Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
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Diese Arbeit wurde durch das Wellcome Trust-Stipendium (106954) unterstützt, das B. L. und Medical Research Council (MRC) Core Funding (MC-A652-5QA10) gewährt wurde. N. C. wurde von EMBO Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 1279-2016) unterstützt; E. P. wurde vom Medical Research Council UK unterstützt; B. L. wurde vom Medical Research Council UK unterstützt (MC UP 1102/1).

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Ein Patent für abbaubare Träger-RNA/DNA wurde abgefüllt.

Für erfolgreiche SLIC-CAGE-Bibliothekspräparate ist es wichtig, niedrigverbindliche Spitzen und Tuben zu verwenden, um Probenverluste durch Probenadsorption zu verhindern. In allen Schritten, die das Abrufen des Überstandes beinhalten, wird empfohlen, das gesamte Sample-Volume wiederherzustellen. Da das Protokoll mehrere Schritte hat, führt kontinuierlicher Beispielverlust zu erfolglosen Bibliotheken.
Wenn CAGE (nAnT-iCAGE) nicht routinemäßig durchgeführt wurde, ist es am besten, SLIC-CAGE mit unterschiedlichen Eingangsmengen (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) der gleichen Gesamt-RNA-Probe zu testen und mit nAnT-iCAGE-Bibliotheken zu vergleichen, die mit 5 g Gesamt-RNA erstellt werden. Wenn die nAnT-iCAGE-Bibliothek nicht erfolgreich ist (weniger als 0,5-1 ng der DNA-Bibliothek pro Probe), ist es unwahrscheinlich, dass SLIC-CAGE funktioniert, und der Probenverlust muss minimiert werden.
Ein entscheidender Schritt, um qualitativ hochwertige Bibliotheken ohne ungekapselte, degradierte RNA oder rRNA zu gewährleisten, ist das in Abschnitt 7 beschriebene Cap-Trapping. Es ist sehr wichtig, dass die Streptavidinperlen gründlich in Waschpuffern resuspendiert werden und dass die Waschpuffer vor dem nächsten Waschschritt oder der Elution von cDNA entfernt werden.
Wenn die Ergebnisse der qPCR nach der ersten Runde der Trägerdegradation keinen Unterschied zwischen der Verwendung von adaptor_f1 und carrier_f1 Primern aufweisen, wird die Fortsetzung des Protokolls weiterhin empfohlen. Wenn nach der zweiten Runde des Trägerabbaus der Unterschied in den Ct-Werten weniger als fünf beträgt, wird eine dritte Runde der Trägerdegradation empfohlen. Wir haben nie eine dritte Abbaurunde für notwendig befunden, und wenn sie eintritt, wird empfohlen, die homing endonuklease-Bestände zu ersetzen.
Zusätzliche Runden der PCR-Verstärkung können dem Protokoll hinzugefügt werden, wenn der endgültige Betrag der erhaltenen Bibliothek nicht für die Sequenzierung ausreicht. Die PCR-Verstärkung kann dann mit einer minimalen Anzahl von Amplifikationszyklen eingestellt werden, die benötigt werden, um genügend Material für die Sequenzierung zu liefern, unter Berücksichtigung von Probenverlusten, die bei der Größenauswahl nicht vermieden werden können. Die Reinigung oder Größenauswahl mit SPRI-Magnetperlen sollte dann durchgeführt werden, bis alle kleinen (<200 bp) Fragmente entfernt werden (falls erforderlich, 0,6:1 Perlen zum Stichprobenverhältnis verwenden), und die Bibliothek sollte mit Picogreen quantifiziert werden.
Bibliotheken können im Single-End- oder Paired-End-Modus sequenziert werden. Mithilfe der paired-end-Sequenzierung können Informationen über Transkription-Isoformen abgerufen werden. Darüber hinaus können Informationen aus dem sequenzierten 3'-Ende als eindeutige molekulare Identifikatoren (UMI) verwendet werden, um PCR-Duplikate zu reduzieren ( TCT-N6, N6 ist ein zufälliger Hexamer). Da eine moderate Anzahl von PCR-Verstärkungszyklen verwendet wird (bis zu 18), wurde die Verwendung von UMIs bisher als unnötig befunden.
Da der Kern des Protokolls auf nAnT-iCAGE11basiert, verwendet SLIC-CAGE acht Barcodes. Daher wird das Multiplexing von mehr als acht Samples derzeit nicht unterstützt. Darüber hinaus eignen sich sowohl SLIC-CAGE als auch nAnT-iCAGE nicht für die Erfassung von RNAs kleiner als 200 bp, da die Protokolle entwickelt wurden, um Linker und PCR-Artefakte durch Größenausschluss mit AMPure XP Perlen zu entfernen.
SLIC-CAGE ist die einzige unvoreingenommene Methode zur Auflösung der Single-Nukleotid-Auflösung mit niedrigem Eindräuen zur Kartierung von Transkriptionsinittierungsstartstellen mit Nanogrammen von rna-Gesamtmaterial. Alternative Methoden basieren auf der Vorlagen-Switching-Aktivität der Reverse-Transkriptase zu Barcode-capped RNA anstelle von Cap-Trapping (z.B. NanoCAGE15 und NanoPARE16). Aufgrund des Template-Switchings weisen diese Methoden sequenzspezifische Verzerrungen bei der TSS-Erkennung auf, was zu einer erhöhten Anzahl falsch positiver TSS und einer verringerten Anzahl echter TSSs9,10führt.

Die Cap-Analyse der Genexpression (CAGE) ist eine Methode zur genomweiten Kartierung von RNA-Polymerase-II-Transkriptionsstartstellen (TSS)1. Seine quantitative Natur ermöglicht auch 5'-Ende zentrische Ausdruck Profiling. Regionen, die die TSS umgeben (ca. 40 bp vor und nachgelagert) sind Kernpromotoren und stellen den physikalischen Ort dar, an dem RNA-Polymerase II und allgemeine Transkriptionsfaktoren binden (zuvor untersucht2,3). Informationen über die genauen Standorte von TSS können für die Kern-Promoter-Entdeckung und für die Überwachung der Projektdynamik verwendet werden. Darüber hinaus können CAGE-Daten, da aktive Enhancer Signaturen der bidirektionalen Transkription aufweisen, auch zur Enhancer-Erkennung und Überwachung der Enhancer-Dynamik 4 verwendet werden. Die CAGE-Methodik hat in letzter Zeit aufgrund ihrer breiten Anwendung und Verwendung in hochkarätigen Forschungsprojekten wie ENCODE5, modENCODE6und FANTOM-Projekten7an Popularität gewonnen. Darüber hinaus erweisen sich TSS-Informationen auch als wichtig für die Unterscheidung von gesundem und krankem Gewebe, da krankheitsspezifische TSS für diagnostische Zwecke verwendet werden können8.
Obwohl mehrere Methoden für TSS-Mapping verfügbar sind (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, Oligo-Capping), haben wir und andere kürzlich gezeigt, dass CAGE die unvoreingenommenste Methode ist, um echte TSS mit der geringsten Anzahl falschpositiver Ergebnisse zu erfassen9 , 10. Das jüngste CAGE-Protokoll, nAnT-iCAGE11, ist das unvoreingenommeneste Protokoll für TSS-Profiling, da es verhindert, dass die Fragmente mit Restriktionsenzymen auf kurze Tags geschnitten werden und keine PCR-Verstärkung verwendet wird. Eine Einschränkung des nAnT-iCAGE-Protokolls ist die Anforderung an eine große Menge an Ausgangsmaterial (z.B. 5 g Gesamt-RNA für jede Probe). Um spezifische, biologisch relevante Fragen zu beantworten, ist es oft unmöglich, so hohe Mengen an Ausgangsmaterial zu erhalten (z.B. für FACS-sortierte Zellen oder frühe embryonale Stadien). Wenn nAnT-iCAGE erfolgreich ist, stehen von jeder Probe nur 1-2 ng DNA-Bibliotheksmaterial zur Verfügung, wodurch die erreichbare Sequenzierungstiefe begrenzt wird.
Um das TSS-Profiling mit nur Nanogramm der gesamten RNA zu ermöglichen, haben wir vor kurzem Super-low Input Carrier-CAGE10 entwickelt (SLIC-CAGE, Abbildung 1). SLIC-CAGE benötigt nur 10 ng der gesamten RNA, um Bibliotheken mit hoher Komplexität zu erhalten. Unser Protokoll stützt sich auf den sorgfältig entworfenen synthetischen RNA-Träger, der der RNA von Interesse hinzugefügt wird, um insgesamt 5 g RNA-Material zu erreichen. Der synthetische Träger imitiert die Ziel-DNA-Bibliothek in der Längenverteilung, um potenzielle Verzerrungen zu vermeiden, die durch homogene Moleküle im Überschuss verursacht werden könnten. Die Sequenz des Trägers basiert aus zwei Gründen auf der Sequenz des Escherichia coli leucyl-tRNA Synthetase-Gens (Tabelle 1). Erstens wird jedes Übrige des Trägers in der endgültigen Bibliothek, selbst wenn es sequenziert wird, nicht zu einem eukaryotischen Genom zugeordnet. Zweitens, da E. coli eine mesophile Spezies ist, sind seine Haushaltsgene für den für SLIC-CAGE geeigneten Temperaturbereich optimiert. Die Trägersequenz ist auch in homing Endonuklease-Erkennungsstellen eingebettet, um einen spezifischen Abbau der DNA zu ermöglichen, die aus den TRÄGER-RNA-Molekülen abgeleitet wurde. Die Zielbibliothek, die von Beispielen abgeleitet wurde, bleibt intakt, da die Homing-Endonuklease-Erkennungsstellen lang sind (I-CeuI = 27 bp; I-SceI = 18 bp) und statistisch unwahrscheinlich, in eukaryotischen Genomen gefunden zu werden. Nach der spezifischen Degradierung des Trägers und dem Entfernen von Fragmenten durch Größenausschluss ist die Zielbibliothek PCR verstärkt und bereit für die Sequenzierung der nächsten Generation. Je nach Start-RNA-Menge (1-100 ng) werden zwischen 13-18 PCR-Verstärkungszyklen erwartet. Die endgültige DNA-Menge pro Probe liegt zwischen 5-50 ng, was genügend Material für eine sehr tiefe Sequenzierung ergibt. Bei Verwendung von nur 1-2 ng der gesamten RNA können echte TSS s detektiert werden; Es wird jedoch erwartet, dass die Bibliotheken von geringerer Komplexität sein werden. Da SLIC-CAGE auf dem nAnT-iCAGE-Protokoll11basiert, ermöglicht es das Multiplexing von bis zu acht Samples vor der Sequenzierung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

Die Cap-Analyse der Genexpression (CAGE) ist eine Methode zum Nachweis der Single-Nukleotid-Auflösung von RNA-Polymerase-II-Transkriptionsstartstellen (TSS). Die genaue Erkennung von TSS verbessert die Identifizierung und Entdeckung von Kernpromotoren. Darüber hinaus können aktive Enhancer durch Signaturen der bidirektionalen Transkriptionsinitiierung erkannt werden. Hier wird ein Protokoll zur Durchführung von Super-Low Input Carrier-CAGE (SLIC-CAGE) beschrieben. Diese SLIC-Anpassung des CAGE-Protokolls minimiert die RNA-Verluste, indem die RNA-Menge durch den Einsatz eines in vitro transkribierten RNA-Trägermixes, der der betreffenden Probe zugesetzt wird, künstlich erhöht wird, wodurch die Bibliotheksvorbereitung aus Nanogramm-Mengen von RNA (d. h. Tausende von Zellen). Der Träger imitiert die erwartete DNA-Bibliotheksfragmentlängenverteilung und eliminiert so Verzerrungen, die durch die Fülle eines homogenen Trägers verursacht werden könnten. In den letzten Phasen des Protokolls wird der Träger durch Degradation mit homing endonucleases entfernt und die Zielbibliothek verstärkt. Die Ziel-Probenbibliothek ist vor Degradation geschützt, da die Homing-Endonuklease-Erkennungsstellen lang sind (zwischen 18 und 27 bp), was die Wahrscheinlichkeit ihrer Existenz in den eukaryotischen Genomen sehr gering macht. Das Endergebnis ist eine DNA-Bibliothek, die für die Sequenzierung der nächsten Generation bereit ist. Alle Schritte im Protokoll bis zur Sequenzierung können innerhalb von 6 Tagen abgeschlossen werden. Die Transportvorbereitung erfordert einen vollen Arbeitstag; Es kann jedoch in großen Mengen zubereitet und bei -80 °C gefroren gehalten werden. Nach der Sequenzkönnen können die Lesevorgänge verarbeitet werden, um genomweite Single-Nukleotid-Auflösungs-TSSs zu erhalten. TSS können für die Kernpromotor- oder Enhancer-Entdeckung verwendet werden, um Einblicke in die Genregulation zu geben. Nach der Aggregation zu Promotoren können die Daten auch für 5'-zentrierte Ausdrucksprofilierung verwendet werden.

Dieser Bericht beschreibt das vollständige SLIC-CAGE-Protokoll zum Abrufen sequenzieller Bibliotheken aus Nanogrammen des beginnenden gesamten RNA-Materials (Abbildung 1). Um den synthetischen RNA-Trägermix zu erhalten, müssen zunächst PCR-Trägervorlagen vorbereitet und gelgereinigt werden, um PCR-Seitige Produkte zu eliminieren (Abbildung 2A). Jede PCR-Vorlage (insgesamt zehn) wird mit einem gemeinsamen Vorwärts-, aber einem anderen Reverse-Primer (Tabelle2) erstellt, was zu unterschiedlichen Längen der PCR-Vorlage führt, um größenvariabilität synthetischer RNA-Träger zu ermöglichen. Nach der Reinigung werden PCR-Vorlagen zur In-vitro-Transkription der Trägermoleküle verwendet. Ein einzelnes RNA-Trägerprodukt wird erwartet, wenn die Schablonen gelgereinigt sind (siehe repräsentative Gelanalyse in Abbildung 2B). Die Vorbereitung des Trägers kann je nach Bedarf und bei Derpräparation, Misch- und Tiefkühlung bei -80 °C für die zukünftige Verwendung hochskaliert werden.
Mit der empfohlenen minimalen Menge an Sample-Gesamt-RNA (10 ng) in Kombination mit 16-18 Zyklen PCR-Amplifikation können hochkomplexe SLIC-CAGE-Bibliotheken erreicht werden. Die Anzahl der PCR-Zyklen, die erforderlich sind, um die endgültige Bibliothek zu verstärken, hängt stark von der Menge der verwendeten gesamten Eingangs-RNA ab (die erwartete Anzahl von Zyklen ist in Tabelle 4dargestellt).
Nach der ersten Abbaurunde beträgt in qPCR-Ergebnissen (Schritt 17) die erwartete Differenz zwischen den Ct-Werten, die mit adaptor_f1 oder carrier_f1 Primer erzielt wurden, 1-2, wobei die Ct-Werte mit adaptor_f1 niedriger als mit carrier_f1 erhalten wurden.
Die Verteilung der Fragmentlängen in der endgültigen Bibliothek liegt zwischen 200-2.000 bp mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 700-900 bp (basierend auf der Regionsanalyse mit Bioanalyzer-Software, Abbildung 4B,D). Kürzere Fragmente, wie in Abbildung 4A,Cdargestellt, müssen durch zusätzliche Größenausschlussrunden entfernt werden (Schritte 20-21). Diese kurzen Fragmente sind PCR-Verstärkungsartefakte und nicht die Zielbibliothek. Beachten Sie, dass kürzere Fragmente besser auf den Sequenzierungsflusszellen gruppiert werden und Sequenzierungsprobleme verursachen können.
Die erwartete Menge an Bibliotheksmaterial pro Probe liegt zwischen 5-50 ng. Deutlich geringere Beträge deuten auf einen Probenverlust während des Protokolls hin. Wenn die erhaltene geringe Menge für die Sequenzierung ausreicht (2-3 ng der gepoolten Bibliotheken werden benötigt), können die Bibliotheken von geringerer Komplexität sein (siehe unten).
Je nach Sequenzierungsmaschine muss die Menge der auf die Durchflusszelle geladenen Bibliothek möglicherweise optimiert werden. Mit einer Illumina HiSeq 2500 ergibt das Laden von 8-12 pM SLIC-CAGE-Bibliotheken durchschnittlich 150-200 Millionen Lesevorgänge, wobei >80% der Lesevorgänge den Qualitätswert Q30 als Schwellenwert übergeben.
Die erhaltenen Lesevorgänge werden dann dem Referenzgenom zugeordnet [für 50 bp liest, Bowtie212 kann mit Standardparametern verwendet werden, die null Nichtübereinstimmungen pro Seed-Sequenz (22 bp)] zulassen. Die erwarteten Mapping-Effizienzen hängen von der gesamten RNA-Eingangsmenge ab und sind in Tabelle 5dargestellt. Die eindeutig abgebildeten Lesevorgänge können dann in die grafische und statistische Computerumgebung13 geladen und mit CAGEr (Bioconductor-Paket14) verarbeitet werden. Die Paketvignette ist einfach zu befolgen und erklärt den Workflow und die Verarbeitung der zugeordneten Daten im Detail. Eine einfache visuelle Kontrolle der Bibliothekskomplexität ist die Verteilung der Promotorbreite, da Bibliotheken mit geringer Komplexität künstlich enge Promotoren haben werden (Abbildung5A, SLIC-CAGE-Bibliothek abgeleitet aus 1 ng gesamtRNA, für Details siehe vorherige Veröffentlichung10). Doch selbst die sLIC-CAGE-Bibliotheken mit geringer Komplexität ermöglichen die Identifizierung echter CTSS, mit einer höheren Genauigkeit als alternative Methoden für TSS-Mapping mit niedrigem und mittlerem Input (Abbildung 5B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> Abbildung 1: Schritte im SLIC-CAGE-Protokoll. Die Proben-RNA wird mit dem RNA-Trägermix gemischt, um insgesamt 5 g RNA-Material zu erreichen. cDNA wird durch Reverse-Transkription synthetisiert und die Kappe wird mit Natriumperiodat oxidiert. Oxidation ermöglicht die Befestigung von Biotin an der Kappe mit Biotinhydrazid. Biotin wird am 3-Zoll-Ende der mRNA befestigt, da es auch mit Natriumperiodat oxidiert wird. Um Biotin aus mRNA:cDNA-Hybriden mit unvollständig synthetisierter cDNA und von den 3-Zoll-Enden der mRNA zu eliminieren, werden die Proben mit RNase I behandelt. cDNA, die das 5-Zoll-Ende der mRNA erreicht hat, wird dann durch Affinitätsreinigung auf Streptavidin-Magnetperlen ausgewählt ( Cap-Trapping). Nach der Freisetzung von cDNA werden 5-Linker und 3-Linker ligiert. Die Bibliotheksmoleküle, die aus dem Träger stammen, werden mit I-SceI und I-CeuI Homing Endonukleasen abgebaut und die Fragmente werden mit SPRI-Magnetperlen entfernt. Die Bibliothek wird dann PCR verstärkt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Gelanalyse von Träger-PCR-Vorlagen und Träger-In-vitro-Transkripten. (A) Carrier PCR-Vorlagen vor der Gelreinigung: Der erste Brunnen enthält den 1 kbp Marker, gefolgt von Carrier PCR-Vorlagen 1, 1-10. (B) Carrier In-vitro-Transkripte: Der erste Brunnen enthält den 1 kbp-Marker, gefolgt von Trägertranskripten 1-10. Die Trägertranskripte wurden vor dem Beladen für 5 min bei 95 °C erhitzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative DNA-Qualität (Hochempfindlichkeits-DNA-Chip) Spur von SLIC-CAGE vor der ersten Runde des Trägerabbaus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative DNA-Qualität (Hochempfindlichkeits-DNA-Chip) Spuren von SLIC-CAGE-Bibliotheken nach PCR-Verstärkung. (A) SLIC-CAGE-Bibliothek, die eine zusätzliche Größenauswahl zum Entfernen kurzer Fragmente erfordert. (B) SLIC-CAGE-Bibliothek nach Größenauswahl mit 0,6x SPRI-Perlen zum Stichprobenverhältnis. (C) SLIC-CAGE-Bibliothek mit geringerer Ausgabemenge, die Größenauswahl für die Entfernung von kurzen Fragmenten erfordert. (D) SLIC-CAGE-Bibliothek mit geringerem Ausgangsbetrag nach Größenauswahl mit 0,6:1 SPRI-Perlen zum Stichprobenverhältnis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Abbildung 5: Validierung von SLIC-CAGE-Bibliotheken. (A) Verteilung der interquantilen Breiten des Tag-Clusters in SLIC-CAGE-Bibliotheken, die aus 1, 5 oder 10 ng der S. cerevisiae-Gesamt-RNA hergestellt werden, und in der nAnT-iCAGE-Bibliothek, die aus 5 g S. cerevisiae gesamter RNA hergestellt wird. Eine hohe Anzahl von schmalen Tag-Clustern in der 1 ng SLIC-CAGE-Bibliothek weist auf ihre geringe Komplexität hin. (B) ROC-Kurven zur CTSS-Identifikation in S. cerevisiae SLIC-CAGE-Bibliotheken. Alle S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs wurden als echtes Set verwendet. (C) ROC-Kurven zur CTSS-Identifikation in S. cerevisiae nanoCAGE-Bibliotheken. Alle S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs wurden als echtes Set verwendet. Der Vergleich von ROC-Kurven zeigt, dass SLIC-CAGE bei der CTSS-Identifikation deutlich übertrifft. Es wurden Daten von ArrayExpress E-MTAB-6519 verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Sequenz des synthetischen Trägergens. I-SceI-Sites sind fett und kursiv in Violett, und I-CeuI-Erkennungsseiten sind grün. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>spediteur</td>
			<td colspan="2">Reverse Primer 5'-3'</td>
			<td>PCR Produktlänge / bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNCGCCGCGCCCCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* Vorwärts-Primer ist für alle Trägervorlagen gleich. Unterstrichen ist die T7-Promoter-Sequenz. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Primer für Trägervorlagenverstärkung. Vorwärts-Primer ist für alle Carrier-Vorlagen gleich. Unterstrichen ist die T7-Promoter-Sequenz. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA. Mit unterschiedlichen Reverse Primern werden PCR-Vorlagen und damit Träger-RNAs unterschiedlicher Länge hergestellt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>spediteur</td>
			<td>länge</td>
			<td>ungekapert/g</td>
			<td>gekappt/g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8,36</td>
			<td>0,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3,08</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2,64</td>
			<td>0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2.2</td>
			<td>0,25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: RNA-Trägermix. Insgesamt 49 g des Trägersmix 0,3-1 kbp: ungekapselt = 44 g, gedeckelt = 5 g.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>RNA-Eingang insgesamt /ng</td>
			<td>PCR-Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Erwartete Anzahl von PCR-Zyklen in Abhängigkeit von der gesamten RNA-Eingabe der Probe. Ungefähre Anzahl der Zyklen basiert auf Experimenten, die mit Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, und Mus musculus total RNA durchgeführt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>RNA-Eingang insgesamt/ng</td>
			<td>% insgesamt kartiert</td>
			<td>% eindeutig kartiert</td>
			<td>% Träger</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 5: Erwartete Mapping-Effizienz und Abhängigkeit von der gesamten RNA-Eingangsmenge. Ungefähre Zahlen werden dargestellt und basieren auf Experimenten, die mit Saccharomyces cerevisiae und Mus musculus total RNA durchgeführt wurden.

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Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Cap Analysis of Gene Expression (CAGE) ist eine Methode zur genomweiten quantitativen Kartierung von mRNA 5'ends zur Erfassung von RNA-Polymerase-II-Transkriptionsstartstellen mit einer einzigen Nukleotid-Auflösung. Diese Arbeit beschreibt ein Low-Input-Protokoll (SLIC-CAGE) zur Erzeugung hochwertiger Bibliotheken mit Nanogramm-Mengen von Gesamt-RNA.

Transkription Start Site Mapping mit Super-low Input Carrier-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Genregulation zu beantworten, da sie die Kernpromotor- und Enhancer-Erkennung mit geringen Mengen an Ausgangsmaterial ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine unvoreingenommene, genomweite Single-Nukleotid-Auflösungskartierung von RNA-Polymerase-II-Transkriptionsstartstellen ermöglicht, die nur 10 Nanogramm der gesamten RNA verwenden. CAGE erweist sich als unschätzbar für die Aufdeckung von krankheitsassoziierten Transkriptionsstartstellen, die als diagnostische Marker verwendet werden können.SLIC-CAGE erweitert diese Entdeckungen auf skalierende Proben wie Gewebebiopsien. SLIC-CAGE eignet sich ideal für die eingehende und hochauflösende Promotoranalyse von gebrechlichen Zelltypen, einschließlich früher embryonaler Entwicklungsstadien oder embryonalen Gewebes aus einer Vielzahl von Modellorganismen. Da es zahlreiche Schritte in diesem Protokoll gibt, ist es wichtig, den Probenverlust in jedem Schritt zu minimieren, indem man darauf achtet, so viel Material wie möglich beim Übertragen zwischen Rohren abzurufen.Bereiten Sie zunächst den PCR-Mix für jede Vorlage vor. Kombinieren Sie Puffer, dNTPs, einzigartige Vorwärtsprimer, Template-Plasmid mit dem synthetischen Trägergen und Fusion-Polymerase nach Manuskriptanweisungen. Mischen Sie Reagenzien durch Pipettierung.Fügen Sie 90 Mikroliter der PCR-Mischung zu 10 Mikrolitern jeder Reverse Primer und Mischen. Siehe Manuskript für Thermocycling-Bedingungen. Führen Sie eine umgekehrte Transkription oder RT auf der RNA von Interesse durch.Kombinieren Sie einen Mikroliter Reverse-Transkriptionsprimer, 10 Nanogramm RNA und 4, 990 Nanogramm Trägermischung in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. Die Mischung fünf Minuten auf 65 Grad Celsius erhitzen und dann sofort auf Eis legen.Bereiten Sie die RT-Mischung entsprechend den Manuskriptanweisungen vor und fügen Sie 28 Mikroliter der Mischung zu 10 Mikroliter RNA hinzu. Mischen Sie den Inhalt des Rohres durch Pipetten bis homogen. Führen Sie RT in einem Thermocycler aus.Sobald die umgekehrte Transkription abgeschlossen ist, reinigen Sie das Produkt mit DNase und RNase-freien SPRI-Magnetperlen. Fügen Sie die Perlen in einem Volumenverhältnis von 1,8 zu eins in den RT-Mix ein und mischen Sie sie gut durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten sitzen.Dann legen Sie die Perlen auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie sie für fünf Minuten trennen. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitetes 70%Ethanol in die Perlen. Mischen Sie die Perlen nicht und nehmen Sie sie nicht aus dem magnetischen Ständer und entfernen Sie das Ethanol sofort nach dem Hinzufügen.Halten Sie das Rohr auf dem magnetischen Ständer und entfernen Sie alle Spuren von Ethanol, indem Sie alle verbleibenden Tröpfchen mit einer P10 Pipette herausschieben. Fügen Sie sofort 42 Mikroliter Wasser und Pipette auf und ab 60 Mal, um die Probe zu elute, wobei darauf zu achten, dass keine Schaumbildung verursacht. Inkubieren Sie das Rohr bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten ohne Deckel und trennen Sie dann die Perlen auf dem magnetischen Ständer.Dann übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Satz von Röhren, wobei Sie darauf achten, alle Überstande zu holen, aber Perlenübertragungen zu vermeiden. Nach rNase I Behandlung 45 Mikroliter Probe mit 105 Mikroliter präparierten Streptavidinperlen mischen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Während der Inkubation die Probe alle 10 Minuten zu pipetten, um sie zu mischen.Trennen Sie dann die Perlen auf dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen mit den Puffern A, B und C.Beginnend mit Puffer A, setzen Sie die Perlen in 150 Mikroliter Puffer wieder auf. Trennen Sie auf dem magnetischen Ständer für zwei bis drei Minuten, und entfernen Sie dann den Überstand.Puffer B und C auf 37 Grad Celsius vorheizen und die Waschschritte wiederholen. Um alle nicht-capped RNA zu entfernen, ist es wichtig, die Streptavidin Perlen und Rohrwände gründlich zu waschen und den Waschpuffer vollständig zu entfernen, bevor sie die nächste hinzufügen. Um die cDNA freizugeben, setzen Sie die Perlen in 35 Mikrolitern 1X RNase I Puffer wieder auf und brüten bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten.Nach der Inkubation die Perlen sofort für zwei Minuten auf Eis legen. Trennen Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer und übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Satz von Röhren. Die Perlen in 30 Mikroliter1X RNase I Puffer wieder aufhängen und dann auf einem magnetischen Ständer trennen.Kombinieren Sie den Überstand mit dem zuvor gesammelten Überstand für ein Gesamtvolumen von etwa 65 Mikrolitern. Führen Sie qPCR aus, um die Anzahl der PCR-Zyklen für die Erweiterung der Zielbibliothek zu bestimmen. Bereiten Sie die qPCR-Mastermischungen für die Verstärkung ganzer DNA-Bibliotheken aus dem Träger vor.Stellen Sie die Thermocycling-Bedingungen nach Manuskriptanweisungen ein und verstärken Sie die vorbereitete Probe. Das SLIC-CAGE-Protokoll ermöglicht es, Sequenzierungsfähige Bibliotheken aus Nanogrammen von Start-RNA-Material zu erhalten. Die Fragmentlänge in der endgültigen Bibliothek liegt zwischen 200 und 2 000 Basispaaren.Kürzere Fragmente sind PCR-Artefakte und können sequenziierende Probleme auf der Linie verursachen. Zusätzliche Runden der Größenauswahl können durchgeführt werden, um sie zu entfernen. Im Vergleich zu NanoCAGE weist SLIC-CAGE eine deutlich bessere Leistung bei der Transkriptionsstart-Standortidentifikation auf, was sich an den Funktionskennlinien der beiden Techniken zeigt, die auf verschiedenen Mengen von S.cerevisiae Gesamt-RNA durchgeführt werden.Bei der Ausführung dieses Protokolls ist es wichtig zu beachten, dass Beispielverlust zu Bibliotheken mit geringer Komplexität führen kann. Um dies zu verhindern, müssen niedrigbindende Pipettenspitzen und Rohre verwendet werden. Ohne SLIC-CAGE ist die Promotoranalyse verschiedener Zelltypen bisher unzugänglich.Dazu gehört die Analyse von embryonalen Entwicklungsstadien oder embryonalen Geweben aus einer Vielzahl von Modellorganismen.

Research

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