यह विधि जीन विनियमन के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, क्योंकि यह प्रारंभिक सामग्री की कम मात्रा का उपयोग करके कोर प्रमोटर और वर्धक खोज को सक्षम बनाता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह कुल आरएनए के केवल 10 नैनोग्राम का उपयोग करके आरएनए पॉलीमरेज II ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइटों के निष्पक्ष, जीनोम-वाइड सिंगल न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन मैपिंग की अनुमति देता है। पिंजरे रोग से जुड़े प्रतिलेखन शुरू साइटों है कि नैदानिक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अनकवरिंग के लिए अमूल्य साबित हो रहा है ।
SLIC-CAGE इस तरह के ऊतक बायोप्सी के रूप में नमूनों पैमाने पर इन खोजों का विस्तार । SLIC-CAGE आदर्श रूप से कमजोर कोशिका प्रकारों के गहन और उच्च संकल्प प्रमोटर विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, जिसमें प्रारंभिक भ्रूणीय विकासात्मक चरण या मॉडल जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला से भ्रूणीय ऊतक शामिल हैं। चूंकि इस प्रोटोकॉल में कई कदम हैं, इसलिए ट्यूबों के बीच स्थानांतरित करते समय जितना संभव हो उतना सामग्री पुनः प्राप्त करने का ध्यान रखकर प्रत्येक चरण में नमूना हानि को कम करना महत्वपूर्ण है।
प्रत्येक टेम्पलेट के लिए पीसीआर मिश्रण तैयार करके शुरू करें। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार बफर, डीएनटीपी, अद्वितीय फॉरवर्ड प्राइमर, सिंथेटिक वाहक जीन के साथ टेम्पलेट प्लाज्मिड और फ्यूजन पॉलीमरेज को मिलाएं। पाइपिंग करके रिएजेंट्स मिलाएं।
पीसीआर मिक्स के 90 माइक्रोलीटर प्रत्येक रिवर्स प्राइमर के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिक्स करें। थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों के लिए पांडुलिपि को देखें। ब्याज की आरएनए पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन या आरटी करें।
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के एक माइक्रोलीटर, आरएनए के 10 नैनोग्राम और 10 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में 4, 990 नैनोग्राम कैरियर मिक्स मिलाएं। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। इस मिश्रण को पांच मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और फिर तुरंत इसे बर्फ पर रखें।
पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार आरटी मिश्रण तैयार करें और आरएनए के 10 माइक्रोलीटर में मिश्रण के 28 माइक्रोलीटर जोड़ें। समरूप होने तक पाइपिंग करके ट्यूब की सामग्री मिलाएं। एक थर्मोसाइकिलर में आरटी चलाएं।
एक बार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पूरा हो जाने के बाद, उत्पाद को DNase और RNase-मुक्त स्प्री चुंबकीय मोतियों के साथ शुद्ध करें। एक से 1.8 के वॉल्यूम अनुपात में आरटी मिश्रण में मोतियों को जोड़ें और पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण को पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।
इसके बाद मोतियों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें और उन्हें पांच मिनट के लिए अलग कर दें। सुपरनेट को त्यागें और मोतियों में ताजा तैयार 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। मोतियों को न मिलाएं या चुंबकीय स्टैंड से न लें और जोड़ने के तुरंत बाद इथेनॉल निकाल दें।
चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें और किसी भी शेष बूंदों को P10 पिपेट के साथ धक्का देकर इथेनॉल के सभी निशान हटा दें। तत्काल पानी के 42 माइक्रोलीटर जोड़ें, और नमूना को एल्यूट करने के लिए 60 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें, जिससे झाग नहीं होता है। बिना ढक्कन के पांच मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें और फिर मोतियों को चुंबकीय स्टैंड पर अलग करें।
फिर, सभी सुपरनैंट को पुनः प्राप्त करने के लिए ध्यान रखते हुए, ट्यूबों के एक नए सेट में सुपरनैंट स्थानांतरित करें, लेकिन मनका कैरीओवर से बचें। RNase I उपचार के बाद, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तैयार स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के 105 माइक्रोलीटर के साथ नमूना के 45 माइक्रोलीटर मिलाएं। इनक्यूबेशन के दौरान, मिश्रण करने के लिए हर 10 मिनट में नमूना पिपेट करें।
इसके बाद मैग्नेटिक स्टैंड पर मोतियों को अलग कर के सुपरनिट को हटा दें। बफर ए, बी और सी के साथ मोतियों को धोएं बफर ए के साथ शुरू करें, बफर के 150 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से रखें। दो से तीन मिनट के लिए मैग्नेटिक स्टैंड पर अलग करें और फिर सुपरनेट निकाल दें।
बफ़र्स बी और सी को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें और वॉश स्टेप्स दोहराएं। सभी गैर-छाया आरएनए को हटाने के लिए, स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों और ट्यूब दीवारों को अच्छी तरह से धोना और अगले एक को जोड़ने से पहले वॉश बफर को पूरी तरह से हटाना महत्वपूर्ण है। सीडीएनए जारी करने के लिए, 1X RNase I बफर के 35 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें और पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद तुरंत मोतियों को दो मिनट के लिए बर्फ पर रखें। एक चुंबकीय स्टैंड पर मोती को अलग करें और सुपरनैंट को ट्यूबों के एक नए सेट में स्थानांतरित करें। 1X RNase I बफर के 30 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें और फिर एक चुंबकीय स्टैंड पर अलग करें।
लगभग 65 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा के लिए पहले से एकत्र सुपरनिटेंट के साथ सुपरनैंट मिलाएं। लक्ष्य पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए पीसीआर चक्रों की संख्या निर्धारित करने के लिए क्यूपीसीआर करें। वाहक से डीएनए के पूरे पुस्तकालयों को बढ़ाना के लिए क्यूपीसीआर मास्टर घोला जा सकता है तैयार करें।
पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों को सेट करें और तैयार नमूने को बढ़ाना। एसलिच-केज प्रोटोकॉल आरएनए सामग्री शुरू करने के नैनोग्राम से अनुक्रमण-तैयार पुस्तकालयों को प्राप्त करना संभव बनाता है। अंतिम पुस्तकालय में खंड लंबाई 200 और 2, 000 आधार जोड़े के बीच है।
छोटे टुकड़े पीसीआर कलाकृतियों हैं और लाइन के नीचे अनुक्रमण समस्याओं का कारण बन सकता है । उन्हें हटाने के लिए आकार चयन के अतिरिक्त दौर किए जा सकते हैं। नैनोकेज की तुलना में, एलआईसी-केज ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट पहचान में काफी बेहतर प्रदर्शन प्रदर्शित करता है, जो एस सेरेविसियाई कुल आरएनए की विभिन्न मात्राओं पर किए गए दो तकनीकों के रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता घटता से स्पष्ट है।
इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि नमूना हानि कम जटिलता पुस्तकालयों का कारण बन सकती है। इसे रोकने के लिए, कम बाध्यकारी पिपेट टिप्स और ट्यूब का उपयोग किया जाना चाहिए। एस एलआईसी-केज के बिना, विभिन्न सेल प्रकारों का प्रमोटर विश्लेषण अब तक दुर्गम रहा है।
इसमें मॉडल जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला से भ्रूणीय विकास चरणों या भ्रूणीय ऊतक का विश्लेषण शामिल है।
