Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Genregulation zu beantworten, da sie die Kernpromotor- und Enhancer-Erkennung mit geringen Mengen an Ausgangsmaterial ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine unvoreingenommene, genomweite Single-Nukleotid-Auflösungskartierung von RNA-Polymerase-II-Transkriptionsstartstellen ermöglicht, die nur 10 Nanogramm der gesamten RNA verwenden. CAGE erweist sich als unschätzbar für die Aufdeckung von krankheitsassoziierten Transkriptionsstartstellen, die als diagnostische Marker verwendet werden können.
SLIC-CAGE erweitert diese Entdeckungen auf skalierende Proben wie Gewebebiopsien. SLIC-CAGE eignet sich ideal für die eingehende und hochauflösende Promotoranalyse von gebrechlichen Zelltypen, einschließlich früher embryonaler Entwicklungsstadien oder embryonalen Gewebes aus einer Vielzahl von Modellorganismen. Da es zahlreiche Schritte in diesem Protokoll gibt, ist es wichtig, den Probenverlust in jedem Schritt zu minimieren, indem man darauf achtet, so viel Material wie möglich beim Übertragen zwischen Rohren abzurufen.
Bereiten Sie zunächst den PCR-Mix für jede Vorlage vor. Kombinieren Sie Puffer, dNTPs, einzigartige Vorwärtsprimer, Template-Plasmid mit dem synthetischen Trägergen und Fusion-Polymerase nach Manuskriptanweisungen. Mischen Sie Reagenzien durch Pipettierung.
Fügen Sie 90 Mikroliter der PCR-Mischung zu 10 Mikrolitern jeder Reverse Primer und Mischen. Siehe Manuskript für Thermocycling-Bedingungen. Führen Sie eine umgekehrte Transkription oder RT auf der RNA von Interesse durch.
Kombinieren Sie einen Mikroliter Reverse-Transkriptionsprimer, 10 Nanogramm RNA und 4, 990 Nanogramm Trägermischung in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Die Mischung fünf Minuten auf 65 Grad Celsius erhitzen und dann sofort auf Eis legen.
Bereiten Sie die RT-Mischung entsprechend den Manuskriptanweisungen vor und fügen Sie 28 Mikroliter der Mischung zu 10 Mikroliter RNA hinzu. Mischen Sie den Inhalt des Rohres durch Pipetten bis homogen. Führen Sie RT in einem Thermocycler aus.
Sobald die umgekehrte Transkription abgeschlossen ist, reinigen Sie das Produkt mit DNase und RNase-freien SPRI-Magnetperlen. Fügen Sie die Perlen in einem Volumenverhältnis von 1,8 zu eins in den RT-Mix ein und mischen Sie sie gut durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten sitzen.
Dann legen Sie die Perlen auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie sie für fünf Minuten trennen. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitetes 70%Ethanol in die Perlen. Mischen Sie die Perlen nicht und nehmen Sie sie nicht aus dem magnetischen Ständer und entfernen Sie das Ethanol sofort nach dem Hinzufügen.
Halten Sie das Rohr auf dem magnetischen Ständer und entfernen Sie alle Spuren von Ethanol, indem Sie alle verbleibenden Tröpfchen mit einer P10 Pipette herausschieben. Fügen Sie sofort 42 Mikroliter Wasser und Pipette auf und ab 60 Mal, um die Probe zu elute, wobei darauf zu achten, dass keine Schaumbildung verursacht. Inkubieren Sie das Rohr bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten ohne Deckel und trennen Sie dann die Perlen auf dem magnetischen Ständer.
Dann übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Satz von Röhren, wobei Sie darauf achten, alle Überstande zu holen, aber Perlenübertragungen zu vermeiden. Nach rNase I Behandlung 45 Mikroliter Probe mit 105 Mikroliter präparierten Streptavidinperlen mischen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Während der Inkubation die Probe alle 10 Minuten zu pipetten, um sie zu mischen.
Trennen Sie dann die Perlen auf dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen mit den Puffern A, B und C.Beginnend mit Puffer A, setzen Sie die Perlen in 150 Mikroliter Puffer wieder auf. Trennen Sie auf dem magnetischen Ständer für zwei bis drei Minuten, und entfernen Sie dann den Überstand.
Puffer B und C auf 37 Grad Celsius vorheizen und die Waschschritte wiederholen. Um alle nicht-capped RNA zu entfernen, ist es wichtig, die Streptavidin Perlen und Rohrwände gründlich zu waschen und den Waschpuffer vollständig zu entfernen, bevor sie die nächste hinzufügen. Um die cDNA freizugeben, setzen Sie die Perlen in 35 Mikrolitern 1X RNase I Puffer wieder auf und brüten bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten.
Nach der Inkubation die Perlen sofort für zwei Minuten auf Eis legen. Trennen Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer und übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Satz von Röhren. Die Perlen in 30 Mikroliter1X RNase I Puffer wieder aufhängen und dann auf einem magnetischen Ständer trennen.
Kombinieren Sie den Überstand mit dem zuvor gesammelten Überstand für ein Gesamtvolumen von etwa 65 Mikrolitern. Führen Sie qPCR aus, um die Anzahl der PCR-Zyklen für die Erweiterung der Zielbibliothek zu bestimmen. Bereiten Sie die qPCR-Mastermischungen für die Verstärkung ganzer DNA-Bibliotheken aus dem Träger vor.
Stellen Sie die Thermocycling-Bedingungen nach Manuskriptanweisungen ein und verstärken Sie die vorbereitete Probe. Das SLIC-CAGE-Protokoll ermöglicht es, Sequenzierungsfähige Bibliotheken aus Nanogrammen von Start-RNA-Material zu erhalten. Die Fragmentlänge in der endgültigen Bibliothek liegt zwischen 200 und 2 000 Basispaaren.
Kürzere Fragmente sind PCR-Artefakte und können sequenziierende Probleme auf der Linie verursachen. Zusätzliche Runden der Größenauswahl können durchgeführt werden, um sie zu entfernen. Im Vergleich zu NanoCAGE weist SLIC-CAGE eine deutlich bessere Leistung bei der Transkriptionsstart-Standortidentifikation auf, was sich an den Funktionskennlinien der beiden Techniken zeigt, die auf verschiedenen Mengen von S.cerevisiae Gesamt-RNA durchgeführt werden.
Bei der Ausführung dieses Protokolls ist es wichtig zu beachten, dass Beispielverlust zu Bibliotheken mit geringer Komplexität führen kann. Um dies zu verhindern, müssen niedrigbindende Pipettenspitzen und Rohre verwendet werden. Ohne SLIC-CAGE ist die Promotoranalyse verschiedener Zelltypen bisher unzugänglich.
Dazu gehört die Analyse von embryonalen Entwicklungsstadien oder embryonalen Geweben aus einer Vielzahl von Modellorganismen.
