Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van genregulatie, omdat het kernpromotor en versterkerdetectie mogelijk maakt met behulp van lage hoeveelheden uitgangsmateriaal. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onbevooroordeelde, genoom-brede enkele nucleotide resolutie mapping van RNA polymerase II transcriptie start sites met behulp van slechts 10 nanogram van de totale RNA. CAGE blijkt van onschatbare waarde voor het blootleggen van ziekte-geassocieerde transcriptie start sites die kunnen worden gebruikt als diagnostische markers.
SLIC-CAGE breidt deze ontdekkingen uit tot schaalmonsters zoals weefselbiopten. SLIC-CAGE is bij uitstek geschikt voor een diepgaande en hoge resolutie promotoranalyse van kwetsbare celtypen, waaronder vroege embryonale ontwikkelingsstadia of embryonaal weefsel uit een breed scala aan modelorganismen. Aangezien er tal van stappen in dit protocol, is het van cruciaal belang om monsterverlies te minimaliseren in elke stap door ervoor te zorgen om zo veel mogelijk materiaal op te halen bij het overbrengen tussen buizen.
Begin met het voorbereiden van de PCR-mix voor elke sjabloon. Combineer buffer, dPP's, unieke voorwaartse primer, template plasmid met het synthetische dragergen en fusiepolymeren volgens de handschriftaanwijzing. Meng reagentia door pipetting.
Voeg 90 microliter van de PCR-mix toe aan 10 microliter van elke omgekeerde primer en meng. Raadpleeg het manuscript voor thermocycling voorwaarden. Voer omgekeerde transcriptie of RT uit op het RNA van belang.
Combineer een microliter van omgekeerde transcriptie primer, 10 nanogram RNA, en 4, 990 nanogram drager mix in een totaal volume van 10 microliter. Meng door pipetting op en neer. Verwarm het mengsel vijf minuten op 65 graden Celsius en leg het vervolgens meteen op ijs.
Bereid de RT-mix volgens de handschriftaanwijzingen en voeg 28 microliter van de mix toe aan 10 microliter RNA. Meng de inhoud van de buis door pipetteren tot homogeen. Voer RT in een thermocycler.
Zodra de omgekeerde transcriptie is voltooid, zuivert u het product met DNase- en RNase-vrije SPRI magnetische kralen. Voeg de kralen toe aan de RT-mix met een volumeverhouding van 1,8 op één en meng goed door pipetting. Laat het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur zitten.
Plaats vervolgens de kralen op een magnetische standaard en laat ze vijf minuten scheiden. Gooi de supernatant weg en voeg 200 microliter vers bereide 70% ethanol toe aan de kralen. Meng de kralen niet of haal ze niet van de magnetische standaard en verwijder de ethanol onmiddellijk na het toevoegen.
Houd de buis op de magnetische standaard en verwijder alle sporen van ethanol door het duwen van de resterende druppels uit met een P10 pipet. Voeg onmiddellijk 42 microliter water toe en pipet 60 keer op en neer om het monster te elute, waarbij u ervoor zorgt dat er geen schuimvorming wordt veroorzaakt. Broed de buis vijf minuten lang in op 37 graden Celsius zonder deksel en scheid vervolgens de kralen op de magnetische standaard.
Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe set buizen, waarbij u ervoor zorgt dat alle supernatant wordt opgehaald, maar wordt voorkomen dat er een overdracht van kralen plaatsvindt. Na de behandeling met RNase I meng je gedurende 30 minuten 45 microliter monster met 105 microliter bereide streptavidinkralen en incubeer bij 37 graden Celsius. Tijdens de incubatie, pipette het monster om de 10 minuten te mengen.
Scheid vervolgens de kralen op de magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen met buffers A, B en C.Te beginnen met buffer A, resuspend de kralen in 150 microliters van buffer. Scheid op de magnetische standaard gedurende twee tot drie minuten, en verwijder vervolgens de supernatant.
Verwarm de buffers B en C tot 37 graden Celsius en herhaal de wasstappen. Om alle niet-afgetopte RNA te verwijderen, is het cruciaal om de streptavidin kralen en buiswanden grondig te wassen en de wasbuffer volledig te verwijderen voordat u de volgende toevoegt. Om de cDNA vrij te geven, resuspend de kralen in 35 microliters van 1X RNase I buffer en incubate bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Na incubatie, onmiddellijk plaats de kralen op ijs gedurende twee minuten. Scheid de kralen op een magnetische standaard en breng de supernatant over naar een nieuwe set buizen. Resuspend de kralen in 30 microliter van 1X RNase I buffer en vervolgens scheiden op een magnetische standaard.
Combineer de supernatant met de eerder verzamelde supernatant voor een totaal volume van ongeveer 65 microliters. Voer qPCR uit om het aantal PCR-cycli voor doelbibliotheekversterking te bepalen. Bereid de qPCR master mixen voor het versterken van hele bibliotheken van DNA van de drager.
Stel thermocycling voorwaarden volgens manuscript richtingen en versterken van de voorbereide monster. Het SLIC-CAGE protocol maakt het mogelijk om sequencing-ready bibliotheken te verkrijgen uit nanogrammen van beginnend RNA materiaal. De fragmentlengte in de uiteindelijke bibliotheek varieert tussen 200 en 2.000 basisparen.
Kortere fragmenten zijn PCR-artefacten en kunnen sequencing problemen langs de lijn veroorzaken. Extra rondes van grootte selectie kan worden uitgevoerd om ze te verwijderen. In vergelijking met NanoCAGE, SLIC-CAGE vertoont aanzienlijk betere prestaties bij transcriptie start site identificatie, wat blijkt uit de ontvanger operationele karakteristieke curven van de twee technieken uitgevoerd op verschillende hoeveelheden S.cerevisiae totale RNA.
Tijdens het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om in gedachten te houden dat monsterverlies kan leiden tot bibliotheken met een lage complexiteit. Om dit te voorkomen, moeten laag-bindende pipet tips en buizen worden gebruikt. Zonder SLIC-CAGE is promotoranalyse van verschillende celtypen tot nu toe ontoegankelijk geweest.
Dit omvat de analyse van embryonale ontwikkelingsstadia of embryonaal weefsel uit een breed scala van modelorganismen.
