Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Wellcome Trust Grant (106954) concedido ao B. L. e ao financiamento do núcleo do Conselho de pesquisa médica (MRC) (MC-A652-5QA10). O N. C. foi apoiado pela bolsa de longa duração EMBO (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. foi apoiado pelo Conselho de pesquisa médica do Reino Unido; B. L. foi apoiado pelo Conselho de pesquisa médica do Reino Unido (MC UP 1102/1).

<ol>
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Uma patente para o RNA/ADN degradável do portador foi enchida.

Para preparações bem sucedidas da biblioteca de SLIC-CAGE, é crítico usar pontas e tubos Low-Binding para impedir a perda da amostra devido à adsorção da amostra. Em todas as etapas que envolvem a recuperação do sobrenadante, recomenda-se recuperar o volume de entiresample. Como o protocolo tem várias etapas, a perda de amostra contínua levará a bibliotecas sem êxito.
Se CAGE (nAnT-iCAGE) não tiver sido realizado rotineiramente, é melhor testar SLIC-CAGE com diferentes quantidades de entrada (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) da mesma amostra total de RNA e comparar com as bibliotecas nAnT-iCAGE que são preparadas usando 5 μg de RNA total. Se a biblioteca nAnT-iCAGE não for bem-sucedida (menos de 0,5-1 ng da biblioteca de DNA obtida por amostra), o SLIC-CAGE dificilmente funcionará e a perda da amostra deverá ser minimizada.
Um passo crítico para garantir que bibliotecas de alta qualidade desprovidas de RNA ou rRNA degradado não tampado é a captura de tampa descrita na seção 7. É altamente importante que os grânulos de estreptavidina estejam completamente resrepended em tampões de lavagem e que os bufferes da lavagem estejam removidos antes de continuar à etapa seguinte da lavagem ou à eluição do cDNA.
Se os resultados do qPCR após a primeira rodada de degradação do portador não mostrarem diferença entre o uso de primers adaptor_f1 e carrier_f1, continuar o protocolo ainda é recomendado. Se após a segunda rodada de degradação do portador, a diferença nos valores de TC for inferior a cinco, recomenda-se uma terceira rodada de degradação do transportador. Nós nunca encontramos uma terceira rodada de degradação necessária, e se isso ocorrer, recomenda-se substituir os estoques de endonuclease homing.
Os círculos adicionais da amplificação do PCR podem ser adicionados ao protocolo se a quantidade final da biblioteca obtida não é bastante para arranjar em seqüência. A amplificação do PCR pode então ser ajustada com número mínimo de ciclos da amplificação necessários para render bastante material para arranjar em seqüência, tendo em consideração a perda da amostra que não pode ser evitada na seleção do tamanho. A purificação ou a seleção do tamanho usando grânulos magnéticos de SPRI devem então ser executadas até que todos os fragmentos pequenos (< 200 BP) sejam removidos (se necessário, usam 0.6:1 grânulos à relação da amostra), e a biblioteca deve ser quantificada usando Picogreen.
As bibliotecas podem ser sequenciadas em modo single-end ou emparelhado. Usando o sequenciamento de fim emparelhado, informações sobre isoformas de transcrição podem ser obtidas. Além, porque a transcrição reversa é executada usando um primer aleatório (TCT-N6, n6 que é um hexamer aleatório), a informação do 3 '-fim seqüenciado pode ser usada como identificadores MOLECULARS originais (Umi) para recolher duplicatas do PCR. Como um número moderado de ciclos da amplificação do PCR é usado (até 18), o uso de UMIs foi encontrado previamente para ser desnecessário.
Como o núcleo do protocolo depende nAnT-iCAGE11, SLIC-Cage usa oito códigos de barras. Portanto, não há suporte para multiplexação de mais de oito amostras no momento. Além disso, tanto o SLIC-CAGE quanto o nAnT-iCAGE não são adequados para capturar RNAs menores que 200 BP, pois os protocolos são projetados para remover linkers e artefatos de PCR por meio da exclusão de tamanho com grânulos AMPure XP.
SLIC-CAGE é o único método de resolução de baixo-nucleotídeo de baixa entrada imparcial para mapear sites de início de iniciação de transcrição usando nanogramas de material de RNA total. Os métodos alternativos confiam na atividade de switching do molde da transcriptase reversa ao RNA tampado código de barras em vez do tampão-aprisionamento (por exemplo, NanoCAGE15 e nanopare16). Devido à alternância de modelos, esses métodos exibem vieses específicos de sequência na detecção de Tsss, levando a um número aumentado de Tsss falsos positivos e a números diminuídos de Tsss verdadeiros9,10.

A análise do tampão da expressão de gene (gaiola) é um método usado para o mapeamento genoma-largo da definição do único-nucleotide de locais do começo da transcrição do RNA polymerase II (TSSs)1. Sua natureza quantitativa também permite 5 '-End centric perfil de expressão. As regiões que cercam os Tsss (cerca de 40 BP a montante e a jusante) são promotores centrais e representam o local físico onde o RNA polimerase II e os fatores de transcrição geral se ligam (revistos anteriormente2,3). As informações sobre locais exatos de TSSs podem ser usadas para a descoberta do promotor principal e para monitorar a dinâmica do promotor. Além disso, como potenciadores ativos exibem assinaturas de transcrição bidirecional, os dados CAGE também podem ser usados para descoberta de potenciador e monitoramento da dinâmica do potenciador4. A metodologia CAGE tem aumentado recentemente em popularidade devido à sua ampla aplicação e uso em projetos de pesquisa de alto perfil, como ENCODE5, modencode6e Fantom Projects7. Além, a informação de TSS está provando igualmente ser importante para distinguir o tecido saudável e doente, porque os TSSs doença-específicos podem ser usados para finalidades diagnósticas8.
Mesmo que vários métodos para mapeamento TSS estão disponíveis (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-tampando), nós e outros têm mostrado recentemente que gaiola é o método mais imparcial para capturar TSSs verdadeiro com o menor número de falsos positivos9 , o protocolo 10. The recente da gaiola, NAnT-icage11, é o protocolo o mais imparcial para o perfilamento de TSS, porque evita cortar os fragmentos às etiquetas curtas usando enzimas da limitação e não usa a amplificação do PCR. Uma limitação do protocolo nAnT-iCAGE é a exigência de uma grande quantidade de material de partida (por exemplo, 5 μg de RNA total para cada amostra). Para responder a perguntas específicas, biologicamente relevantes, muitas vezes é impossível obter tais quantidades elevadas de material de partida (por exemplo, para células classificadas por FACS ou estágios embrionários precoces). Finalmente, se nAnT-iCAGE for bem-sucedido, apenas 1-2 ng de material de biblioteca de DNA está disponível a partir de cada amostra, limitando assim a profundidade de sequenciamento alcançável.
Para permitir o perfilamento de TSS usando somente nanogramas do RNA total, nós desenvolvemos recentemente o portador-gaiola10 da super-baixa entrada (SLIC-gaiola, Figura 1). O SLIC-CAGE requer apenas 10 ng de RNA total para obter bibliotecas de alta complexidade. Nosso protocolo confia no portador sintético com cuidado projetado do RNA adicionado ao RNA do interesse para conseguir um total de 5 μg do material do RNA. O portador sintético imita a biblioteca do ADN do alvo na distribuição do comprimento para evitar os vieses potenciais que poderiam ser causados por moléculas homogêneas no excesso. A seqüência do portador é baseada na seqüência do gene da sintetase de leucyl-tRNA de Escherichia coli (tabela 1) para duas razões. Primeiro, qualquer sobra do portador na biblioteca final, mesmo se sequenciado, não mapeará para um genoma eucariótico. Em segundo lugar, como E. coli é uma espécie mesófilos, seus genes do Housekeeping são otimizados para a escala de temperatura apropriada para SLIC-Cage. A seqüência transportadora também é incorporado com sites de reconhecimento de endonuclease homing para permitir a degradação específica do DNA derivado das moléculas de RNA transportadora. O alvo, a biblioteca derivada da amostra permanece intacto, como os locais de reconhecimento de endonuclease homing são longos (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) e estatisticamente improvável de ser encontrado em genomas eucarióticos. Após a degradação específica do portador e a remoção dos fragmentos pela exclusão do tamanho, a biblioteca do alvo é PCR amplificada e pronta para arranjar em seqüência da próxima geração. Dependendo da quantidade inicial de RNA (1-100 ng), espera-se que entre 13-18 ciclos de amplificação de PCR sejam necessários. A quantidade final de DNA por cada amostra varia entre 5-50 ng, produzindo material suficiente para seqüenciamento muito profundo. Ao usar somente 1-2 ng do RNA total, os TSSs verdadeiros podem ser detectados; no entanto, espera-se que as bibliotecas sejam de menor complexidade. Por último, como SLIC-CAGE é baseado no protocolo nAnT-iCAGE11, ele permite a multiplexação de até oito amostras antes do sequenciamento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

A análise do tampão da expressão de gene (gaiola) é um método usado para a deteção da definição do único-nucleotide de locais do começo da transcrição do RNA polymerase II (TSSs). A deteção exata de TSSs realça a identificação e a descoberta de promotores principais. Além disso, potenciadores ativos podem ser detectados através de assinaturas de iniciação de transcrição bidirecional. É descrito aqui um protocolo para executar a portador-gaiola da entrada super-baixa (SLIC-gaiola). Esta adaptação de SLIC do protocolo da gaiola minimiza perdas do RNA artificialmente aumentando a quantidade do RNA com o uso de uma mistura in vitro transcrita do portador do RNA que seja adicionada à amostra do interesse, assim permitindo a preparação da biblioteca do nanogram-quantidades do total RNA (i.e., milhares de células). O portador imita a distribuição esperada do comprimento do fragmento da biblioteca do ADN, eliminando desse modo os vieses que poderiam ser causados pela abundância de um portador homogêneo. Nos últimos estágios do protocolo, o portador é removido com a degradação com endonucleases homing e a biblioteca do alvo é amplificada. A biblioteca-alvo da amostra é protegida da degradação, porque os locais de reconhecimento do endonuclease do homing são longos (entre 18 e 27 BP), fazendo a probabilidade de sua existência nos genomas eucarióticas muito baixos. O resultado final é uma biblioteca de DNA pronta para sequenciamento de próxima geração. Todas as etapas do protocolo, até o seqüenciamento, podem ser concluídas dentro de 6 dias. A preparação do transportador requer um dia de trabalho completo; no entanto, ele pode ser preparado em grandes quantidades e mantido congelado em-80 ° c. Uma vez sequenciado, as leituras podem ser processadas para obter a resolução de nucleotídeo genoma-Wide TSSs. TSSs pode ser usado para a descoberta principal do promotor ou do potenciador, fornecendo a introspecção no Regulamento do gene. Uma vez agregado aos promotores, os dados também podem ser usados para criação de perfil de expressão centrada em 5 '.

Este relato descreve o protocolo completo de SLIC-CAGE para a obtenção de bibliotecas prontas para sequenciamento a partir de nanogramas de material de RNA total inicial (Figura 1). Para obter a mistura sintética do portador do RNA, primeiramente, os moldes do portador do PCR precisam de ser preparados e gel-purified para eliminar produtos laterais do PCR (Figura 2a). Cada molde do PCR (dez no total) é produzido usando um avanço comum, mas uma primeira demão reversa diferente (tabela 2), conduzindo aos comprimentos diferentes do molde do PCR para permitir a variabilidade do tamanho de portadores sintéticos do RNA. Uma vez purificada, os modelos de PCR são utilizados para a transcrição in vitro das moléculas transportadoras. Um único produto portador do RNA é esperado se os moldes são gel-purified (veja a gel-análise representativa na Figura 2b). A preparação do transportador pode ser dimensionada dependendo da necessidade, e quando preparada, misturada e congelada em-80 ° c para uso futuro.
Usando a quantidade mínima recomendada de RNA total da amostra (10 NG) combinada com 16-18 ciclos da amplificação do PCR, as bibliotecas de alta complexidade de SLIC-CAGE podem ser conseguidas. O número de ciclos de PCR necessários para amplificar a biblioteca final depende muito da quantidade de RNA de entrada total utilizada (o número esperado de ciclos é apresentado na tabela 4).
Após a primeira rodada de degradação, nos resultados da qPCR (etapa 17), a diferença esperada entre os valores de TC obtidos com o primer adaptor_f1 ou carrier_f1 é de 1-2, com valores de TC obtidos com adaptor_f1 menor do que com carrier_f1.
A distribuição dos comprimentos dos fragmentos na biblioteca final está entre 200-2.000 BP com o tamanho médio do fragmento de 700-900 BP (baseado na análise da região usando o software de Bioanalyzer, Figura 4B, D). Fragmentos mais curtos, conforme apresentado na figura 4a, C, têm que ser removidos por rodadas adicionais de tamanho-exclusão (etapas 20-21). Estes fragmentos curtos são artefactos da amplificação do PCR e não a biblioteca do alvo. Observe que fragmentos mais curtos se aglomeram melhor nas células de fluxo de seqüenciamento e podem causar problemas de seqüenciamento.
A quantidade esperada de material de biblioteca obtida por amostra é entre 5-50 ng. Quantidades significativamente inferiores são indicativas de perda de amostra durante o protocolo. Se a quantidade baixa obtida for suficiente para seqüenciamento (2-3 ng das bibliotecas agrupadas é necessária), as bibliotecas podem ser de menor complexidade (veja abaixo).
Dependendo da máquina de sequenciamento, a quantidade da biblioteca carregada na célula de fluxo pode precisar ser otimizada. Usando um Illumina HiSeq 2500, carregando 8-12 pM SLIC-CAGE bibliotecas dá em média 150-200 milhões de leituras, com > 80% de leituras passando Pontuação de qualidade p30 como limiar.
As leituras obtidas são então mapeadas para o genoma de referência [para leituras de 50 BP, Bowtie212 podem ser usadas com parâmetros padrão que permitem desencontros zero por sequência de semente (22 BP)]. As eficiências de mapeamento esperadas dependem da quantidade total de entrada de RNA e são apresentadas na tabela 5. As leituras mapeadas exclusivamente podem ser carregadas no ambiente de computação gráfica e estatística R13 e processadas usando Cager (pacote BioConductor14). A vinheta de pacote é fácil de seguir e explica o fluxo de trabalho e o processamento dos dados mapeados em detalhes. Um controle visual fácil da complexidade da biblioteca é a distribuição da largura do promotor, já que as bibliotecas de baixa complexidade terão promotores artificialmente estreitos (Figura 5a, biblioteca SLIC-Cage derivada de 1 ng do RNA total, para detalhes ver Publicação10). No entanto, mesmo as bibliotecas SLIC-CAGE de baixa complexidade permitem a identificação de CTSSs verdadeiros, com maior precisão do que métodos alternativos para mapeamento de TSS de baixa/média entrada (Figura 5b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> Figura 1: Passos no protocolo SLIC-Cage. O RNA da amostra é misturado com a mistura do portador do RNA para conseguir 5 μg do material total do RNA. o cDNA é sintetizado através da transcrição reversa e o tampão é oxidado usando o periodate do sódio. A oxidação permite o acessório da biotina à tampa usando a hidrazida da biotina. A biotina fica presa à extremidade 3 ′ do mRNA, pois também é oxidada usando periodato de sódio. Para eliminar a biotina de mRNA: híbrido de cDNA com o cDNA incompletamente sintetizado e das extremidades 3 do ′ de mRNA, as amostras são tratadas com o cDNA de RNase I. que alcangou a extremidade 5 do ′ de mRNA é selecionada então pela purificação da afinidade em grânulos magnéticos do estreptavidina ( Cap-trapping). Após a liberação de cDNA, 5 ′-e 3 '-linkers são ligated. As moléculas da biblioteca que se originam do portador são degradadas usando I-SceI e I-CeuI homing endonucleases e os fragmentos são removidos usando grânulos magnéticos de SPRI. A biblioteca é então PCR amplificada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Figura 2: gel representativo-análise de moldes do PCR do portador e de transcritos in vitro do portador. (A) moldes do PCR do portador antes da purificação do gel: o primeiro poço contem o marcador de 1 KBP, seguido pelos moldes do PCR do portador 1, 1-10. B) transcrições in vitro do transportador: o primeiro poço contém o marcador de 1 KBP, seguido das transcrições do transportador 1-10. Os transcritos do portador foram desnaturados pelo aquecimento por 5 minutos em 95 ° c antes do carregamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Figura 3: traço de qualidade de DNA representativo (chip de DNA de alta sensibilidade) de SLIC-Cage antes da primeira rodada de degradação do portador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Figura 4: traços de qualidade de DNA representativo (chip de DNA de alta sensibilidade) de bibliotecas de SLIC-Cage após amplificação de PCR. (A) biblioteca SLIC-Cage que requer seleção de tamanho adicional para remoção de fragmentos curtos. (B) biblioteca da SLIC-gaiola após o tamanho-seleção usando grânulos de 0.6 x SPRI à relação da amostra. (C) SLIC-Cage biblioteca de menor quantidade de saída que requer tamanho-seleção para a remoção de fragmento curto. (D) SLIC-Cage biblioteca de menor quantidade de saída após o tamanho-seleção usando 0.6:1 SPRI contas para a razão da amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Figura 5: Validação de bibliotecas SLIC-Cage. (A) distribuição de larguras de interquantil de agrupamento de Tags em bibliotecas de SLIC-Cage preparadas a partir de 1, 5, ou 10 ng de RNA total de s. cerevisiae e na biblioteca NAnT-icage preparada a partir de 5 μg de RNA total de s. cerevisiae . Uma grande quantidade de clusters de tag estreitos na biblioteca 1 ng SLIC-CAGE indica sua baixa complexidade. (B) curvas ROC para identificação de CTSS em bibliotecas de S. cerevisiae SLIC-Cage. Todos os CTSSs do nAnT-iCAGE de S. cerevisiae foram usados como um jogo verdadeiro. (C) curvas ROC para identificação de CTSS em bibliotecas nanocagem de S. cerevisiae . Todos os CTSSs do nAnT-iCAGE de S. cerevisiae foram usados como um jogo verdadeiro. A comparação de curvas de ROC mostra que SLIC-CAGE supera fortemente nanoCAGE na identificação de CTSS. Foram utilizados dados de ArrayExpress E-MTAB-6519. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: sequência do gene sintético portador. Sites i-SCEI são ousados e em itálico em roxo, e i-ceui reconhecimentos locais são verdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transportadora</td>
			<td colspan="2">primer reverso 5 '-3 '</td>
			<td>Comprimento do produto do PCR/BP</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* Primer forward é o mesmo para todos os modelos de transportadora. Sublinhado é a sequência de promotor T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: primers para amplificação do modelo do portador. Primer forward é o mesmo para todos os modelos de transportadora. Sublinhado é a sequência de promotor T7. PCR_GN5_f1: Taatacgactcactatagnnnnncagcgttcgcta. Usando os primers reversos de deferimento, os moldes do PCR e daqui o portador RNAs do comprimento de deferimento são produzidos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transportadora</td>
			<td>Comprimento</td>
			<td>Não tampado/μg</td>
			<td>tampado/μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8,36</td>
			<td>0,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6,6</td>
			<td>0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3, 8</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2,64</td>
			<td>0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2,2</td>
			<td>0,25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: mistura do portador do RNA. No total 49 μg da mistura transportadora 0,3-1 KBP: sem tampos = 44 μg, tampado = 5 μg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Entrada total do RNA/ng</td>
			<td>Ciclos de PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Número esperado de ciclos do PCR na dependência da entrada total do RNA da amostra. O número aproximado de ciclos é baseado em experimentos realizados com Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster e RNA total de Mus musculus .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Entrada de RNA total/ng</td>
			<td>% geral mapeado</td>
			<td>% mapeados exclusivamente</td>
			<td>% transportadora</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 5: eficiência de mapeamento esperada e na dependência da quantidade total de entrada de RNA. Os números aproximados são apresentados e baseados em experimentos realizados com Saccharomyces cerevisiae e Mus musculus RNA total.

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Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

A análise do tampão da expressão de gene (gaiola) é um método para o mapeamento quantitativo genoma-largo de mRNA 5 ' extremidades para capturar locais do começo da transcrição do RNA polymerase II em uma definição single-nucleotide. Este trabalho descreve um protocolo de baixa entrada (SLIC-CAGE) para a geração de bibliotecas de alta qualidade usando nanograma-quantidades de RNA total.

Transcrição iniciar o mapeamento do site usando super-baixa entrada Carrier-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da regulação genética, pois permite a descoberta do promotor principal e do aprimoramento usando baixas quantidades de material inicial. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o mapeamento de resolução de nucleotídeos únicos, imparcial, em todo o genoma, dos locais de início transcricional RNA polymerase II usando apenas 10 nanogramas de RNA total. A CAGE está provando ser inestimável para descobrir locais de início de transcrição associados a doenças que podem ser usados como marcadores de diagnóstico.O SLIC-CAGE estende essas descobertas para dimensionar amostras como biópsias teciduais. O SLIC-CAGE é ideal para análises de promotores aprofundados e de alta resolução de tipos de células frágeis, incluindo estágios de desenvolvimento embrionários precoces ou tecido embrionário de uma ampla gama de organismos modelo. Como existem inúmeros passos neste protocolo, é crucial minimizar a perda de amostras em cada passo, tomando o cuidado de recuperar o máximo de material possível ao transferir entre tubos.Comece preparando o mix PCR para cada modelo. Combine buffer, dNTPs, primer avançado exclusivo, plasmídeo de modelo com o gene portador sintético e polimerase de fusão de acordo com as instruções do manuscrito. Misture os reagentes por pipeta.Adicione 90 microliters da mistura PCR a 10 microliters de cada primer reverso e misture. Consulte o manuscrito para condições de termociclismo. Realize transcrição reversa ou RT no RNA de interesse.Combine um microliter de primer de transcrição reversa, 10 nanogramas de RNA e 4.990 nanogramas de mistura de portador em um volume total de 10 microliters. Misture por pipetting para cima e para baixo. Aqueça a mistura a 65 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, coloque-a imediatamente no gelo.Prepare a mistura RT de acordo com as instruções do manuscrito e adicione 28 microliters da mistura a 10 microliters de RNA. Misture o conteúdo do tubo por pipeta até ficar homogêneo. Execute RT em um termociclador.Uma vez concluída a transcrição reversa, purifique o produto com contas magnéticas SPRI livres de DNase e RNase. Adicione as contas ao mix RT a uma proporção de volume de 1,8 para uma e misture bem por pipetação. Deixe a mistura ficar em temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, coloque as contas em um suporte magnético e deixe-as separadas por cinco minutos. Descarte o supernascer e adicione 200 microliters de 70% de etanol recém-preparado às contas. Não misture as contas ou retire-as do suporte magnético e remova o etanol imediatamente após a adição.Mantenha o tubo no suporte magnético e remova todos os traços de etanol empurrando quaisquer gotículas restantes para fora com uma pipeta P10. Adicione imediatamente 42 microliters de água, e pipeta para cima e para baixo 60 vezes à amostra elute, tomando cuidado para não causar espuma. Incubar o tubo a 37 graus Celsius por cinco minutos sem a tampa e, em seguida, separar as contas no suporte magnético.Em seguida, transfira o supernatante para um novo conjunto de tubos, tomando o cuidado de recuperar todos os supernasais, mas evitar a transferência de contas. Após o tratamento RNase I, misture 45 microlitadores de amostra com 105 microliters de contas de streptavidina preparadas e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante a incubação, pipete a amostra a cada 10 minutos para misturar.Em seguida, separe as contas no suporte magnético e remova o supernatante. Lave as contas com tampões A, B e C.Começando com tampão A, resuspense as contas em 150 microliters de buffer. Separe no suporte magnético por dois a três minutos e, em seguida, remova o supernatante.Pré-aqueça os buffers B e C a 37 graus Celsius e repita os passos de lavagem. Para remover todo o RNA não tampado, é crucial lavar completamente as contas de streptavidina e as paredes do tubo e remover completamente o tampão de lavagem antes de adicionar o próximo. Para liberar o cDNA, resuspenque as contas em 35 microliters de tampão 1X RNase I e incubar a 95 graus Celsius por cinco minutos.Após a incubação, coloque imediatamente as contas no gelo por dois minutos. Separe as contas em um suporte magnético e transfira o supernatante para um novo conjunto de tubos. Resuspenque as contas em 30 microliters de tampão 1X RNase I e, em seguida, separe em um suporte magnético.Combine o supernatante com o supernascer previamente coletado para um volume total de cerca de 65 microliters. Execute qPCR para determinar o número de ciclos PCR para amplificação da biblioteca de destino. Prepare as misturas mestres qPCR para amplificar bibliotecas inteiras de DNA do portador.Defina condições de termociclismo de acordo com as instruções do manuscrito e amplie a amostra preparada. O protocolo SLIC-CAGE permite obter bibliotecas prontas para sequenciamento a partir de nanogramas de material RNA inicial. O comprimento do fragmento na biblioteca final varia entre 200 e 2.000 pares de base.Fragmentos mais curtos são artefatos PCR e podem causar problemas de sequenciamento na linha. Rodadas adicionais de seleção de tamanho podem ser realizadas para removê-las. Em comparação com o NanoCAGE, o SLIC-CAGE apresenta um desempenho significativamente melhor na identificação do local de início da transcrição, o que é evidente a partir das curvas características operacionais do receptor das duas técnicas realizadas em várias quantidades de RNA total S.cerevisiae.Ao executar este protocolo, é importante ter em mente que a perda de amostras pode levar a bibliotecas de baixa complexidade. Para evitar isso, devem ser utilizadas pontas e tubos de pipeta de baixa ligação. Sem o SLIC-CAGE, a análise do promotor de vários tipos de células até agora tem sido inacessível.Isso inclui a análise de estágios embrionários de desenvolvimento ou tecido embrionário de uma ampla gama de organismos modelo.

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