Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen genregulering, da det gjør det mulig for kjernearrangør og enhancer-oppdagelse ved hjelp av lave mengder startmateriale. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater objektiv, genom-wide enkelt nukleotid oppløsning kartlegging av RNA polymerase II transkripsjonsstartsteder ved hjelp av bare 10 nanogram av totalt RNA. CAGE viser seg å være uvurderlig for å avdekke sykdomsrelaterte transkripsjonsstartsteder som kan brukes som diagnostiske markører.
SLIC-CAGE utvider disse funnene for å skalere prøver som vevsbiopsier. SLIC-CAGE er ideelt egnet for grundig og høyoppløselig promotoranalyse av skrøpelige celletyper, inkludert tidlige embryonale utviklingsstadier eller embryonalt vev fra et bredt spekter av modellorganismer. Siden det er mange trinn i denne protokollen, er det avgjørende å minimere prøvetap i hvert trinn ved å ta vare på å hente så mye materiale som mulig når du overfører mellom rørene.
Start med å klargjøre PCR-blandingen for hver mal. Kombiner buffer, dNTPs, unik fremover primer, mal plasmid med syntetisk bærer genet, og fusjon polymerase i henhold til manuskript retninger. Bland reagenser ved pipettering.
Tilsett 90 mikroliter av PCR-blandingen til 10 mikroliter av hver omvendt primer og bland. Se manuskriptet for termocyklerende forhold. Utfør omvendt transkripsjon eller RT på RNA av interesse.
Kombiner en mikroliter omvendt transkripsjon primer, 10 nanograms av RNA, og 4, 990 nanograms av bærer blanding i et totalt volum på 10 mikroliter. Bland ved å pipetter opp og ned. Varm blandingen til 65 grader Celsius i fem minutter og legg den umiddelbart på is.
Forbered RT-blandingen i henhold til manuskriptinstruksjonene og legg til 28 mikroliter av blandingen til 10 mikroliter RNA. Bland innholdet i røret ved å pipettering til homogen. Kjør RT i en termocycler.
Når omvendt transkripsjon er fullført, rense produktet med DNase og RNase-frie SPRI magnetiske perler. Tilsett perlene til RT-blandingen med et volumforhold på 1,8 til en og bland godt ved å pipettering. La blandingen sitte ved romtemperatur i fem minutter.
Deretter plasserer du perlene på et magnetisk stativ og lar dem skille i fem minutter. Kast det supernatante og tilsett 200 mikroliter nylaget 70% etanol til perlene. Ikke bland perlene eller ta dem av magnetstativet og fjern etanol umiddelbart etter tilsetning.
Hold røret på magnetstativet og fjern alle spor av etanol ved å skyve eventuelle gjenværende dråper ut med en P10 pipette. Tilsett umiddelbart 42 mikroliter vann, og pipette opp og ned 60 ganger for å elute prøven, og ta vare på å ikke forårsake skumdannelse. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i fem minutter uten lokket og separer deretter perlene på det magnetiske stativet.
Deretter overfører du supernatanten til et nytt sett med rør, og tar vare på å hente alle overnaturlige, men unngå perleoverførsel. Etter RNase I behandling, bland 45 mikroliter prøve med 105 mikroliter forberedt streptavidin perler og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Under inkubasjonen pipette prøven hvert 10.
Deretter skiller du perlene på det magnetiske stativet og fjerner det overnaturlige. Vask perlene med buffere A, B og C.Starter med buffer A, gjenbruk perlene i 150 mikroliter buffer. Skill på magnetstativet i to til tre minutter, og fjern deretter det overnaturlige.
Forvarm buffere B og C til 37 grader Celsius og gjenta vasketrinnene. For å fjerne alle ikke-avgrensede RNA, er det avgjørende å vaske streptavidin perler og rørvegger grundig og å fjerne vaskebufferen helt før du legger til den neste. For å frigjøre cDNA, resuspend perlene i 35 mikroliter av 1X RNase I buffer og inkubere ved 95 grader Celsius i fem minutter.
Etter inkubasjon, legg umiddelbart perlene på is i to minutter. Skill perlene på et magnetisk stativ og overfør det overnaturlige til et nytt sett med rør. Resuspend perlene i 30 mikroliter av 1X RNase I buffer og deretter skille på et magnetisk stativ.
Kombiner det overnaturlige med det tidligere innsamlede supernatantet for et totalt volum på ca. 65 mikroliter. Utfør qPCR for å bestemme antall PCR-sykluser for forsterkning av målbibliotek. Forbered qPCR-mesterblandingene for å forsterke hele biblioteker av DNA fra transportøren.
Angi termocyklerende forhold i henhold til manuskriptretninger og forsterke den tilberedte prøven. SLIC-CAGE-protokollen gjør det mulig å få sekvenseringsklare biblioteker fra nanogrammer for å starte RNA-materiale. Fragmentlengden i det endelige biblioteket varierer mellom 200 og 2000 basispar.
Kortere fragmenter er PCR-artefakter og kan forårsake sekvenseringsproblemer nedover linjen. Ytterligere runder med størrelsesvalg kan utføres for å fjerne dem. Sammenlignet med NanoCAGE viser SLIC-CAGE betydelig bedre ytelse ved transkripsjon startstedsiden identifikasjon, noe som er tydelig fra mottakerens fungerende karakteristiske kurver av de to teknikkene som utføres på ulike mengder S.cerevisiae totalt RNA.
Når du utfører denne protokollen, er det viktig å huske på at prøvetap kan føre til biblioteker med lav kompleksitet. For å unngå det må lavbindende pipettespisser og rør brukes. Uten SLIC-CAGE har promoteranalyse av ulike celletyper så langt vært utilgjengelig.
Dette inkluderer analyse av embryonale utviklingsstadier eller embryonalt vev fra et bredt spekter av modellorganismer.
