Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק אמון ברוכים הA652 (106954) הוענק ל B. L. ומועצת המחקר הרפואי (MRC) מימון ליבה (MC--5QA10). נ. ג. נתמך על ידי האחווה לטווח ארוך EMBO (EMBO ALTF 1279-2016); א. פ. הייתה נתמכת בידי מועצת המחקר הרפואית בריטניה; ב. ל. נתמך על ידי מועצת המחקר הרפואי בריטניה (MC UP 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

פטנט עבור תכלה נושאת RNA/DNA כבר מילא.

עבור ההכנות המוצלח של הספרייה SLIC-קייג ', זה קריטי להשתמש בטיפים וצינורות מחייב נמוך כדי למנוע אובדן לדוגמה בשל adsorption דגימה. בכל השלבים הכרוכים באחזור הסופרנטאנט, מומלץ לשחזר את עוצמת הקול המנטדגימה. מאחר שלפרוטוקול יש שלבים מרובים, אובדן מדגם רציף יוביל לספריות שנכשלו.
אם קייג ' (לינה-iCAGE) לא בוצעה באופן שגרתי, מומלץ לבדוק SLIC-קייג עם כמויות קלט שונות (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) של מדגם ה-RNA הכולל אותו ולהשוות לספריות של ליטליגיל המוכנים באמצעות 5 μg של RNA כולל. אם הספריה של הדגם לא הצליחה (פחות מ-0.5-1 מתוך ספריית ה-DNA המתקבלת לכל מדגם), SLIC-קייג ' אינו סביר לעבודה, והפסד לדוגמה צריך להיות ממוזער.
צעד קריטי כדי להבטיח ספריות באיכות גבוהה נטול RNA או rRNA שאינם מוכתרים, הוא השמנה המתוארת בסעיף 7. חשוב מאוד כי חרוזים streptavidin הם מחדש ביסודיות מאגרי כביסה וכי מאגרי כביסה יוסרו לפני המשך לשלב הבא לשטוף או הימנעות cDNA.
אם התוצאה של ה-qPCR לאחר הסיבוב הראשון של השפלה בנושא אינה מראה הבדל בין השימוש ב-adaptor_f1 ו carrier_f1 התחל, המשך הפרוטוקול עדיין מומלץ. אם לאחר הסיבוב השני של השפלה בנושא, ההפרש בערכי ה-Ct הוא פחות מחמישה, מומלץ לעבור סבב שלישי של השפלה בנושא. מעולם לא מצאנו סיבוב שלישי של השפלה הכרחי, ואם זה קורה, מומלץ להחליף את המניות הביות endonuclease.
ניתן להוסיף סיבובים נוספים של הגברה של ה-PCR לפרוטוקול אם הסכום הסופי של הספריה שהתקבל אינו מספיק לרצף. הגברה של ה-PCR יכולה להיות מוגדרת עם מספר מינימלי של מחזורי הגברה הדרושים כדי להניב מספיק חומר לרצף, לקיחת בחשבון אובדן לדוגמה כי לא ניתן להימנע בחירת גודל. טיהור או בחירת גודל באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI צריך להתבצע עד כל קטן (< 200 bp) שברי מוסרים (אם יש צורך, להשתמש 0.6:1 חרוזים ליחס דגימה), ואת הספרייה צריך להיות כימות באמצעות Picogreen.
ניתן לרצף ספריות במצב חד-ממדי או משויך לקצה. שימוש ברצף מזווג, מידע אודות התמליל ניתן להשיג. בנוסף, כאשר שעתוק הפוכה מבוצעת באמצעות פריימר אקראי (TCT-N6, n6 להיות h, החשבון האקראי), מידע מן הרצף 3 '-end יכול לשמש מזהים מולקולריים ייחודיים (UMI) כדי לכווץ כפילויות PCR. כמספר מתון של מחזורי הגברה של PCR משמש (עד 18), השימוש ב-UMIs נמצא בעבר מיותר להיות מיותרים.
כאשר גרעין הפרוטוקול מסתמך על הסדר-iCAGE11, slic-קייג ' משתמש בשמונה ברקודים. לכן, ריבוב של יותר משמונה דגימות אינו נתמך כעת. בנוסף, שניהם SLIC-כלוב ו-הכללה-iCAGE אינם מתאימים ללכידת RNAs קצר יותר מ 200 bp, כמו הפרוטוקולים נועדו להסיר את הליקרס ואת חפצי ה-PCR באמצעות גודל הדרה עם חרוזי AMPure XP.
SLIC-קייג ' הוא היחיד משוחדת נמוך קלט בודד שיטה ברזולוציה למיפוי שעתוק באתרי התחלה באמצעות ננוגרמות של חומר RNA כולל. שיטות חלופיות להסתמך על פעילות מיתוג התבנית של ההמרה הפוכה כדי ברקוד RNA הכתיר במקום לכידת כובע (למשל, NanoCAGE15 ו NanoPARE16). עקב החלפת תבניות, שיטות אלה מציגים הטיות ספציפיות לרצף ב-tsss זיהוי, המוביל למספר מוגבר של tsss חיובי שווא ומספר מופחת של האמת tsss9,10.

ניתוח כובע של ביטוי גנים (קייג ') היא שיטה המשמשת עבור יחיד-נוקלאוטיד ברזולוציה מיפוי הגנום-רחב של RNA פולימראז II שעתוק אתרי התחלה (TSSs)1. הטבע הכמותי שלה גם מאפשר ביטוי ממוקד של 5-end פרופיל. אזורים המקיפים את tsss (כ 40 bp במעלה ובמורד הזרם) הם היזמים ליבה ולייצג את המיקום הפיזי שבו RNA פולימראז II וגורמים שעתוק כללי לאגד (נבדקו בעבר2,3). מידע על מיקומים מדויקים של TSSs ניתן להשתמש עבור גילוי הליבה מיזם ועבור ניטור הדינמיקה של היזם. בנוסף לכך, כאשר משפרי פעילות מציגה חתימות של שעתוק דו-כיווני, ניתן להשתמש בנתוני כלוב גם לגילוי ולניטור של משפר הדינמיקה4. מתודולוגיה של קייג ' הוגדלה לאחרונה בזכות היישום הרחב שלה ולהשתמש בפרויקטים מחקר בפרופיל גבוה כגון קידוד5, modencode6, ו פנטאום פרויקטים7. בנוסף, מידע TSS מוכיח גם להיות חשוב להבחנה רקמה בריאה וחולה, כמו TSSs ספציפי למחלות ניתן להשתמש למטרות אבחון8.
למרות מספר שיטות עבור מיפוי TSS זמינים (קייג ', השתוללות, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-סגירה), אנחנו ואחרים הראו לאחרונה כי קייג ' היא השיטה משוחדת ביותר כדי ללכוד TSSs אמיתי עם המספר הנמוך ביותר של תוצאות חיוביות שווא9 , 10. הפרוטוקול האחרון כלוב, הסדר-icage11, הוא הפרוטוקול המשוחדת ביותר עבור פרופיל tss, כפי שהוא מונע גזירה של שברי תגים קצרים באמצעות אנזימים הגבלה ואינו משתמש הגברה PCR. מגבלה של פרוטוקול ה-, המהווה את הדרישה לכמות גדולה של חומר התחלתי (למשל, 5 μg של RNA כולל לכל מדגם). כדי לענות על ספציפי, שאלות רלוונטיות ביולוגית, לעתים קרובות אי אפשר לקבל כמויות גבוהות כאלה של חומר התחלתי (למשל, עבור תאים מיון FACS או שלבים עובריים מוקדמים). לבסוף, אם הדגם הינו מוצלח, רק 1-2 ng של חומר הספרייה DNA זמין מכל דגימה, ובכך להגביל את עומק רצף השגה.
כדי לאפשר יצירת פרופיל TSS באמצעות ננוגרמות בסך הכל RNA, פיתחנו לאחרונה מנשא כלוב קלט-נמוך מסוג10 (slic-קייג ', איור 1). SLIC-קייג ' דורש רק 10 ng של RNA סך כדי להשיג ספריות מורכבות גבוהה. הפרוטוקול שלנו מסתמך על מנשא RNA סינתטי מעוצב בקפידה הוסיף RNA של עניין כדי להשיג סך של 5 μg של חומר RNA. הנושא הסינתטי מחקה את ספריית ה-DNA היעד בהפצת האורך כדי למנוע הטיות פוטנציאליות שעלולות להיגרם על ידי מולקולות הומוגניים. רצף המוביל מבוסס על הרצף של ה-Esהאנציכיה הקולי לאוקיצ'ה-trna (שולחן 1) משתי סיבות. ראשית, כל שארית של המוביל בספרייה הסופית, גם אם רצף, לא יהיה למפות לגנום איקריוטית. שנית, כמו E. coli הוא מינים melic, הגנים שלה משק הבית ממוטבים עבור טווח הטמפרטורה המתאימה SLIC-קייג '. רצף הנושא מוטבע גם עם אתרי ביות הכרה endonuclease כדי לאפשר השפלה ספציפית של הדנ א נגזר מולקולות RNA הספק. היעד, הספריה הנגזרת לדוגמה נותרת שלמה, כפי שאתרי הזיהוי הנמצאים באתר הם ארוכים (I-CeuI = 27 bp; I-scei = 18 bp) ו מבחינה סטטיסטית סביר למצוא הגנום איקריוטית. לאחר השפלה ספציפית של המוביל והסרת שברי החרגת מהגודל, ספריית היעד היא ה-PCR מוגבר ומוכנה לרצף הדור הבא. בהתאם לסכום ה-RNA ההתחלתי (1-100 ng), בין 13-18 מחזורי הגברה של ה-PCR צפויים להיות נדרשים. הכמות הסופית של ה-DNA לכל מדגם נע בין 5-50 ng, מניב חומר מספיק עבור רצף עמוק מאוד. כאשר משתמשים רק 1-2 ng בסך הכל RNA, האמת TSSs ניתן לזהות; עם זאת, הספריות צפויות להיות במורכבות נמוכה יותר. לבסוף, כאשר SLIC-קייג ' מבוסס על פרוטוקול ה-לינה-iCAGE11, הוא מאפשר ריבוב של עד שמונה דגימות לפני הרצף.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

ניתוח כובע של ביטוי גנים (קייג ') הוא שיטה המשמשת עבור הזיהוי היחיד נוקלאוטיד ברזולוציה של RNA פולימראז II שעתוק אתרי התחלה (TSSs). זיהוי מדויק של TSSs מגביר זיהוי וגילוי של היזמים הליבה. בנוסף, משפרי פעיל ניתן לזהות באמצעות חתימות של שעתוק התעתיק דו-כיווני. המתואר כאן הוא פרוטוקול לביצוע כלוב המוביל של קלט סופר-נמוך (SLIC-כלוב). זה הסתגלות SLIC של פרוטוקול קייג ' ממזער הפסדים RNA על ידי הגדלת כמות ה-RNA באמצעות שימוש של שילוב מתורבת של RNA הנושא שנוספו למדגם של עניין, ובכך מאפשר הכנה לספרייה מ nanogram כמויות של סך רנ א (כלומר, אלפי תאים). הנושא מחקה את התפלגות החלק הצפוי של ספריית ה-DNA, ובכך מבטל בדיקות שעלולות להיגרם על ידי השפע של המנשא הומוגנית. בשלבים האחרונים של הפרוטוקול, המנשא מוסר באמצעות השפלה עם הטיות באנונותים וספריית היעד מוגברת. הספרייה לדוגמה היעד מוגן מפני השפלה, כמו האתרים האיתור endonuclease ארוך (בין 18 ו 27 bp), מה שהופך את ההסתברות של קיומם של הגנום איקריוטית נמוך מאוד. התוצאה הסופית היא ספריית דנ א מוכנה לרצף הדור הבא. כל השלבים בפרוטוקול, עד לרצף, ניתן להשלים תוך 6 ימים. הכנת המנשא דורשת יום עבודה מלא; עם זאת, ניתן להכין אותו בכמויות גדולות ולשמור קפוא ב-80 ° c. לאחר הרצף, ניתן לעבד את הקריאות כדי להשיג הגנום-כולו ברזולוציה אחת-נוקלאוטיד TSSs. TSSs ניתן להשתמש עבור יזם הליבה או גילוי משפר, מתן תובנה לתוך רגולציה גנים. לאחר הצבירה של היזמים, ניתן להשתמש בנתונים גם עבור פרופיל ביטוי 5 ממוקד.

דו ח זה מתאר את פרוטוקול SLIC-קייג מלא לקבלת ספריות ברצף מוכנות מננוגרמות של הפעלת החומר הכולל RNA (איור 1). כדי להשיג את המיקס הסינתטי של ה-RNA, הראשון, תבניות המנשא של ה-PCR צריכות להיות מוכנות ומטוהרים ג'ל לסילוק מוצרי הצד של ה-PCR (איור 2A). כל תבנית ה-PCR (10 בסך הכל) מופקת באמצעות משותף קדימה, אך היפוך שונה (טבלה 2), המוביל לאורכים שונים של תבנית ה-pcr כדי לאפשר שינויים בגודל של נושאות RNA סינתטיים. לאחר שטוהר, תבניות ה-PCR משמשות לתמלול של מולקולות הספק. מוצר מנשא RNA יחיד צפוי אם התבניות מטוהרים בעזרת ג'ל (ראה מייצג ג'ל-ניתוח באיור 2B). ניתן לערוך את הכנת המנשא בהתאם לצורך, וכאשר הוכנו, מעורבבים ומוקפאים ב-80 ° c לשימוש עתידי.
באמצעות כמות מינימלית מומלצת של מדגם כולל RNA (10 ng) בשילוב עם 16-18 מחזורים של הגברה PCR, מורכבות גבוהה ספריות SLIC-קייג ' ניתן להשיג. מספר מחזורי ה-PCR הנדרשים להגביר את הספרייה הסופית, תלוי בכמות הסכום הכולל של RNA המשמש (מספר המחזורים הצפוי מוצג בטבלה 4).
לאחר סבב ההשפלה הראשון, בתוצאות qPCR (שלב 17), ההבדל הצפוי בין ערכי Ct שהושגו באמצעות adaptor_f1 או carrier_f1 פריימר הוא 1-2, עם ערכי Ct שהושגו עם adaptor_f1 נמוך יותר מאשר עם carrier_f1.
חלוקת אורכי הקטע בספרייה הסופית היא בין 200-2000 bp עם גודל הקטע הממוצע של 700-900 bp (מבוסס על ניתוח האזור באמצעות תוכנת Bioanalyzer, איור 4B, ד). קטעים קצרים יותר, כפי שהוצגו באיור 4a, C, צריכים להיות מוסרים על ידי סיבובים נוספים של החרגת גודל (שלבים 20-21). שברים קצרים אלה הם חפצי הגברה של ה-PCR ולא ספריית היעד. שים לב ששברים קצרים יותר מצרר בתאי הזרימה ברצף ועלולים לגרום לבעיות ברצף.
הכמות הצפויה של חומר הספרייה שהושג לכל מדגם היא בין 5-50 ng. סכומים נמוכים באופן משמעותי מצביעים על אובדן דגימה במהלך הפרוטוקול. אם הכמות הנמוכה המתקבלת מספיקה לרצף (2-3 ng של הספריות הנמצאות במאגר נדרשת), הספריות עשויות להיות במורכבות נמוכה יותר (ראה להלן).
בהתאם למכונת הרצף, ייתכן שכמות הספריה הנטענת אל תא הזרימה תצטרך להיות ממוטבת. באמצעות הארה HiSeq 2500, טעינת 8-12 pM SLIC-כלוב ספריות מעניקה בממוצע 150-200 מיליון קריאות, עם > 80% של קריאות העברת איכות ציון Q30 כמו הסף.
הקריאות שהתקבלו ממופות מכן לגנום התייחסות [עבור 50 bp קריאות, Bowtie212 ניתן להשתמש עם פרמטרי ברירת מחדל המאפשרים אפס אי התאמות לכל זרע רצף (22 bp)]. יעילות מיפוי צפויה תלויה בסכום הכולל של כניסת RNA ומוצגות בטבלה 5. לאחר מכן, ניתן לטעון את הקריאות שמופו באופן ייחודי לסביבת מיחשוב ממוחשבת וסטטיסטית של13 ומעובדת באמצעות מעבד מערכת (ביומנצח). לרוב החבילה קל לעקוב ומסבירה את זרימת העבודה והעיבוד של הנתונים הממופים בפרוטרוט. שליטה ויזואלית קלה של מורכבות הספרייה היא התפלגות רוחב המקדם, כמו ספריות במורכבות נמוכה יהיו באופן מלאכותי היזמים צרים (איור 5A, הספרייה slic-קייג נגזר 1 NG של RNA הכולל, עבור פרטים ראה קודם פרסום10). עם זאת, אפילו הספריות הנמוכות מורכבות מסוג SLIC-קייג ' מאפשרות זיהוי של CTSSs אמיתי, עם דיוק גדול יותר מאשר שיטות חלופיות למיפוי TSS נמוך/בינוני (איור 5B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> איור 1: צעדים בפרוטוקול SLIC-קייג '. לדוגמה RNA מעורבב עם המנשא RNA לערבב כדי להשיג 5 μg של חומר RNA כולל. cDNA הוא הסנתז באמצעות תמלול הפוכה הכובע הוא תחמוצת באמצעות קרום הדרך הנתרן. חמצון מאפשר חיבור של ביוטין לכובע באמצעות ביוטין הידרזידה. Biotin מקבל מחובר ל-mRNA של 3 ′ סוף, כפי שהוא גם תחמוצת באמצעות קרום הזמן של נתרן. כדי למנוע ביוטין מ-mrna: cdna ההיברידים עם מסונתז לחלוטין cdna ו מ 3 ′ קצוות של mrna, הדגימות מטופלות עם rnase I. cdna שהגיעו 5 ′ סוף mrna הוא נבחר על ידי טיהור אהדה על חרוזים streptavidin מגנטיים ( לכידת כובע). לאחר שחרורו של cDNA, 5 ′ ו 3 ′ לינקרס הם ליגבים. מולקולות הספרייה שמקורן המוביל הם מושפל באמצעות I-SceI ו-I-CeuI ביות מונודיטיות והשברים מוסרים באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הספרייה היא אז הוגדל ה-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> איור 2: מיצג ג'ל-ניתוח של תבניות ה-PCR ומוביל בתעתיקים. (א) הספק המוביל תבניות לפני ג'ל טיהור: הבאר הראשונה מכילה את סמן ה-kbp, ולאחר מכן על ידי תבניות ה-pcr של הספק 1, 1-10. (ב) המוביל בתעתיקים מחוץ למבחנה: הבאר הראשונה מכילה את הסמן 1 kbp, ואחריו תעתיקים המוביל 1-10. התעתיקים של המנשא הינם מחוממים במשך 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס לפני הטעינה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> איור 3: באיכות ה-Dna נציג (הרגישות גבוהה שבב dna) עקבות של SLIC-כלוב לפני סיבוב ראשון של השפלה המוביל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> איור 4: איכות ה-dna מייצגת (הרגישות גבוהה שבב dna) עקבות של ספריות SLIC-קייג לאחר הגברה PCR. (א) ספריית "סליג-קייג '" הדורשת בחירת גודל נוספת להסרת קטעים קצרים. (ב) הספרייה SLIC-קייג ' לאחר בחירת גודל באמצעות 0.6 x spri חרוזים ליחס המדגם. (ג) ספריית slic-קייג ' של סכום הפלט התחתון המחייב בחירת גודל להסרת שבר קצר. (ד) הספרייה SLIC-קייג ' של כמות תפוקה נמוכה לאחר בחירת גודל באמצעות 0.6:1 חרוזי spri ליחס המדגם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> איור 5: אימות של ספריות SLIC-קייג '. (א) התפלגות מצרר באשכול התגים בספריות SLIC-קייג ' המוכנות מ 1, 5, או 10 ng של ה-rna הכולל של s. cerevisiae ס , ובספריית הסדר-icage המוכן 5 Μg של ה- rna סה כ. כמות גבוהה של אשכולות תגים צרים בספריית SLIC-קייג 1 מציינת את המורכבות הנמוכה שלה. (ב) רוק עקומות לזיהוי CTSS ב- S. cerevisiae ס ספריות כלוב. כל שנות ה-S. שימשו כקבוצה אמיתית (ג) רוק עקומות עבור זיהוי CTSS ב -S. cerevisiae ס ספריות nanocage. כל שנות ה-S. שימשו כקבוצה אמיתית השוואה של עקומות ROC מראה כי SLIC-כלוב בחוזקה מבצעת nanoCAGE בזיהוי CTSS. נתונים מ-ArrayExpress E-MTAB-6519 שימשו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: רצף של הגן הסינתטי המוביל. אתרי i-SceI הם מודגשים ונטויים בסגול, ואתרי האינטרנט של I-CeuI הם ירוקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>נושא</td>
			<td colspan="2">פריימר הפוכה 5 ' -3 '</td>
			<td>אורך המוצר-PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל 5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* פריימר לפנים זהה עבור כל תבניות הספק. מסומן בקו תחתון הוא רצף המקדם T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: צבעי יסוד להגברה של תבנית הספק. הצבע הקדמי הוא זהה עבור כל תבניות הספק. מסומן בקו תחתון הוא רצף המקדם T7. PCR_GN5_f1: TaאטקgלGNNNNNCAGCGTTCGCTA באמצעות תחל שונות הפוכה, תבניות PCR ולכן RNAs המוביל של אורך שונות מיוצרים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>נושא</td>
			<td>אורך</td>
			<td>לא מוכתרים/μg</td>
			<td>כדור משחק</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8.36</td>
			<td>0.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל 5</td>
			<td>744</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3.08</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2.64</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2.2</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 3: שילוב מנשא RNA. בסך הכל 49 μg של שילוב נשא 0.3-1 kbp: uncapped כתיר = 44 μg, הכתיר = 5 μg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>סה כ קלט RNA/ng</td>
			<td>מחזורי PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל בן-שינג</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל השני</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל ב, 5</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 מטרים</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>בת 25</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 4: המספר הצפוי של מחזורי ה-PCR בתלות של קלט RNA כולל לדוגמה. המספר המשוער של מחזורים מבוסס על ניסויים שבוצעו באמצעות סכולוסים cerevisiae ס, דרוסופילה מלאנוסטר, ו-RNA מוסקולוס סה כ. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>סה כ קלט RNA/ng</td>
			<td>% כולל ממופה</td>
			<td>% ממופה באופן ייחודי</td>
			<td>% מוביל</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל בן-שינג</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל השני</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל ב, 5</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 מטרים</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>בת 25</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: יעילות מיפוי צפוי ובתלות של סכום כולל של קלט RNA. מספרים משוערים מוצגים ומבוססים על ניסויים שבוצעו באמצעות סכביסים cerevisiae ס ו Mus מוסקולוס סך RNA.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

כובע ניתוח של ג'ין ביטוי (קייג ') היא שיטה למיפוי כמותי רחב הגנום של mRNA 5 ' הקצוות ללכוד RNA פולימראז II שעתוק אתרי התחלה ברזולוציה יחיד-נוקלאוטיד. עבודה זו מתארת פרוטוקול קלט-נמוך (SLIC-קייג) עבור יצירה של ספריות באיכות גבוהה באמצעות ננוגרם-כמויות של RNA כולל.

שעתוק מיפוי אתר התחל באמצעות כלוב קלט-נמוך-Super-נמוכה

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום ויסות הגנים, מכיוון מאפשרת יחצ"ן ליבה וגילוי משפר באמצעות כמויות נמוכות של חומר התחלתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיפוי רזולוציית נוקלאוטיד יחיד נוקלאוטיד בלתי משוחדת, כלל-גנומית, של אתרי התחלה שעתוק RNA polymerase II באמצעות רק 10 ננוגרם של RNA הכולל. CAGE הוא להוכיח להיות לא יסולא בפז לחשיפת אתרי התחלת שעתוק הקשורים למחלות שיכולים לשמש סמני אבחון.SLIC-CAGE מרחיב תגליות אלה כדי להגדיל דגימות כגון ביופסיות רקמות. SLIC-CAGE מתאים באופן אידיאלי לניתוח מקדם מעמיק וברזולוציה גבוהה של סוגי תאים שבריריים, כולל שלבים התפתחותיים עובריים מוקדמים או רקמה עוברית ממגוון רחב של אורגניזמים מודל. מאז ישנם צעדים רבים בפרוטוקול זה, חשוב למזער את אובדן המדגם בכל שלב על ידי טיפול כדי לאחזר חומר רב ככל האפשר בעת העברה בין צינורות.התחל בהכנת תמהיל PCR עבור כל תבנית. שלב חיץ, dNTPs, פריימר קדמי ייחודי, פלסמיד תבנית עם גן המוביל הסינתטי ופולימראז היתוך בהתאם לכיווני כתב היד. מערבבים רייגנטים על ידי צינורות.הוסיפו 90 מיקרוליטרים של תערובת ה-PCR ל-10 מיקרוליטרים של כל פריימר הפוך וערבבו. עיין בכתב היד לתנאי התרמוצ'יקלינג. בצע שעתוק הפוך או RT על RNA של עניין.שלב מיקרוליטר אחד של פריימר שעתוק הפוך, 10 ננוגרם של RNA, ו 4, 990 ננוגרם של תערובת נושא בנפח כולל של 10 microliters. מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. מחממים את התערובת ל-65 מעלות במשך חמש דקות ומיד מניחים אותה על קרח.מכינים את תערובת RT בהתאם לכיווני כתב היד ומוסיפים 28 מיקרוליטרים של התערובת ל-10 מיקרוליטרים של רנ"א. מערבבים את תכולת הצינור על ידי צינורות עד הומוגני. הפעל RT בתרמוציקלר.לאחר השלמת שעתוק הפוך, לטהר את המוצר עם DNase ו RNase ללא SPRI חרוזים מגנטיים. מוסיפים את חרוזים לתערובת RT ביחס נפח של 1.8 לאחד ומערבבים היטב על ידי צינור. תן לתערובת לשבת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר מכן, מניחים את חרוזים על מעמד מגנטי ולתת להם להפריד במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והוסיפו 200 מיקרוליטרים של אתנול טרי 70% לחרוזים. אין לערבב את חרוזים או להוריד אותם מהעמוד המגנטי ולהסיר את האתנול מיד לאחר ההוספה.שמור את הצינור על מעמד מגנטי ולהסיר את כל העקבות של אתנול על ידי דחיפת כל טיפות שנותרו החוצה עם פיפטה P10. מיד להוסיף 42 microliters של מים, פיפטה למעלה ולמטה 60 פעמים כדי לחמק מדגם, דואג לא לגרום קצף. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ללא המכסה ולאחר מכן להפריד את חרוזים על הדוכן המגנטי.לאחר מכן, להעביר את supernatant לקבוצה חדשה של צינורות, דואג לאחזר את כל על טבעי אבל למנוע נשיאת חרוזים. לאחר הטיפול RNase I, מערבבים 45 מיקרוליטרים של מדגם עם 105 מיקרוליטרים של חרוזים סטרפטבידין מוכנים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, פיפטה המדגם כל 10 דקות לערבב.לאחר מכן, להפריד את חרוזים על מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף את חרוזים עם חוצצים A, B, ו C.החל חיץ A, resuspend את חרוזים ב 150 microliters של חיץ. נפרדים על מעמד מגנטי במשך שתיים עד שלוש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.מחממים מאגרים B ו- C ל-37 מעלות צלזיוס וחוזרים על שלבי הכביסה. כדי להסיר את כל RNA שאינו כתרים, חשוב לשטוף את חרוזי סטרפטבידין וקירות הצינור ביסודיות כדי להסיר לחלוטין את מאגר לשטוף לפני הוספת הבא. כדי לשחרר את cDNA, להשתמש מחדש את חרוזים 35 microliters של חיץ RNase I 1X ודגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר הדגירה, מיד מניחים את חרוזים על קרח במשך שתי דקות. מפרידים את חרוזים על מעמד מגנטי ומעבירים את העל-טבעי לסט חדש של צינורות. תן שימוש חוזר בחרוזים ב-30 מיקרוליטרים של חיץ RNase I 1X ולאחר מכן הפרד על מעמד מגנטי.שלבו את העל-טבעי עם העל-טבעי שנאסף בעבר לקבלת נפח כולל של כ-65 מיקרוליטרים. בצע qPCR כדי לקבוע את מספר מחזורי PCR עבור הגברה בספריית היעד. הכינו את התערובות הראשיות של qPCR להגברת ספריות שלמות של דנ"א מהנשא.קבעו את תנאי התרמוצ'יקלינג בהתאם לכיווני כתב היד והעצמו את הדגימה המוכנה. פרוטוקול SLIC-CAGE מאפשר להשיג ספריות מוכנות ל רצף מננוגרם של חומר RNA התחלתי. אורך הקטע בספרייה הסופית נע בין 200 ל-2,000 זוגות בסיסים.קטעים קצרים יותר הם ממצאים של PCR והם עלולים לגרום לבעיות רצף לאורך הקו. ניתן לבצע סבבים נוספים של בחירת גודל כדי להסיר אותם. בהשוואה NanoCAGE, SLIC-CAGE מציג ביצועים טובים יותר באופן משמעותי בזיהוי אתר התחלת שעתוק, אשר ניכר מן המקלט פועל עקומות אופייניות של שתי טכניקות שבוצעו על כמויות שונות של S.cerevisiae הכולל RNA.בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי אובדן מדגם עלול להוביל לספריות בעלות מורכבות נמוכה. כדי למנוע זאת, יש להשתמש בטיפים ובצינורות של פיפטה עם כריכה נמוכה. ללא SLIC-CAGE, ניתוח מקדם של סוגי תאים שונים היה עד כה בלתי נגיש.זה כולל ניתוח של שלבים התפתחותיים עובריים או רקמה עוברית ממגוון רחב של אורגניזמים מודל.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...