-80 ° c. Eenmaal gesequenced, de leest kan worden verwerkt tot genoom-brede single-nucleotide resolutie TSSs te verkrijgen. TSSs kan gebruikt worden voor Core Promoter of Enhancer Discovery, die inzicht verschaft in Gene regulatie. Eenmaal samengevoegd tot promotors, kunnen de gegevens ook worden gebruikt voor 5 '-centric Expression profilering.

Dit rapport beschrijft het volledige SLIC-CAGE protocol voor het verkrijgen van sequencing-klaar bibliotheken van nanograms van beginnend totaal RNA materiaal (Figuur 1). Om de synthetische de drager mengeling van RNA te verkrijgen, eerst, moeten PCR drager malplaatjes worden voorbereid en gel-gezuiverd om PCR zij producten (Figuur 2a) te elimineren. Elke PCR-sjabloon (tien in totaal) wordt geproduceerd met behulp van een gemeenschappelijke voorwaartse, maar een andere omgekeerde primer (tabel 2), wat leidt tot verschillende lengtes van de PCR-sjabloon om de grootte variabiliteit van synthetische RNA dragers mogelijk te maken. Zodra gezuiverd, PCR worden de malplaatjes gebruikt voor in vitro transcriptie van de drager molecules. Een enkele RNA Carrier product wordt verwacht als de sjablonen zijn gel-gezuiverd (Zie representatieve gel-analyse in Figuur 2b). De voorbereiding van de vervoerder kan worden opgeschaald, afhankelijk van de noodzaak, en wanneer bereid, gemengd en bevroren bij-80 °C voor toekomstig gebruik.
Gebruikend de geadviseerde minimale hoeveelheid steekproef totaal RNA (10 ng) die met 16-18 cycli van PCR versterking wordt gecombineerd, kunnen de hoge ingewikkeldheid SLIC-kooi bibliotheken worden bereikt. Aantal PCR cycli die worden vereist om de definitieve bibliotheek te vergroten hoogst hangt van de hoeveelheid totale gebruikte input RNA af (het verwachte aantal cycli wordt voorgesteld in lijst 4).
Na de eerste ronde van degradatie, in qPCR resultaten (stap 17), het verwachte verschil tussen de CT-waarden verkregen met behulp van adaptor_f1 of carrier_f1 primer is 1-2, met CT-waarden verkregen met adaptor_f1 lager dan bij carrier_f1.
De verdeling van de fragment lengtes in de definitieve bibliotheek is tussen 200-2000 BP met de gemiddelde fragment grootte van 700-900 BP (gebaseerd op de regio analyse met behulp van bioanalyzer software, figuur 4b, D). Kortere fragmenten, zoals voorgesteld in figuur 4a, C, moeten worden verwijderd door extra rondes van grootte-uitsluiting (stappen 20-21). Deze korte fragmenten zijn PCR versterkings artefacten en niet de doelbibliotheek. Merk op dat kortere fragmenten cluster beter op de sequencing flow cellen en kan leiden tot sequencing problemen.
De verwachte hoeveelheid bibliotheekmateriaal verkregen per monster is tussen 5-50 ng. Significant lagere bedragen zijn indicatief voor monster verlies tijdens het protocol. Als de verkregen lage hoeveelheid genoeg is voor sequencing (2-3 ng van de gebundelde bibliotheken nodig is), kunnen de bibliotheken van lagere complexiteit (zie hieronder).
Afhankelijk van de sequencing machine, kan de hoeveelheid van de bibliotheek geladen op de flow cel moet worden geoptimaliseerd. Met behulp van een verlichtings HiSeq 2500, het laden van 8-12 pM SLIC-CAGE bibliotheken geeft gemiddeld 150-200 miljoen keer gelezen, met > 80% van de leest het passeren van de kwaliteit score Q30 als drempel.
De verkregen leest worden vervolgens in kaart gebracht om de referentie genoom [voor 50 BP leest, Bowtie212 kan worden gebruikt met standaard parameters die het mogelijk maken nul mismatches per zaad sequentie (22 BP)]. Verwachte mapping efficiency is afhankelijk van de totale RNA input bedrag en worden gepresenteerd in tabel 5. De uniek in kaart gebrachte leest kan dan worden geladen in R grafische en statistische computing omgeving13 en verwerkt met behulp van Cager (Bioconductor pakket14). Het pakket vignet is eenvoudig te volgen en verklaart de workflow en de verwerking van de toegewezen gegevens in detail. Een gemakkelijke visuele controle van de bibliotheek ingewikkeldheid is de distributie van de breedte van de promotor, aangezien de laag-ingewikkeldheid bibliotheken kunstmatig smalle promotors zullen hebben (figuur 5a, SLIC-kooi bibliotheek die uit 1 ng van totaal RNA wordt afgeleid, voor details zie vorige publicatie10). Echter, zelfs de lage-complexiteit SLIC-CAGE bibliotheken kunnen identificatie van echte CTSSs, met meer precisie dan alternatieve methoden voor low/medium-input TSS mapping (Figuur 5b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> Figuur 1: Stappen in het SLIC-Cage protocol. Het monster RNA wordt gemengd met de de drager mengeling van RNA om 5 µ g van het totale materiaal van RNA te bereiken. cDNA wordt gesynthetiseerd door omgekeerde transcriptie en de dop is geoxideerd met behulp van natrium periodate. Oxidatie maakt bevestiging van biotine aan de dop met behulp van biotine Hydrazide. Biotine wordt gehecht aan de mRNA 3 ′ einde, want het is ook geoxideerd met behulp van natrium periodate. Om Biotine van mRNA te elimineren: de hybriden van cDNA met onvolledig samengestelde cDNA en van 3 ′ einden van mRNA, worden de steekproeven behandeld met ASE I. cDNA dat bereikte het eind van 5 ′ van mRNA dan door affiniteit reiniging op streptavidin magnetische parels wordt geselecteerd ( Cap-trapping). Na versie van cDNA, zijn 5 ′-en 3 ′-linker afgebonden. De bibliotheek moleculen die voortkomen uit de drager worden gedegradeerd gebruikend I-SceI en I-CeuI het besturen beperkingsendonucleases en de fragmenten worden verwijderd gebruikend SPRI magnetische parels. De bibliotheek wordt dan PCR versterkt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Figuur 2: representatieve gel-analyse van vervoerder PCR templates en carrier in vitro transcripten. (A) PCR van de drager malplaatjes voorafgaand aan de reiniging van het gel: de eerste put bevat de 1 KBP teller, gevolgd door drager PCR malplaatjes 1, 1-10. (B) vervoerder in vitro transcripten: de eerste goed bevat de 1 KBP marker, gevolgd door vervoerder transcripten 1-10. De transcripten van de drager werden gedenatureerd door voor 5 min bij 95 °C voorafgaand aan lading te verwarmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Figuur 3: representatieve DNA-kwaliteit (hoge gevoeligheid DNA-chip) trace van SLIC-Cage voorafgaand aan de eerste ronde van de vervoerder degradatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Figuur 4: representatieve DNA-kwaliteit (hoge gevoeligheid DNA-chip) sporen van SLIC-Cage bibliotheken na PCR versterking. (A) SLIC-Cage bibliotheek die extra grootte-selectie voor verwijdering van korte fragmenten vereist. (B) SLIC-Cage bibliotheek na grootte-selectie gebruikend 0.6 x SPRI parels aan steekproef verhouding. (C) SLIC-kooi bibliotheek van lager output bedrag dat grootte-selectie voor verwijdering van kort fragment vereist. (D) SLIC-kooi bibliotheek van lager output bedrag na grootte-selectie gebruikend 0.6:1 SPRI parels aan steekproef verhouding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Figuur 5: Validatie van SLIC-Cage bibliotheken. (A) distributie van tag cluster interquantile breedtes in SLIC-Cage bibliotheken bereid uit 1, 5, of 10 ng van s. CEREVISIAE totaal RNA, en in de nAnT-iCAGE bibliotheek bereid van 5 µ g van s. cerevisiae totaal RNA. Een hoge hoeveelheid smalle markerings clusters in de 1 ng SLIC-kooi bibliotheek wijst op zijn lage ingewikkeldheid. (B) Roc krommen voor CTSS identificatie in S. CEREVISIAE SLIC-Cage bibliotheken. Alle S. cerevisiae NAnT-iCAGE CTSSs werden gebruikt als een echte set. (C) Roc krommen voor CTSS identificatie in S. cerevisiae nanoCAGE bibliotheken. Alle S. cerevisiae NAnT-iCAGE CTSSs werden gebruikt als een echte set. De vergelijking van ROC krommen toont aan dat SLIC-CAGE sterk overtreft nanoCAGE in CTSS identificatie. Gegevens van ArrayExpress E-MTAB-6519 werd gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Tabel 1: opeenvolging van het synthetische gen van de drager. I-SceI sites zijn vet en cursief in paars, en I-CeuI erkenningen sites zijn groen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Vervoerder</td>
			<td colspan="2">omgekeerde primer 5 '-3 '</td>
			<td>PCR de lengte van het product/BP</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* Voorwaarts primer is hetzelfde voor alle Carrier templates. Onderstreept is de volgorde van de promotor. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: primers voor Carrier template versterking. Voorwaarts primer is hetzelfde voor alle Carrier templates. Onderstreept is de volgorde van de promotor. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA. Gebruikend verschillende omgekeerde inleidingen, PCR malplaatjes en vandaar drager ASE van verschillende lengte worden geproduceerd.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Vervoerder</td>
			<td>Lengte</td>
			<td>niet-afgedekte/µ g</td>
			<td>afgetopt/µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8,36</td>
			<td>0,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6,6</td>
			<td>0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3,08</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2,64</td>
			<td>0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2,2</td>
			<td>0,25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: RNA Carrier mix. In totaal 49 µ g van de vervoerder mix 0.3-1 KBP: unaftoped = 44 µ g, afgetopt = 5 µ g.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totaal RNA input/ng</td>
			<td>PCR cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Verwacht aantal PCR cycli in afhankelijkheid van steekproef totale input van RNA. Het geschatte aantal cycli is gebaseerd op experimenten die worden uitgevoerd gebruikend Saccharomyces cerevisiae, fruitvliegje melanogaster, en Mus musculus totaal RNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totaal RNA input/ng</td>
			<td>% totaal toegewezen</td>
			<td>% uniek toegewezen</td>
			<td>% Carrier</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: verwachte mapping efficiency en afhankelijkheid van Total RNA input bedrag. Geschatte aantallen worden gepresenteerd en gebaseerd op experimenten uitgevoerd met behulp van Saccharomyces cerevisiae en Mus musculus Total RNA.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

De analyse van het GLB van de uitdrukking van het gen (kooi) is een methode voor genoom-brede kwantitatieve afbeelding van mRNA 5 ' einden om RNA polymerase II transcriptie begin plaatsen bij een enig-nucleotide resolutie te vangen. Dit werk beschrijft een laag-input (SLIC-kooi) protocol voor generatie van de bibliotheken van uitstekende kwaliteit gebruikend nanogramgebied-bedragen van totaal RNA.

Transcriptie start site mapping met behulp van Super-lage input Carrier-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van genregulatie, omdat het kernpromotor en versterkerdetectie mogelijk maakt met behulp van lage hoeveelheden uitgangsmateriaal. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onbevooroordeelde, genoom-brede enkele nucleotide resolutie mapping van RNA polymerase II transcriptie start sites met behulp van slechts 10 nanogram van de totale RNA. CAGE blijkt van onschatbare waarde voor het blootleggen van ziekte-geassocieerde transcriptie start sites die kunnen worden gebruikt als diagnostische markers.SLIC-CAGE breidt deze ontdekkingen uit tot schaalmonsters zoals weefselbiopten. SLIC-CAGE is bij uitstek geschikt voor een diepgaande en hoge resolutie promotoranalyse van kwetsbare celtypen, waaronder vroege embryonale ontwikkelingsstadia of embryonaal weefsel uit een breed scala aan modelorganismen. Aangezien er tal van stappen in dit protocol, is het van cruciaal belang om monsterverlies te minimaliseren in elke stap door ervoor te zorgen om zo veel mogelijk materiaal op te halen bij het overbrengen tussen buizen.Begin met het voorbereiden van de PCR-mix voor elke sjabloon. Combineer buffer, dPP's, unieke voorwaartse primer, template plasmid met het synthetische dragergen en fusiepolymeren volgens de handschriftaanwijzing. Meng reagentia door pipetting.Voeg 90 microliter van de PCR-mix toe aan 10 microliter van elke omgekeerde primer en meng. Raadpleeg het manuscript voor thermocycling voorwaarden. Voer omgekeerde transcriptie of RT uit op het RNA van belang.Combineer een microliter van omgekeerde transcriptie primer, 10 nanogram RNA, en 4, 990 nanogram drager mix in een totaal volume van 10 microliter. Meng door pipetting op en neer. Verwarm het mengsel vijf minuten op 65 graden Celsius en leg het vervolgens meteen op ijs.Bereid de RT-mix volgens de handschriftaanwijzingen en voeg 28 microliter van de mix toe aan 10 microliter RNA. Meng de inhoud van de buis door pipetteren tot homogeen. Voer RT in een thermocycler.Zodra de omgekeerde transcriptie is voltooid, zuivert u het product met DNase- en RNase-vrije SPRI magnetische kralen. Voeg de kralen toe aan de RT-mix met een volumeverhouding van 1,8 op één en meng goed door pipetting. Laat het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur zitten.Plaats vervolgens de kralen op een magnetische standaard en laat ze vijf minuten scheiden. Gooi de supernatant weg en voeg 200 microliter vers bereide 70% ethanol toe aan de kralen. Meng de kralen niet of haal ze niet van de magnetische standaard en verwijder de ethanol onmiddellijk na het toevoegen.Houd de buis op de magnetische standaard en verwijder alle sporen van ethanol door het duwen van de resterende druppels uit met een P10 pipet. Voeg onmiddellijk 42 microliter water toe en pipet 60 keer op en neer om het monster te elute, waarbij u ervoor zorgt dat er geen schuimvorming wordt veroorzaakt. Broed de buis vijf minuten lang in op 37 graden Celsius zonder deksel en scheid vervolgens de kralen op de magnetische standaard.Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe set buizen, waarbij u ervoor zorgt dat alle supernatant wordt opgehaald, maar wordt voorkomen dat er een overdracht van kralen plaatsvindt. Na de behandeling met RNase I meng je gedurende 30 minuten 45 microliter monster met 105 microliter bereide streptavidinkralen en incubeer bij 37 graden Celsius. Tijdens de incubatie, pipette het monster om de 10 minuten te mengen.Scheid vervolgens de kralen op de magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen met buffers A, B en C.Te beginnen met buffer A, resuspend de kralen in 150 microliters van buffer. Scheid op de magnetische standaard gedurende twee tot drie minuten, en verwijder vervolgens de supernatant.Verwarm de buffers B en C tot 37 graden Celsius en herhaal de wasstappen. Om alle niet-afgetopte RNA te verwijderen, is het cruciaal om de streptavidin kralen en buiswanden grondig te wassen en de wasbuffer volledig te verwijderen voordat u de volgende toevoegt. Om de cDNA vrij te geven, resuspend de kralen in 35 microliters van 1X RNase I buffer en incubate bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten.Na incubatie, onmiddellijk plaats de kralen op ijs gedurende twee minuten. Scheid de kralen op een magnetische standaard en breng de supernatant over naar een nieuwe set buizen. Resuspend de kralen in 30 microliter van 1X RNase I buffer en vervolgens scheiden op een magnetische standaard.Combineer de supernatant met de eerder verzamelde supernatant voor een totaal volume van ongeveer 65 microliters. Voer qPCR uit om het aantal PCR-cycli voor doelbibliotheekversterking te bepalen. Bereid de qPCR master mixen voor het versterken van hele bibliotheken van DNA van de drager.Stel thermocycling voorwaarden volgens manuscript richtingen en versterken van de voorbereide monster. Het SLIC-CAGE protocol maakt het mogelijk om sequencing-ready bibliotheken te verkrijgen uit nanogrammen van beginnend RNA materiaal. De fragmentlengte in de uiteindelijke bibliotheek varieert tussen 200 en 2.000 basisparen.Kortere fragmenten zijn PCR-artefacten en kunnen sequencing problemen langs de lijn veroorzaken. Extra rondes van grootte selectie kan worden uitgevoerd om ze te verwijderen. In vergelijking met NanoCAGE, SLIC-CAGE vertoont aanzienlijk betere prestaties bij transcriptie start site identificatie, wat blijkt uit de ontvanger operationele karakteristieke curven van de twee technieken uitgevoerd op verschillende hoeveelheden S.cerevisiae totale RNA.Tijdens het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om in gedachten te houden dat monsterverlies kan leiden tot bibliotheken met een lage complexiteit. Om dit te voorkomen, moeten laag-bindende pipet tips en buizen worden gebruikt. Zonder SLIC-CAGE is promotoranalyse van verschillende celtypen tot nu toe ontoegankelijk geweest.Dit omvat de analyse van embryonale ontwikkelingsstadia of embryonaal weefsel uit een breed scala van modelorganismen.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...