Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione Wellcome Trust (106954) assegnata a B. L. e Medical Research Council (MRC) Core Funding (MC-A652-5QA10). N. C. è stato supportato dalla EMBO Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. è stato sostenuto dal Medical Research Council UK; B. L. è stato sostenuto dal Medical Research Council UK (MC UP 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

È stato riempito un brevetto per l'RNA/DNA portatore degradabile.

Per una corretta preparazione della libreria SLIC-CAGE, è fondamentale utilizzare suggerimenti e tubi a bassa legatura per evitare la perdita del campione a causa dell'adsorbimento del campione. In tutte le fasi che comportail recupero del super-natante, si raccomanda di recuperare l'intero volume del campione. Poiché il protocollo prevede più passaggi, la perdita continua del campione porterà a librerie non riuscite.
Se CAGE (nAnT-iCAGE) non è stato eseguito regolarmente, è meglio testare SLIC-CAGE con quantità di ingresso diverse (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) dello stesso campione totale di RNA e confrontarlo con le librerie nAnT-iCAGE preparate utilizzando 5 g di RNA totale. Se la libreria nAnT-iCAGE non riesce (meno di 0,5-1 ng della libreria di DNA ottenuta per campione), è improbabile che SLIC-CAGE funzioni e che la perdita del campione sia ridotta al minimo.
Un passo fondamentale per garantire che le librerie di alta qualità prive di RNA o rRNA degradato non consorcoperto sia l'intrappolamento del tappo descritto nella sezione 7. È molto importante che le perline di streptavidina siano completamente risospese nei tamponi di lavaggio e che i tamponi di lavaggio vengano rimossi prima di continuare alla fase di lavaggio successiva o alla elusione del cDNA.
Se i risultati del qPCR dopo il primo ciclo di degradazione del vettore non mostrano alcuna differenza tra l'uso di primer adaptor_f1 e carrier_f1, è comunque consigliabile continuare il protocollo. Se dopo il secondo ciclo di degradazione del vettore, la differenza nei valori Ct è inferiore a cinque, si consiglia un terzo ciclo di degradazione del vettore. Non abbiamo mai trovato necessario un terzo ciclo di degradazione e, se si verifica, si raccomanda di sostituire gli stock di endonucleasi homing.
Ulteriori cicli di amplificazione PCR possono essere aggiunti al protocollo se la quantità finale della libreria ottenuta non è sufficiente per la sequenza. L'amplificazione PCR può quindi essere impostata con un numero minimo di cicli di amplificazione necessari per produrre materiale sufficiente per il sequenziamento, tenendo conto della perdita del campione che non può essere evitata nella selezione delle dimensioni. La purificazione o la selezione delle dimensioni mediante perline magnetiche SPRI devono quindi essere eseguite fino a quando tutti i piccoli frammenti (<200 bp) non vengono rimossi (se necessario, utilizzano 0.6:1 perline per il rapporto campione) e la libreria deve essere quantificata utilizzando Picogreen.
Le librerie possono essere sequenziate in modalità a estremità singola o accoppiata. Utilizzando il sequenziamento a fine accoppiato, è possibile ottenere informazioni sugli isoformi di trascrizione. Inoltre, poiché la trascrizione inversa viene eseguita utilizzando un primer casuale (TCT-N6, N6 essendo un esagono casuale), le informazioni dalla sequenza 3'-end possono essere utilizzate come identificatori molecolari univoci (UMI) per comprimere i duplicati PCR. Poiché viene utilizzato un numero moderato di cicli di amplificazione PCR (fino a 18), l'uso di UMI è stato precedentemente ritenuto non necessario.
Poiché il nucleo del protocollo si basa su nAnT-iCAGE11, SLIC-CAGE utilizza otto codici a barre. Pertanto, il multiplexing più di otto campioni non è attualmente supportato. Inoltre, sia SLIC-CAGE che nAnT-iCAGE non sono adatti per l'acquisizione di RNA più brevi di 200 bp, in quanto i protocolli sono progettati per rimuovere linker e artefatti PCR tramite l'esclusione delle dimensioni con perline AMPure XP.
SLIC-CAGE è l'unico metodo imparziale di risoluzione a basso nucleotide a basso input per la mappatura dei siti di avvio della trascrizione utilizzando nanogrammi di materiale RNA totale. I metodi alternativi si basano sull'attività di commutazione del modello della trascrizione inversa all'RNA con tappo a barre anziché all'abbondanza di tappo (ad esempio, NanoCAGE15 e NanoPARE16). A causa della commutazione del modello, questi metodi presentano distorsioni specifiche della sequenza nel rilevamento dei Contenuti, portando ad un aumento del numero di TSS falsi positivi e alla diminuzione del numero di TSSreali 9,10.

L'analisi del cap dell'espressione genica (CAGE) è un metodo utilizzato per la mappatura a livello di genoma a risoluzione mononucleotide dei siti di inizio della trascrizione della polimerasi II (TSS)1. La sua natura quantitativa consente anche una profilazione dell'espressione cintesa da 5'-end. Le regioni che circondano i TSS (circa 40 bp a monte e a valle) sono promotori fondamentali e rappresentano la posizione fisica in cui l'RNA polimerasi II e i fattori di trascrizione generali si legano (rivisti in precedenza2,3). Le informazioni sulle posizioni esatte dei TSS possono essere utilizzate per la scoperta del promotore del core e per il monitoraggio delle dinamiche promotori. Inoltre, poiché gli stimolatori attivi esibiscono firme di trascrizione bidirezionale, i dati CAGE possono essere utilizzati anche per la scoperta e il monitoraggio dell'esaltatore delle dinamiche potenziatori4. La metodologia CAGE è recentemente aumentata in popolarità grazie alla sua ampia applicazione e utilizzo in progetti di ricerca di alto profilo come ENCODE5, modENCODE6e FANTOM progetti7. Inoltre, le informazioni tSS si stanno rivelando importanti per distinguere i tessuti sani e malati, in quanto gli TSS specifici della malattia possono essere utilizzati per scopi diagnostici8.
Anche se sono disponibili diversi metodi per la mappatura TSS (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), noi e altri abbiamo recentemente dimostrato che CAGE è il metodo più imparziale per catturare i Veri TSS con il minor numero di falsi positivi9 , 10.Il recente protocollo CAGE, nAnT-iCAGE11, è il protocollo più imparziale per la profilazione TSS, in quanto evita di tagliare i frammenti a tag brevi utilizzando enzimi di restrizione e non utilizza l'amplificazione PCR. Una limitazione del protocollo nAnT-iCAGE è la necessità di una grande quantità di materiale di partenza (ad es., 5 g di RNA totale per ogni campione). Per rispondere a domande specifiche e biologicamente rilevanti, è spesso impossibile ottenere tali elevate quantità di materiale di partenza (ad esempio, per le cellule in ordine FACS o per le fasi embrionali precoci). Infine, se nAnT-iCAGE ha successo, solo 1-2 ng di materiale della libreria del DNA è disponibile da ogni campione, limitando così la profondità di sequenziamento raggiungibile.
Per consentire la profilazione TSS utilizzando solo nanogrammi di RNA totale, abbiamo recentemente sviluppato Super-low Input Carrier-CAGE10 (SLIC-CAGE, Figura 1). SLIC-CAGE richiede solo 10 ng di RNA totale per ottenere librerie ad alta complessità. Il nostro protocollo si basa sul vettore di RNA sintetico attentamente progettato aggiunto all'RNA di interesse per ottenere un totale di 5 g di materiale di RNA. Il vettore sintetico imita la libreria del DNA bersaglio nella distribuzione della lunghezza per evitare potenziali pregiudizi che potrebbero essere causati da molecole omogenee in eccesso. La sequenza del portatore si basa sulla sequenza del gene sintetasi Escherichia coli leucyl-tRNA per due motivi. In primo luogo, qualsiasi resista del vettore nella biblioteca finale, anche se sequenziato, non verrà mappato a un genoma eucariotico. In secondo luogo, poiché E. coli è una specie mesofilica, i suoi geni delle pulizie sono ottimizzati per la gamma di temperatura appropriata per SLIC-CAGE. La sequenza portante è anche integrata con siti di riconoscimento endonucleasi homing per consentire una degrado specifica del DNA derivato dalle molecole di RNA portante. La libreria di destinazione, derivata dal campione, rimane intatta, poiché i siti di riconoscimento endonuclease sono lunghi (I-CeuI - 27 bp; I-SceI 18 pb) e statisticamente improbabile nei genomi eucarioti. Dopo la degradazione specifica del vettore e la rimozione dei frammenti per esclusione di dimensioni, la libreria di destinazione è PCR amplificata e pronta per la sequenza di prossima generazione. A seconda della quantità iniziale di RNA (1-100 ng), si prevede che siano necessari tra 13-18 cicli di amplificazione PCR. La quantità finale di DNA per ogni campione varia tra 5-50 ng, producendo materiale sufficiente per il sequenziamento molto profondo. Quando si utilizza solo 1-2 ng di RNA totale, vero TSS può essere rilevato; tuttavia, si prevede che le librerie siano di minore complessità. Infine, poiché SLIC-CAGE si basa sul protocollo nAnT-iCAGE11, consente il multiplexing fino a otto campioni prima del sequenziamento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

L'analisi del cap dell'espressione genica (CAGE) è un metodo utilizzato per il rilevamento della risoluzione mononucleotide dei siti di avvio della trascrizione della polimerasi II (TSS) di RNA. Il rilevamento accurato dei TSS migliora l'identificazione e la scoperta dei promotori di base. Inoltre, gli esaltatori attivi possono essere rilevati attraverso le firme dell'avvio della trascrizione bidirezionale. Di seguito è descritto un protocollo per l'esecuzione di un vettore di input super-basso-CAGE (SLIC-CAGE). Questo adattamento SLIC del protocollo CAGE riduce al minimo le perdite di RNA aumentando artificialmente la quantità di RNA attraverso l'uso di un mix di portatori di RNA trascritto in vitro che viene aggiunto al campione di interesse, consentendo così la preparazione della libreria da nanogrammi-quantità di totale RNA (cioè migliaia di cellule). Il vettore imita la distribuzione della lunghezza del frammento della libreria del DNA prevista, eliminando così i pregiudizi che potrebbero essere causati dall'abbondanza di un vettore omogeneo. Nelle ultime fasi del protocollo, il vettore viene rimosso attraverso la degradazione con endonucleases homing e la libreria di destinazione viene amplificata. La libreria di campioni di destinazione è protetta dalla degradazione, poiché i siti di riconoscimento dell'endonuclealo sono lunghi (tra i 18 e i 27 bp), rendendo molto bassa la probabilità di loro esistenza nei genomi eucarioti. Il risultato finale è una libreria di DNA pronta per il sequenziamento di nuova generazione. Tutti i passaggi del protocollo, fino al sequenziamento, possono essere completati entro 6 giorni. La preparazione del trasportatore richiede una giornata lavorativa completa; tuttavia, può essere preparato in grandi quantità e tenuto congelato a -80 gradi centigradi. Una volta sequenziate, le letture possono essere elaborate per ottenere TSS a risoluzione mononucleotide a livello di genoma può essere utilizzato per la scoperta del promotore o del potenziatore del nucleo, fornendo informazioni sulla regolazione genica. Una volta aggregati ai promotori, i dati possono essere utilizzati anche per la profilatura delle espressioni incentrate su 5'.Once aggregated to promoters, the data can also be used for 5'--centric expression profiling.

Questo rapporto descrive il protocollo SLIC-CAGE completo per ottenere librerie pronte per il sequenziamento da nanogrammi di materiale RNA totale iniziale (Figura 1). Per ottenere il mix di portatori di RNA sintetici, in primo luogo, i modelli di portante PCR devono essere preparati e purificati in gel per eliminare i prodotti laterali PCR (Figura 2A). Ogni modello PCR (dieci in totale) viene prodotto utilizzando un inoltro comune, ma un'inversione diversa (Tabella 2), che porta a lunghezze diverse del modello PCR per consentire la variabilità delle dimensioni dei portatori di RNA sintetici. Una volta purificati, i modelli PCR vengono utilizzati per la trascrizione in vitro delle molecole portatrici. Un singolo prodotto portarna è previsto se i modelli sono purificati in gel (vedi analisi rappresentativa del gel nella Figura 2B). La preparazione del supporto può essere scalata a seconda della necessità, e quando preparato, mescolato e congelato a -80 gradi centigradi per un uso futuro.
Utilizzando la quantità minima raccomandata di RNA totale campione (10 ng) combinato con 16-18 cicli di amplificazione PCR, è possibile ottenere librerie SLIC-CAGE ad alta complessità. Il numero di cicli PCR necessari per amplificare la libreria finale dipende molto dalla quantità totale di RNA di input utilizzato (il numero previsto di cicli è indicato nella tabella4).
Dopo il primo ciclo di degradazione, nei risultati qPCR (passaggio 17), la differenza prevista tra i valori Ct ottenuti utilizzando adaptor_f1 o carrier_f1 primer è 1-2, con i valori Ct ottenuti con adaptor_f1 inferiore rispetto a carrier_f1.
La distribuzione delle lunghezze dei frammenti nella libreria finale è compresa tra 200-2.000 bp con la dimensione media del frammento di 700-900 bp (basata sull'analisi della regione utilizzando il software Bioanalyzer, Figura 4B,D). Frammenti più brevi, come illustrato nella figura 4A,C, devono essere rimossi da ulteriori cicli di esclusione di dimensioni (passaggi 20-21). Questi brevi frammenti sono artefatti di amplificazione PCR e non la libreria di destinazione. Si noti che i frammenti più brevi si raggruppano meglio sulle celle di sequenziamento e possono causare problemi di sequenziamento.
La quantità prevista di materiale di libreria ottenuto per campione è compresa tra 5-50 ng. Importi significativamente inferiori sono indicativi di perdita di campione durante il protocollo. Se la quantità bassa ottenuta è sufficiente per la sequenza (è necessaria 2-3 ng delle librerie in pool), le librerie potrebbero essere di minore complessità (vedere di seguito).
A seconda della macchina di sequenziamento, potrebbe essere necessario ottimizzare la quantità della libreria caricata nella cella di flusso. Utilizzando un Illumina HiSeq 2500, il caricamento di 8-12 pM librerie SLIC-CAGE dà in media 150-200 milioni di letture, con >80% delle letture che superano il punteggio di qualità Q30 come soglia.
Le letture ottenute vengono quindi mappate al genoma di riferimento [per letture da 50 bp, Bowtie212 può essere utilizzato con parametri predefiniti che consentono zero mancate corrispondenze per sequenza di semi (22 bp)]. L'efficienza di mappatura prevista dipende dalla quantità totale di ingresso dell'RNA e sono presentate nella tabella 5. Le letture mappate in modo univoco possono quindi essere caricate nell'ambiente di elaborazione grafico e statistico R13 ed elaborate utilizzando CAGEr (pacchetto Bioconductor14). La vignetta pacchetto è facile da seguire e spiega il flusso di lavoro e l'elaborazione dei dati mappati in dettaglio. Un facile controllo visivo della complessità della libreria è la distribuzione della larghezza del promotore, in quanto le librerie a bassa complessità avranno promotori artificialmente stretti (Figura 5A, libreria SLIC-CAGE derivata da 1 ng di RNA totale, per i dettagli si vedano pubblicazione10). Tuttavia, anche le librerie SLIC-CAGE a bassa complessità consentono l'identificazione di CTSS reali, con maggiore precisione rispetto ai metodi alternativi per il mapping TSS a basso/medio input (Figura 5B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> Figura 1: Passaggi del protocollo SLIC-CAGE. L'RNA campione viene miscelato con la miscela portante dell'RNA per ottenere 5 g di materiale totale di RNA. cDNA è sintetizzato attraverso la trascrizione inversa e il cappuccio viene ossidato utilizzando periodato di sodio. L'ossidazione consente l'attaccamento della biotina al cappuccio utilizzando l'idrato di biotina. La biotina si attacca all'estremità di 3, in quanto viene anche ossidata usando il periodato di sodio. Per eliminare la biotina dagli ibridi mRNA:cDNA con cDNA in completamente sintetizzato e dalle estremità di 3o mRNA, i campioni vengono trattati con RNase I. cDNA che ha raggiunto l'estremità 5' dell'mRNA viene quindi selezionato per purificazione di affinità su perline magnetiche streptavidin ( cap-trappola). Dopo il rilascio del cDNA, i linker da 5 a 3 vengono legati. Le molecole della biblioteca che provengono dal vettore sono degradate usando le endonucleasi i-SceI e I-CeuI e i frammenti vengono rimossi utilizzando perline magnetiche SPRI. La libreria viene quindi amplificata PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Figura 2: Analisi congiunta gel dei modelli PCR portante e trascrizioni carrier in vitro. (A) Modelli di portaggio PCR prima della purificazione del gel: il primo pozzo contiene il marcatore da 1 kbp, seguito dai modelli PCR portanti 1, 1-10. (B) Trascrizioni carrier in vitro: il primo pozzo contiene il marcatore da 1 kbp, seguito dalle trascrizioni del vettore 1-10. Le trascrizioni dei portante sono state denaturate riscaldando per 5 minuti a 95 gradi centigradi prima del caricamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Figura 3: Traccia rappresentativa della qualità del DNA (chip di DNA ad alta sensibilità) di SLIC-CAGE prima del primo ciclo di degradazione del vettore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Figura 4: Tracce rappresentative di qualità del DNA (chip di DNA ad alta sensibilità) delle librerie SLIC-CAGE dopo l'amplificazione PCR. (A) libreria SLIC-CAGE che richiede un'ulteriore selezione delle dimensioni per la rimozione di brevi frammenti. (B) Libreria SLIC-CAGE dopo la selezione delle dimensioni utilizzando 0,6x perline SPRI al rapporto campione. (C) Libreria SLIC-CAGE di quantità di output inferiore che richiede la selezione delle dimensioni per la rimozione del frammento corto. (D) Libreria SLIC-CAGE di quantità di uscita inferiore dopo la selezione delle dimensioni utilizzando 0.6:1 Spri perline al rapporto campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Figura 5: Convalida delle librerie SLIC-CAGE. (A) Distribuzione delle larghezze interquantili del tag nelle librerie SLIC-CAGE preparate a partire da 1, 5 o 10 ng di RNA totale S. cerevisiae, e nella libreria nAnT-iCAGE preparata da 5 g di S. cerevisiaeRNA totale. Una quantità elevata di cluster di tag stretti nella libreria SLIC-CAGE 1 ng ne indica la bassa complessità. (B) Curve ROC per l'identificazione CTSS nelle librerie S. cerevisiae SLIC-CAGE. Tutti i CTS S. cerevisiae nAnT-iCAGE sono stati utilizzati come un vero set. (C) Curve ROC per l'identificazione CTSS nelle librerie s. cerevisiae nanoCAGE. Tutti i CTS S. cerevisiae nAnT-iCAGE sono stati utilizzati come un vero set. Il confronto delle curve ROC mostra che SLIC-CAGE supera fortemente nanoCAGE nell'identificazione CTSS. Sono stati utilizzati i dati di ArrayExpress E-MTAB-6519. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Sequenza del gene sintetico portatore. I siti I-SceI sono in grassetto e corsivo in viola, e i siti di riconoscimenti I-CeuI sono verdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>portatore</td>
			<td colspan="2">primer inverso 5'-3'</td>
			<td>Lunghezza del prodotto PCR / bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 : il nome del</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGAGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 Il nome del sistema</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 (COM del nome</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGCTCTCTCT</td>
			<td>889 889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 DEL psu'</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTGTTGT</td>
			<td>821 (in questo stato del</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 Del numero 3(</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTCTC</td>
			<td>744 Del 144</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 È possibile:</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNNNGTGAAGAATTCTTCTCTCCA</td>
			<td>676 del sistema</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 (in questo stato</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCTCTCATAAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 (IN vio</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTCGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9 (in vie</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGGCGCCTCTCTGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 del sistema</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386 mila</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Il primer di inoltro è lo stesso per tutti i modelli di vettori. Sottolineato è la sequenza promotore T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNCAGCGTTCGCT</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Primer per l'amplificazione del modello carrier. Forward primer è lo stesso per tutti i modelli di vettore. Sottolineato è la sequenza promotore T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCGCGTTCGCT. Utilizzando diverse primer inverse, vengono prodotti modelli PCR e quindi RNA portante di lunghezza diversa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>portatore</td>
			<td>lunghezza</td>
			<td>non ancora</td>
			<td>con tappo/g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 : il nome del</td>
			<td>1034</td>
			<td>3.96 (in inglese)</td>
			<td>0,45 (in linguaggio da 1,05)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 Il nome del sistema</td>
			<td>966</td>
			<td>8.36 (in inglese)</td>
			<td>0,95 (in questo da fwlinkin base al nome)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 (COM del nome</td>
			<td>889 889</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
			<td>0,5 0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 DEL psu'</td>
			<td>821 (in questo stato del</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0,75 (in questo 0,05)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 Del numero 3(</td>
			<td>744 Del 144</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
			<td>0,5 0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 È possibile:</td>
			<td>676 del sistema</td>
			<td>Ore 3.08</td>
			<td>0,35 (in questo da fwlinka che)</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 (in questo stato</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
			<td>0,5 0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 (IN vio</td>
			<td>531</td>
			<td>3.96 (in inglese)</td>
			<td>0,45 (in linguaggio da 1,05)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9 (in vie</td>
			<td>454</td>
			<td>2.64</td>
			<td>0.3 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 del sistema</td>
			<td>386 mila</td>
			<td>2.2 2 Il suo</td>
			<td>0,25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Mix di portatori di RNA. In totale 49 g del mix portante 0,3-1 kbp: non con tappo : 44 g, con tappo di 5 g.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ingresso TOTALE rna /ng</td>
			<td>Cicli PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18 mi lato</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17 mi lato</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14 anni</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Numero previsto di cicli PCR in dipendenza dall'input totale di RNA campione. Il numero approssimativo di cicli si basa su esperimenti eseguiti utilizzando Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster e Mus musculus total RNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ingresso/ng totale di RNA</td>
			<td>% mappata complessivamente</td>
			<td>% mappata in modo univoco</td>
			<td>% vettore</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30 milio</td>
			<td>20-30 anni</td>
			<td>30 milio</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60 del sistema</td>
			<td>20-50 anni</td>
			<td>10 del sistema</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60-70 anni</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60-70 anni</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10 anni</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>Da 0 a 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70-85 anni</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5: Efficienza di mappatura prevista e dipendenza della quantità totale di ingresso dell'RNA. I numeri approssimativi sono presentati e basati su esperimenti eseguiti utilizzando Saccharomyces cerevisiae e Mus musculus total RNA.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Cap Analysis of Gene Expression (CAGE) è un metodo per la mappatura quantitativa a livello di genoma di mRNA 5'end per catturare i siti di inizio della trascrizione della polimerasi II dell'RNA a una risoluzione mononucleotide. Questo lavoro descrive un protocollo a basso input (SLIC-CAGE) per la generazione di librerie di alta qualità utilizzando quantità di nanogrammi di RNA totale.

Trascrizione Inizio mapping del sito utilizzando vettore-CAGE di input super-basso

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione genica, in quanto consente la scoperta di promotori e potenziatori di base utilizzando basse quantità di materiale di partenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una mappatura imparziale della risoluzione mono nucleotidica a livello genomico dei siti di partenza trascrizionale RNA polimerasi II utilizzando solo 10 nanogrammi di RNA totale. CAGE si sta dimostrando prezioso per scoprire i siti di inizio della trascrizione associati alla malattia che possono essere utilizzati come marcatori diagnostici.SLIC-CAGE estende queste scoperte per scalare campioni come le biopsie tissutali. SLIC-CAGE è ideale per l'analisi approfondita e ad alta risoluzione dei tipi di cellule fragili, compresi i primi stadi di sviluppo embrionale o il tessuto embrionale di una vasta gamma di organismi modello. Poiché ci sono numerosi passaggi in questo protocollo, è fondamentale ridurre al minimo la perdita di campioni in ogni passaggio facendo attenzione a recuperare il più materiale possibile durante il trasferimento tra tubi.Iniziare preparando il mix PCR per ogni modello. Combina buffer, dNTP, primer forward unico, plasmide modello con il gene portante sintetico e polimerasi di fusione secondo le indicazioni manoscritte. Mescolare i reagenti con la pipettazione.Aggiungere 90 microlitri del mix PCR a 10 microlitri di ogni primer inverso e mescolare. Fare riferimento al manoscritto per le condizioni di termociclismo. Eseguire la trascrizione inversa o RT sull'RNA di interesse.Combina un microlitro di primer di trascrizione inversa, 10 nanogrammi di RNA e 4.990 nanogrammi di mix portante in un volume totale di 10 microlitri. Mescolare pipettando su e giù. Scaldare la miscela a 65 gradi Celsius per cinque minuti e quindi posizionarla immediatamente sul ghiaccio.Preparare il mix RT secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere 28 microlitri del mix a 10 microlitri di RNA. Mescolare il contenuto del tubo con pipettando fino a omogeneo. Eseguire RT in un termociclo.Una volta completata la trascrizione inversa, purificare il prodotto con perline magnetiche SPRI senza DNasi e RNasi. Aggiungere le perline alla miscela RT con un rapporto di volume di 1,8 a uno e mescolare bene con la pipettazione. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti.Quindi, posizionare le perline su un supporto magnetico e lasciarle separare per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato al 70% alle perline. Non mescolare le perline o toglierle dal supporto magnetico e rimuovere l'etanolo immediatamente dopo l'aggiunta.Tenere il tubo sul supporto magnetico e rimuovere tutte le tracce di etanolo spingendo fuori le goccioline rimanenti con una pipetta P10. Aggiungere immediatamente 42 microlitri di acqua e pipettare su e giù 60 volte per elutare il campione, facendo attenzione a non causare schiuma. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per cinque minuti senza il coperchio e quindi separare le perline sul supporto magnetico.Quindi, trasferisci il supernatante su un nuovo set di tubi, facendo attenzione a recuperare tutti i supernatanti ma evitare il riporto di perline. Dopo il trattamento con RNasi I, mescolare 45 microlitri di campione con 105 microlitri di perline di streptavidina preparate e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, pipettare il campione ogni 10 minuti per mescolare.Quindi, separare le perline sul supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline con tamponi A, B e C.A partire dal tampone A, rimorsi le perline in 150 microlitri di tampone. Separare sul supporto magnetico per due o tre minuti, quindi rimuovere il supernatante.Preriscaldare i tamponi B e C a 37 gradi Celsius e ripetere i passaggi di lavaggio. Per rimuovere completamente tutti gli RNA non limitati, è fondamentale lavare accuratamente le perline di streptavidina e le pareti del tubo e rimuovere completamente il tampone di lavaggio prima di aggiungere quello successivo. Per rilasciare il cDNA, rimescolare le perline in 35 microlitri di tampone 1X RNasi I e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente le perline sul ghiaccio per due minuti. Separare le perline su un supporto magnetico e trasferire il supernatante in un nuovo set di tubi. Rimescolare le perline in 30 microlitri di tampone 1X RNasi I e quindi separarsi su un supporto magnetico.Combina il supernatante con il supernatante precedentemente raccolto per un volume totale di circa 65 microlitri. Eseguire qPCR per determinare il numero di cicli PCR per l'amplificazione della libreria di destinazione. Preparare i mix master qPCR per amplificare intere librerie di DNA dal vettore.Impostare le condizioni di termociclismo in base alle indicazioni manoscritte e amplificare il campione preparato. Il protocollo SLIC-CAGE consente di ottenere librerie pronte per il sequenziamento da nanogrammi di materiale di RNA iniziale. La lunghezza del frammento nella libreria finale varia tra 200 e 2.000 coppie di basi.Frammenti più brevi sono artefatti PCR e possono causare problemi di sequenziamento lungo la linea. È possibile eseguire ulteriori arrotondamenti di selezione delle dimensioni per rimuoverli. Rispetto a NanoCAGE, SLIC-CAGE mostra prestazioni significativamente migliori all'identificazione del sito di inizio trascrizione, che è evidente dalle curve caratteristiche operative del ricevitore delle due tecniche eseguite su varie quantità di RNA totale S.cerevisiae.Durante l'esecuzione di questo protocollo, è importante tenere presente che la perdita di campioni può portare a librerie a bassa complessità. Per prevenirlo, è necessario utilizzare punte e tubi a pipetta a bassa legatura. Senza SLIC-CAGE, l'analisi dei promotori di vari tipi di cellule è stata finora inaccessibile.Ciò include l'analisi degli stadi di sviluppo embrionale o del tessuto embrionale da una vasta gamma di organismi modello.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Ricerca

Genetica

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Sistema di integrazione bidirezionale retrovirale Metodo PCR e flusso di lavoro analitico dei dati quantitativi

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...