Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

この研究は、ウェルカム・トラスト助成金(106954)がB.L.と医学研究評議会(MRC)コア・ファンディング(MC-A652-5QA10)に授与されました。N. C. は EMBO 長期フェローシップ (EMBO ALTF 1279-2016) によってサポートされました。E. P. は、英国医学研究評議会によって支援されました。B. L. は、英国医学研究評議会 (MC UP 1102/1) によってサポートされました。

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

分解性キャリアRNA/DNAの特許が満たされています。

SLIC-CAGEライブラリの準備を成功させるためには、サンプル吸着によるサンプル損失を防ぐために、低結合のヒントとチューブを使用することが重要です。上清の取り出しを伴うすべてのステップで、サンプル量全体を回収することをお勧めします。プロトコルには複数のステップがあるため、サンプルの連続的な損失はライブラリの失敗につながります。
CAGE(nAnT-iCAGE)が日常的に行われていない場合は、同じ総RNAサンプルの異なる入力量(10ng、20ng、50ng、100 ng、200 ng)でSLIC-CAGEをテストし、合計RNAの5μgを使用して調製されたnAnT-iCAGEライブラリと比較することをお知りください。nAnT-iCAGEライブラリーが失敗した場合(サンプルごとに得られたDNAライブラリーの0.5-1 ng未満)、SLIC-CAGEは機能しそうになく、サンプル損失を最小限に抑える必要があります。
上限のない劣化RNAまたはrRNAを欠いている高品質のライブラリーを確保するための重要なステップは、セクション7で説明するキャップトラップです。ストレプトアビジンビーズが洗浄バッファーで完全に再懸濁され、洗浄バッファーが次の洗浄工程またはcDNAの溶出に続く前に除去されることが非常に重要です。
キャリア劣化の最初のラウンド後のqPCRの結果が、アダプター_f1とcarrier_f1プライマーの使用との間に違いがない場合は、プロトコルを継続することをお勧めします。キャリア劣化の第2ラウンドの後、Ct値の差が5未満の場合、キャリア劣化の第3ラウンドが推奨される。我々は必要な劣化の第三ラウンドを見つけたことがなく、それが発生した場合は、ホーミングエンドヌクレアーゼ株を交換することをお勧めします。
取得したライブラリの最終的な量がシーケンスに十分でない場合は、PCR 増幅の追加ラウンドがプロトコルに追加される可能性があります。PCR増幅は、サイズ選択で避けることができないサンプル損失を考慮して、シーケンシングに十分な材料を得るために必要な増幅サイクルの最小数で設定できます。SPRI磁気ビーズを使用した精製またはサイズ選択は、すべての小さな(<200 bp)フラグメントが除去されるまで実行され(必要に応じて0.6:1ビーズをサンプル比に使用)、ライブラリはPicogreenを使用して定量化する必要があります。
ライブラリは、シングルエンドモードまたはペアエンドモードでシーケンスできます。ペアエンドシーケンスを使用すると、トランスクリプトアイソフォームに関する情報を取得できます。さらに、逆転写はランダムプライマー(TCT-N 6、N6はランダムヘキサマー)を用いて行われるので、配列された3'エンドからの情報は、PCRの重複を崩壊させる一意の分子識別子(UMI)として使用することができる。適度な数のPCR増幅サイクルが使用される(最大18)ため、UMIの使用は以前に不要であることが分かっています。
プロトコルのコアは nAnT-iCAGE11に依存しているため、SLIC-CAGE は 8 つのバーコードを使用します。したがって、現在、8 個を超えるサンプルの多重化はサポートされていません。さらに、SLIC-CAGEとnAnT-iCAGEの両方は、プロトコルがAMPure XPビーズを使用してサイズ除外を通じてリンカーとPCRアーティファクトを除去するように設計されているので、200 bpより短いRNAをキャプチャするのに適していません。
SLIC-CAGEは、全RNA材料のナノグラムを用いて転写開始開始部位をマッピングするための唯一の偏りのない低入力単一ヌクレオチド分解能法である。代替方法は、キャップトラップの代わりにバーコードキャップRNAに逆転写酵素のテンプレート切り替え活性に依存する(例えば、NanoCAGE15およびNanoPARE16)。テンプレートの切り替えにより、これらの方法はTSS検出において配列固有のバイアスを示し、偽陽性TSSの数が増加し、真のTSS9、10の数が減少します。

遺伝子発現のキャップ解析(CAGE)は、RNAポリメラーゼII転写開始部位(TSSS)1の単一ヌクレオチド分解能ゲノムワイドマッピングに用いられる方法である。その定量的な性質により、5'エンド中心の式プロファイリングも可能になります。TSSを取り巻く領域(上流および下流約40bp)はコアプロモーターであり、RNAポリメラーゼIIと一般的な転写因子が結合する物理的位置を表す(前述の2、3を検討)。TSSの正確な位置に関する情報は、コアプロモーターの発見およびプロモーターダイナミクスの監視に使用できます。さらに、アクティブエンハンサーは双方向転写のシグネチャを示すので、CAGEデータはエンハンサーダイナミクス4のエンハンサー検出およびモニタリングにも使用できます。CAGEの方法論は、最近、ENCODE 5、modENCODE 6、およびFANTOMプロジェクト7などの注目の研究プロジェクトでの幅広い応用と使用のために人気が高まっています。さらに、TSS情報はまた、疾患特異的TSSが診断目的8に使用することができるので、健康な組織および疾患組織を区別するために重要であることが証明されている。
TSSマッピングのためのいくつかの方法(CAGE、RAMPAGE、STRT、ナノケージ、ナノケージ-XL、オリゴキャッピング)が利用可能ですが、私たちと他の人は最近、CAGEが偽陽性の数が最も少ない真のTSSをキャプチャする最も公平な方法であることを示しました9,10.最近のCAGEプロトコルnAnT-iCAGE11は、制限酵素を使用してフラグメントを短いタグに切断することを回避し、PCR増幅を使用しないため、TSSプロファイリングのための最も公平なプロトコルです。nAnT-iCAGEプロトコルの制限は、大量の出発物質(例えば、各サンプルに対する総RNAの5μg)の要件である。特定の、生物学的に関連する質問に答えるために、多くの場合、そのような大量の出発物質(例えば、FACS選別細胞または初期胚期)を得ることは不可能である。最後に、nAnT-iCAGEが成功した場合、各サンプルから入手できるDNAライブラリー材料は1~2ngのみで、達成可能なシーケンシング深さを制限します。
総RNAのナノグラムのみを用いてTSSプロファイリングを可能にするために、最近、超低入力キャリアCAGE 10(SLIC-CAGE、図1)を開発しました。SLIC-CAGEは、高複雑性ライブラリを得るために合計RNAのわずか10 ngしか必要としならない。当社のプロトコルは、目的のRNAに追加された慎重に設計された合成RNAキャリアに依存し、合計5μgのRNA材料を達成します。合成キャリアは、過剰に均質な分子によって引き起こされる可能性のある潜在的なバイアスを回避するために、長さの分布の標的DNAライブラリーを模倣します。担体の配列は、2つの理由から、大腸菌ロイチルtRNA合成酵素遺伝子(表1)の配列に基づいている。第一に、最終ライブラリー内のキャリアの残りは、たとえ配列されたとしても、真核生物ゲノムにマッピングされない。第二に、大腸菌は中親和種であるため、そのハウスキーピング遺伝子はSLIC-CAGEに適した温度範囲に最適化されています。キャリア配列はまた、キャリアRNA分子に由来するDNAの特異的な分解を可能にするためにホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と組み込まれています。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が長いため、標的、サンプル由来ライブラリーはそのまま残ります(I-CeuI = 27 bp;I-SceI = 18 bp)および真核生物ゲノムに統計的に見られる可能性は低い。キャリアの特定の劣化とサイズ除外によるフラグメントの除去後、ターゲットライブラリはPCR増幅され、次世代シーケンシングの準備が整います。開始RNA量(1-100 ng)に応じて、13〜18 PCR増幅サイクルが必要とされる。各サンプルあたりのDNAの最終的な量は5〜50 ngの間の範囲で、非常に深いシーケンシングのための十分な材料を得る。総RNAの1-2 ngのみを使用する場合、真のTSSを検出することができます。ただし、ライブラリの複雑さは低くなるものが予想されます。最後に、SLIC-CAGEはnAnT-iCAGEプロトコル11に基づいているため、シーケンス前に最大8つのサンプルの多重化が可能です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

遺伝子発現のキャップ解析(CAGE)は、RNAポリメラーゼII転写開始部位(TSS)の単一ヌクレオチド分解能検出に用いられる方法である。TSSの正確な検出は、コアプロモーターの同定と発見を強化します。さらに、活性エンハンサーは、双方向転写開始のシグネチャを介して検出することができる。ここでは、超低入力キャリアケージ(SLIC-CAGE)を実行するためのプロトコルです。CAGEプロトコルのこのSLIC適応は、目的のサンプルに追加されたインビトロ転写RNAキャリアミックスの使用を通じてRNA量を人工的に増加させることによりRNA損失を最小限に抑え、合計ナノグラム量からのライブラリー調製を可能にします。RNA(すなわち、何千もの細胞)。キャリアは、予想されるDNAライブラリー断片長分布を模倣し、それによって均質なキャリアの豊富さによって引き起こされる可能性のあるバイアスを排除する。プロトコルの最後の段階では、ホーミングエンドヌクレアーゼでキャリアが分解され、ターゲットライブラリが増幅されます。標的サンプルライブラリーは、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が長く(18~27bpの間)、真核ゲノム中に存在する確率が非常に低いため、劣化から保護されています。最終的な結果は、次世代シーケンシングの準備ができているDNAライブラリです。プロトコル内のすべてのステップは、シーケンスまで、6日以内に完了できます。キャリアの準備は、完全な営業日を必要とします。しかし、それは大量に調製することができ、-80 °Cで凍結保存することができます。配列決定後、読み取りを処理してゲノム全体の単一ヌクレオチド分解能TSSsを得ることができます。プロモーターに集約されると、データは 5'中心の式プロファイリングにも使用できます。

本報告では、開始総RNA材料のナノグラムからシーケンシング対応ライブラリを取得するための完全なSLIC-CAGEプロトコルについて説明します(図1)。合成RNAキャリアミックスを得るためには、まず、PCR担体を調製し、PCR副産物を排除するためにゲル精製する必要がある(図2A)。各PCRテンプレート(合計10個)は、共通のフォワードを使用して生成されますが、異なるリバースプライマー(表2)を使用して、合成RNAキャリアのサイズ変動を可能にするためにPCRテンプレートの長さが異なります。精製されると、PCRテンプレートは、キャリア分子のインビトロ転写に使用される。テンプレートがゲル精製された場合、単一のRNAキャリア産物が期待されます(図2Bの代表的なゲル分析を参照)。キャリアの調製は、必要性に応じてアップスケールすることができ、準備すると、将来の使用のために-80 °Cで混合し、凍結します。
推奨されるサンプル総RNA(10ng)の推奨最小量と16-18サイクルのPCR増幅を組み合わせることで、高い複雑性SLIC-CAGEライブラリを実現できます。最終的なライブラリーを増幅するために必要なPCRサイクルの数は、使用される入力RNAの総数に大きく依存します(予想サイクル数は表4に示されています)。
劣化の最初のラウンドの後、qPCR結果(ステップ17)では、アダプター_f1またはcarrier_f1プライマーを使用して得られたCt値の予想差は1-2であり、アダプター_f1で得られたCt値はcarrier_f1よりも低い。
最終ライブラリにおけるフラグメント長の分布は200~2,000 bpで、平均フラグメントサイズは700~900bpです(Bioanalyzerソフトウェアを使用した領域解析に基づく図4B、D)。図4A、Cに示すように、短いフラグメントは、サイズ除外の追加ラウンドによって除去されなければならない(ステップ20〜21)。これらの短いフラグメントは、対象ライブラリではなく、PCR増幅アーティファクトです。フラグメントが短いほど、シーケンス フロー セルのクラスタが向上し、シーケンスの問題が発生する可能性があることに注意してください。
サンプル当たり得られるライブラリー材料の期待量は5〜50ngの間である。有意に低い量は、プロトコル中のサンプル損失を示します。取得した低い量がシーケンスに十分である場合 (プールされたライブラリの 2 ~ 3 ng が必要)、ライブラリの複雑さが低くなる可能性があります (下記参照)。
シーケンスマシンによっては、フローセルにロードされるライブラリの量を最適化する必要がある場合があります。Illumina HiSeq 2500 を使用して、8-12 pM SLIC-CAGE ライブラリを読み込むと、平均で 150 ~ 2 億の読み取りが得られますが、読み取りの 80% が品質スコア Q30 をしきい値として渡します。
得られた読み取りは、参照ゲノムにマッピングされます [50 bp 読み取り、Bowtie212は、シード シーケンスごとのミスマッチをゼロにするデフォルト パラメータ (22 bp)] で使用できます。予想されるマッピング効率は、RNA 入力の合計量に依存し、表 5に示します。一意にマップされた読み取りは、R グラフィカルおよび統計計算環境13にロードし、CAGEr (生体伝導体パッケージ14)を使用して処理できます。パッケージビネットは簡単に追従でき、マッピングされたデータのワークフローと処理を詳細に説明します。ライブラリの複雑さの容易な視覚的制御は、低複雑性ライブラリが人工的に狭いプロモーターを持つため、プロモーター幅の分布です(図5A、SLIC-CAGEライブラリは、総RNAの1 ngから派生した、詳細については、前を参照してください)パブリケーション 10)。ただし、複雑度の低い SLIC-CAGE ライブラリでも、低/中入力 TSS マッピングの代替方法よりも高い精度で真の CTSS を識別できます (図 5B、C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> 図 1:SLIC-CAGE プロトコルの手順。サンプルRNAは、全RNA材料の5μgを達成するためにRNAキャリアミックスと混合される。cDNAは、逆転写を介して合成され、キャップは、ナトリウム周期を使用して酸化されます。酸化は、ビオチンヒドラジドを使用してキャップにビオチンの添付を可能にします。ビオチンは、周期ナトリウムを使用して酸化されるので、mRNAの3′末端に付着します。mRNA:cDNAを不完全に合成したcDNAとmRNAの3′末端からビオチンを排除するために、サンプルはmRNAの5′末端に達したRNase I.cDNAで処理され、次にストレプトアビジン磁気ビーズの親和性精製によって選択されます(キャップトラップ)。cDNAの放出後、5'-および3'リンカーがライゲーションされる。キャリアに由来するライブラリー分子は、I-SceIおよびI-CeuIホーミングエンドヌクレアーゼを使用して分解され、断片はSPRI磁気ビーズを使用して除去されます。その後、ライブラリはPCR増幅されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> 図2:インビトロ転写におけるキャリアPCRテンプレートおよびキャリアの代表的なゲル分析。(A)ゲル精製前のキャリアPCRテンプレート:第1ウェルは1kbpマーカーを含み、続いてキャリアPCRテンプレート1、1〜10が続く。(B)インビトロ転写物中のキャリア:第1のウェルは1kbpマーカーを含み、続いてキャリア転写物1〜10が続く。キャリア転写物は、積載前に95°Cで5分間加熱することにより変性した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> 図3:キャリア劣化の第1ラウンド前のSLIC-CAGEの代表的なDNA品質(高感度DNAチップ)の痕跡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> 図4:PCR増幅後のSLIC-CAGEライブラリーの代表的なDNA品質(高感度DNAチップ)の痕跡。(A) SLIC-CAGE ライブラリで、短いフラグメントを削除するために追加のサイズ選択が必要です。(B) SLIC-CAGE ライブラリ 0.6x SPRI ビーズを使用してサンプル比を使用してサイズ選択後。(C) SLIC-CAGE ※短いフラグメントの除去にサイズ選択が必要な出力量が少ない。(D) SLIC-CAGEライブラリは、0.6:1 SPRIビーズをサンプル比に使用してサイズ選択後の出力量が少ない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> 図 5:SLIC-CAGE ライブラリの検証。(A) SLIC-CAGEライブラリーにおけるタグクラスター間質幅の分布は、S.セレビシエ総RNAの1、5、または10ngから調製し、およびS.セレビシエ総RNAの5μgから調製されたnAnT-iCAGEライブラリー内で。1 ng SLIC-CAGE ライブラリ内の狭いタグ クラスタの量が多い場合は、その複雑さが低いことを示します。(B) S. セレビシエSLIC-CAGE ライブラリーにおける CTSS 識別のための ROC 曲線。すべてのS. セレビシエnAnT-iCAGE CTSSS が真のセットとして使用されました。(C) S.セレビシエナノケージライブラリーにおけるCTSS同定のためのROC曲線。すべてのS. セレビシエnAnT-iCAGE CTSSS が真のセットとして使用されました。ROC曲線の比較は、SLIC-CAGEがCTSS同定においてナノケージを強く上回っていることを示している。アレイエクスプレスE-MTAB-6519からのデータが使用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:担体合成遺伝子の配列。I-SceI サイトは太字で紫色で斜体化され、I-CeuI 認識サイトは緑色です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キャリア</td>
			<td colspan="2">リバースプライマー 5'-3'</td>
			<td>PCR 製品の長さ / bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NnNNNNNCTACGTCGCAGAAATT</td>
			<td>1034年</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966の</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NnNNNCACTGGGGCTCTCTTTACG</td>
			<td>889の</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NnNNNGCCGTCACTTTCGTTCGT</td>
			<td>821の</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NnNNNNNNナグットガットガガグトCTTC</td>
			<td>744の</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAGAGAGAATTTTTCCCA</td>
			<td>676の</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTAAC</td>
			<td>599の</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNNNNNTCGCGGTGTCGTAC</td>
			<td>531の</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCCGCGCCCCGCAGG</td>
			<td>454名</td>
		</tr>
<tr>
<td>10歳</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNAGAGGGCGTTTTGCCCCA</td>
			<td>386の</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">*フォワードプライマーは、すべてのキャリアテンプレートで同じです。下線が引かれているのはT7プロモーターシーケンスです。PCR_GN5_f1: タアダクアクトカタニャンNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: キャリア テンプレート増幅用のプライマー。フォワード プライマーは、すべてのキャリア テンプレートで同じです。下線が引かれているのはT7プロモーターシーケンスです。PCR_GN5_f1:タアタクアクトカッタGNNNCAGCGTTCGCTA.異なるリバースプライマーを使用して、PCRテンプレート、したがって、異なる長さのキャリアRNAが生成されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キャリア</td>
			<td>長さ</td>
			<td>上限なし/μg</td>
			<td>上限/μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034年</td>
			<td>3.96件</td>
			<td>0.45分</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966の</td>
			<td>8.36件</td>
			<td>0.95件</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889の</td>
			<td>4.4年</td>
			<td>0.5年</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821の</td>
			<td>6.6年</td>
			<td>0.75年</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744の</td>
			<td>4.4年</td>
			<td>0.5年</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676の</td>
			<td>3.08件</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599の</td>
			<td>4.4年</td>
			<td>0.5年</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531の</td>
			<td>3.96件</td>
			<td>0.45分</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454名</td>
			<td>2.64から</td>
			<td>0.3年</td>
		</tr>
<tr>
<td>10歳</td>
			<td>386の</td>
			<td>2.2年</td>
			<td>0.25分</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:RNAキャリアミックス。キャリアミックス0.3-1 kbpの合計49 μg:上限なし= 44 μg、キャップ= 5 μg。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>合計 RNA 入力 /ng</td>
			<td>PCR サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16日</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15日</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15日</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14日</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4:サンプル総RNA入力の依存性におけるPCRサイクルの予想数。概算サイクル数は、サッカロマイセスセレビシエ、ショウジョウバエメラノガスター、およびマスマス全RNAを用いて行われた実験に基づいている。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>合計 RNA 入力/ng</td>
			<td>全体マップ率</td>
			<td>% 一意にマップ</td>
			<td>% キャリア</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30歳</td>
			<td>20-30日</td>
			<td>30歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60歳</td>
			<td>20から50</td>
			<td>10歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60から70</td>
			<td>40から60</td>
			<td>5-10日</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60から70</td>
			<td>40から60</td>
			<td>5-10日</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65から80</td>
			<td>40から70</td>
			<td>0~5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65から80</td>
			<td>40から70</td>
			<td>0~3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70から85</td>
			<td>40から70</td>
			<td>0~2</td>
		</tr>
</tbody></table>表5:予想されるマッピング効率と総RNA入力量の依存性について。おおよその数が提示され、サッカロマイセスセレビシエとムスムスルムス総RNAを用いて行われた実験に基づいて提示される。

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

遺伝子発現のキャップ解析(CAGE)は、単一ヌクレオチド分解能でRNAポリメラーゼII転写開始部位を捕捉するためにmRNA5'端部のゲノム全体の定量マッピングのための方法である。本研究では、総RNAのナノグラム量を用いて高品質なライブラリを生成するための低入力(SLIC-CAGE)プロトコルについて述べている。

超低入力キャリア-CAGEを使用した転写開始サイトマッピング

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

この方法は、低量の出発物質を使用してコアプロモーターおよびエンハンサー発見を可能にするため、遺伝子調節の分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、全RNAの10ナノグラムのみを使用してRNAポリメラーゼII転写開始部位の公平な、ゲノム全体の単一ヌクレオチド分解能マッピングを可能にすることです。CAGEは、診断マーカーとして使用できる疾患関連の転写開始部位を明らかにするのに非常に貴重であることが証明されています。SLIC-CAGEは、これらの発見を拡張して、組織生検などのサンプルをスケーリングします。SLIC-CAGEは、初期の胚発生段階または幅広いモデル生物からの胚組織を含む虚弱細胞タイプの詳細かつ高解像度プロモーター分析に理想的です。このプロトコルには多数のステップがあるため、チューブ間を移動する際にできるだけ多くの材料を取り出すように注意して、各ステップでサンプル損失を最小限に抑えることが重要です。まず、各テンプレートに PCR ミックスを準備します。バッファー、dNTP、ユニークなフォワードプライマー、鋳型プラスミドと合成キャリア遺伝子、および原稿の指示に従った融合ポリメラーゼを組み合わせます。ピペットによる試薬を混合する。各リバースプライマーの10マイクロリットルにPCRミックスの90マイクロリットルを加え、混合します。サーモサイクリングの条件については、原稿を参照してください。目的のRNAに対して逆転写またはRTを行う。1マイクロリットルの逆転写プライマー、10ナノグラムのRNA、および4,990ナノグラムのキャリアミックスを合計10マイクロリットルで組み合わせます。上下にピペットを入れ、混ぜます。混合物を摂氏65度に5分間加熱し、すぐに氷の上に置きます。原稿の方向に従ってRTミックスを準備し、RNAの10マイクロリットルにミックスの28マイクロリットルを追加します。均質になるまでピペッティングしてチューブの内容物を混ぜます。サーモサイクラーでRTを実行します。逆転写が完了したら、DNaseおよびRNaseフリーのSPRI磁気ビーズで製品を精製します。1.8対1の体積比でRTミックスにビーズを追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を室温で5分間座らせます。その後、ビーズを磁気スタンドに置き、5分間分離させます。上清を捨て、作りたての70%エタノールを200マイクロリットルをビーズに加えます。ビーズを混ぜたり、磁気スタンドから取り出したり、添加後すぐにエタノールを取り除いたりしないでください。チューブを磁気スタンドに置き、残りの液滴をP10ピペットで押し出してエタノールの痕跡をすべて取り除いてください。42マイクロリットルの水を即時に加え、ピペットを60回上下して溶出サンプルに加え、発泡を引き起こさないのに注意してください。蓋を付けずに5分間摂氏37度でチューブをインキュベートし、磁気スタンドのビーズを分離します。その後、上清を新しいチューブのセットに移し、すべての上清を取り出すが、ビーズの持ち越しを避けるように注意してください。RNase I処理後、45マイクロリットルのサンプルを105マイクロリットルのストレプトアビジンビーズと混合し、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション中、10分ごとにサンプルをピペットして混合する。次に、磁気スタンドのビーズを分離し、上清を取り除きます。バッファーA、B、C.バッファAでビーズを洗い、150マイクロリットルのバッファーでビーズを再懸濁します。磁気スタンドで2~3分分分離し、上清を取り外します。バッファBとCを摂氏37度に予熱し、洗浄手順を繰り返します。すべての非キャップRNAを除去するには、ストレプトアビジンビーズとチューブウォールを十分に洗浄し、次のものを追加する前に洗浄バッファーを完全に取り除くすることが重要です。cDNAを放出するには、ビーズを1X RNase Iバッファーの35マイクロリットルで再懸濁し、摂氏95度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、すぐにビーズを氷の上に2分間置きます。磁気スタンドのビーズを分離し、上清を新しいチューブセットに移します。ビーズを1X RNase Iバッファの30マイクロリットルに再懸濁し、磁気スタンドで分離します。上清と以前に収集した上清を組み合わせて、合計容量は約65マイクロリットルです。qPCR を実行して、ターゲットライブラリ増幅の PCR サイクル数を決定します。キャリアからDNAのライブラリー全体を増幅するためにqPCRマスターミックスを準備します。原稿の方向に従ってサーモサイクリング条件を設定し、準備したサンプルを増幅します。SLIC-CAGEプロトコルは開始RNA材料のナノグラムからシーケンシング対応ライブラリを得ることを可能にする。最終ライブラリのフラグメント長は、200 から 2,000 の基本ペアの範囲です。短いフラグメントは PCR アーティファクトであり、行の下にシーケンスの問題を引き起こす可能性があります。サイズ選択の追加ラウンドを実行して、サイズを削除できます。NanoCAGEと比較して、SLIC-CAGEは転写開始部位同定において有意に優れた性能を示し、これはS.cerevisiae総RNAの様々な量に対して行われた2つの技術の特性曲線を操作する受信機から明らかである。このプロトコルを実行する際は、サンプルの損失が複雑性の低いライブラリにつながる可能性があることを念頭に置いておく必要があります。それを防ぐために、低結合ピペットの先端および管を使用しなければならない。SLIC-CAGEがなければ、様々な細胞タイプのプロモーター分析は、これまでアクセスできないです。これには、幅広いモデル生物からの胚発生期または胚組織の分析が含まれる。

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

BrUTP本鎖特異的転写ランオン（TRO）のアプローチを使用した転写の終結の分析

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...