Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Wellcome Trust (106954), присужденным B. L. и Совету медицинских исследований (MRC) Core Funding (MC-A652-5'A10). Н.К. был поддержан долгосрочным стипендией EMBO (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. была поддержана Советом медицинских исследований Великобритании; B. L. была поддержана Советом медицинских исследований Великобритании (MC UP 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

Был заполнен патент на разлагаемую РНК/ДНК.

Для успешной подготовки библиотеки SLIC-CAGE крайне важно использовать низкосвязные советы и трубки для предотвращения потери образца из-за адсорбции образцов. Во всех шагах, связанных с извлечением супернатанта, рекомендуется восстановить весь объем образца. Поскольку протокол состоит из нескольких этапов, непрерывная потеря выборки приведет к неудачным библиотекам.
Если CAGE (nAnT-iCAGE) не выполняется в обычном режиме, лучше всего протестировать SLIC-CAGE с различными объемами ввода (10 нг, 20 нг, 50 нг, 100 нг, 200 нг) того же общего образца РНК и сравнить с nAnT-iCAGE библиотек, которые готовятся с использованием 5 мкг общей РНК. Если библиотека nAnT-iCAGE не работает (менее 0,5-1 нг из библиотеки ДНК, полученной в образце), SLIC-CAGE вряд ли сработает, и потеря образца должна быть сведена к минимуму.
Важным шагом для обеспечения высококачественных библиотек, лишенных необнаруженной деградированных РНК или РНК, является ловушка крышки, описанная в разделе 7. Очень важно, чтобы стрептавидин бисер тщательно перенапрягается в буферах стирки и чтобы буферы для мытья удаляются до продолжения следующего шага стирки или утилиза кДНК.
Если результаты qPCR после первого раунда деградации носителя не показывают никакой разницы между использованием адаптера и праймеров carrier-f1, продолжение протокола по-прежнему рекомендуется. Если после второго раунда деградации носителей разница в значениях Ct составляет менее пяти, рекомендуется третий раунд деградации носителей. Мы никогда не находили третий раунд деградации необходимо, и если это происходит, рекомендуется заменить самонаводящихся эндонуклеазе запасов.
Дополнительные раунды усиления ПЦР могут быть добавлены в протокол, если окончательная сумма полученной библиотеки недостаточна для секвенирования. Затем усиление ПЦР может быть установлено с минимальным количеством циклов усиления, необходимых для получения достаточного количества материала для секвенирования, с учетом потерь выборки, которых нельзя избежать при выборе размера. Очистка или выбор размера с использованием магнитных бусин SPRI должны быть выполнены до тех пор, пока все небольшие (злт;200 bp) фрагменты удаляются (при необходимости, используйте 0,6:1 шарики для соотношения образца), и библиотека должна быть количественно с помощью Picogreen.
Библиотеки могут быть секвенированы в режиме одноконца или парного конца. С помощью сопряженного секвенирования можно получить информацию о изоформах транскрипта. Кроме того, по мере того, как обратная транскрипция выполняется с помощью случайного грунтовки (TCT-N6,N6, являющихся случайным гексеумером), информация из секвенированных 3'end может быть использована в качестве уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) для сброса дубликатов ПЦР. Поскольку используется умеренное число циклов усиления ПЦР (до 18), использование UMIs ранее было признано ненужным.
Поскольку ядро протокола опирается на nAnT-iCAGE11,SLIC-CAGE использует восемь штрих-кодов. Таким образом, мультиплексирование более восьми образцов в настоящее время не поддерживается. Кроме того, как SLIC-CAGE, так и nAnT-iCAGE не подходят для захвата РНК короче 200 б.п., так как протоколы предназначены для удаления связующих и PCR артефактов путем исключения размера с amPure XP шариками.
SLIC-CAGE является единственным беспристрастным методом однонуклеотидного разрешения с низким уровнем ввода для картирования участков начала транскрипции с использованием нанограммов общего материала РНК. Альтернативные методы опираются на активность переключения шаблонов обратной транскриптазы на штрих-код, ограниченный РНК вместо крышки захвата (например, NanoCAGE15 и NanoPARE16). Из-за переключения шаблонов, эти методы демонстрируют последовательность конкретных предубеждений в обнаружении TSSs, что приводит к увеличению числа ложноположительных TSSs и снижение числа истинных TSSs9,10.

Кап-анализ экспрессии генов (CAGE) является методом, используемым для однонуклеотидного разрешения генома всей картографии РНК-полимераза II транскрипции начала сайтов (TSSs)1. Его количественный характер также позволяет 5'конец ориентированного выражения профилирования. Регионы, окружающие TSSs (около 40 bp вверх и вниз по течению) являются основными промоутеров и представляют физическое местоположение, где РНК-полимераза II и общие факторы транскрипции связывают (рассмотрено ранее2,3). Информация о точном местоположении TSSs может быть использована для обнаружения основных промоутеров и для мониторинга динамики промоутера. Кроме того, в качестве активных усилителей экспонат подписи двунаправленной транскрипции, CAGE данные также могут быть использованы для обнаружения усилителя и мониторинга динамики усилителя4. Методология CAGE в последнее время возросла в популярности благодаря ее широкому применению и использованию в громких исследовательских проектах, таких как ENCODE5,modENCODE6, и FANTOM проектов7. Кроме того, информация TSS также оказывается важным для различения здоровых и больных тканей, таккак специфические для болезней СтС могут быть использованы для диагностических целей 8.
Несмотря на то, что доступно несколько методов картирования TSS (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), мы и другие недавно показали, что CAGE является самым беспристрастным методом захвата истинных TSS с наименьшим количеством ложных срабатываний9 , 10. Недавний протокол CAGE, nAnT-iCAGE11, является самым беспристрастным протоколом для профилирования TSS, так как он позволяет избежать разрезания фрагментов на короткие метки с использованием ферментов ограничения и не использует усиливание ПЦР. Ограничением протокола nAnT-iCAGE является требование к большому количеству исходного материала (например, 5 мкг общей РНК для каждого образца). Чтобы ответить на конкретные, биологически значимые вопросы, часто невозможно получить такое большое количество исходного материала (например, для сортированных FACS клеток или ранних эмбриональных стадиях). Наконец, если nAnT-iCAGE является успешным, только 1-2 нг материала библиотеки ДНК доступна из каждого образца, тем самым ограничивая достижимую глубину секвенирования.
Для того, чтобы TSS профилирования с использованием только нанограммы общей РНК, мы недавно разработали супер-низкий вход Carrier-CAGE10 (SLIC-CAGE, Рисунок 1). SLIC-CAGE требует только 10 нг от общей РНК для получения библиотек высокой сложности. Наш протокол опирается на тщательно разработанный синтетический РНК-носитель, добавленный в РНК, представляющий интерес для достижения в общей сложности 5 мкг МАТЕРИАЛА РНК. Синтетический носитель имитирует библиотеку ДНК-мишени в распределении длины, чтобы избежать потенциальных предубеждений, которые могут быть вызваны однородными молекулами в избытке. Последовательность носителя основана на последовательности гена синтеза Escherichia coli leucyl-tRNA(Таблица 1) по двум причинам. Во-первых, любые остатки носителя в окончательной библиотеке, даже если они секвенированы, не будут отображаться на эукариотический геном. Во-вторых, поскольку кишечная палочка является мезофильной вид, ее гены домашнего хозяйства оптимизированы для температурного диапазона, подходящего для SLIC-CAGE. Последовательность носителя также встроена с местами распознавания самонаводящихся эндонуклеазы, чтобы позволить специфическую деградацию ДНК, полученной из молекул РНК-носителя. Целевая библиотека, полученная из образца, остается нетронутой, так как места распознавания самонаводящихся эндонуклеаза являются длинными (I-CeuI - 27 bp; I-SceI 18 bp) и статистически вряд ли можно найти в эукариотических геномах. После специфической деградации носителя и удаления фрагментов по исключению размера, целевая библиотека усиливается пЦР и готова к секвенированию следующего поколения. В зависимости от стартовой суммы РНК (1-100 нг), ожидается, что потребуется 13-18 циклов усиления ПЦР. Окончательное количество ДНК на каждый образец колеблется между 5-50 нг, что дает достаточно материала для очень глубокого секвенирования. При использовании только 1-2 нг от общего ОБЪЕМА РНК, истинные TSSs могут быть обнаружены; однако ожидается, что библиотеки будут более сложными. Наконец, поскольку SLIC-CAGE основан на протоколе nAnT-iCAGE11,он позволяет мультиплексировать до восьми образцов до секвенирования.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

Анализ пределов экспрессии генов (CAGE) является методом, используемым для однонуклеотидного разрешения обнаружения РНК-полимераза II транскрипции сайтов (TSSs). Точное обнаружение TSS s улучшает идентификацию и обнаружение основных промоутеров. Кроме того, активные усилители могут быть обнаружены с помощью подписей двунаправленной инициации транскрипции. Описан очеркнутый здесь протокол для выполнения супер-низкого ввода перевозчика-CAGE (SLIC-CAGE). Эта SLIC адаптация протокола CAGE минимизирует потери РНК за счет искусственного увеличения количества РНК за счет использования транскрибированной РНК-микси инкрустированной РНК, которая добавляется в образец интереса, что позволяет библиотеке подготовку из нанограмм-суммы общего РНК (т.е. тысячи клеток). Перевозчик имитирует ожидаемое распределение длины фрагмента БИБЛИОТЕКи ДНК, тем самым устраняя предубеждения, которые могут быть вызваны обилием однородного носителя. На последних этапах протокола, перевозчик удаляется путем деградации с самонаводящимися эндонуклеазами и целевой библиотекой усиливается. Целевая библиотека образца защищена от деградации, так как места распознавания самонаводящихся эндонуклеазы длинные (между 18 и 27 б.п.), что делает вероятность их существования в эукариотических геномах очень низкой. Конечным результатом является библиотека ДНК, готовая к секвенированию следующего поколения. Все этапы протокола, вплоть до секвенирования, могут быть выполнены в течение 6 дней. Подготовка перевозчика требует полного рабочего дня; однако, он может быть подготовлен в больших количествах и храниться в замороженном состоянии при -80 градусах Цельсия. После секвенирования, считываний могут быть обработаны для получения генома всей однонуклеотидной резолюции TSSs. TSSs могут быть использованы для основного промотора или повышения открытия, обеспечивая понимание регуляции генов. После агрегирования в промоутеры данные также могут быть использованы для профилирования 5'centric выражения.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Анализ экспрессии генов (CAGE) является методом для генома всей количественного картирования мРНК 5'ends для захвата РНК-полимераза II транскрипции начала сайтов с разрешением одного нуклеотида. Эта работа описывает протокол с низким уровнем ввода (SLIC-CAGE) для генерации высококачественных библиотек с использованием нанограммобщего объема РНК.

Транскрипция Запуск сайта Картирование С использованием супер-низкий вход Перевозчик-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регуляции генов, так как он позволяет основной промоутер и усилитель открытие с использованием низкого количества исходного материала. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет объективно, генома всей одного нуклеотидного разрешения отображение РНК полимеразы II транскрипционных стартовых сайтов, используя только 10 нанограммов общей РНК. CAGE оказывается бесценным для раскрытия связанных с болезнью сайтов начала транскрипции, которые могут быть использованы в качестве диагностических маркеров.SLIC-CAGE расширяет эти открытия для масштабирования образцов, таких как биопсия тканей. SLIC-CAGE идеально подходит для углубленного и высокого разрешения промоутерского анализа хрупких типов клеток, включая ранние эмбриональные стадии развития или эмбриональные ткани из широкого спектра модельных организмов. Поскольку в этом протоколе есть множество шагов, крайне важно свести к минимуму потерю выборки на каждом шагу, заботясь о том, чтобы получить как можно больше материала при передаче между трубами.Начните с подготовки смеси PCR для каждого шаблона. Объедините буфер, dNTPs, уникальный форвард грунтовки, шаблон плазмид с синтетическим геном перевозчика, и синтез полимеразы в соответствии с рукописными направлениями. Смешайте реагенты с помощью труб.Добавьте 90 микролитров смеси ПЦР в 10 микролитров каждой реверсной грунтовки и перемешайте. Обратитесь к рукописи для термоциклических условий. Выполните обратную транскрипцию или RT на РНК интереса.Объедините один микролитр грунтовки обратной транскрипции, 10 нанограммОВ РНК и 4 990 нанограммов несущей смеси общим объемом 10 микролитров. Смешайте по трубе вверх и вниз. Нагрейте смесь до 65 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем сразу же поместите его на лед.Подготовьте смесь RT в соответствии с рукописными указаниями и добавьте 28 микролитров смеси в 10 микролитров РНК. Смешайте содержимое трубки путем пипетки до однородной. Запустите RT в термоциклере.После завершения обратной транскрипции очистите продукт магнитными бусинками DNase и RNase SPRI. Добавить бисер в смесь RT при соотношении громкости 1,8 к одному и хорошо перемешать с помощью пипетки. Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение пяти минут.Затем поместите шарики на магнитную подтяготу и дайте им отделиться в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте в бисер 200 микролитров свежеприготовленного 70%этанола. Не смешивайте бисер или снимите их с магнитного стенда и удалите этанол сразу после добавления.Держите трубку на магнитной подготе и удалите все следы этанола, выталкивая оставшиеся капли с помощью пипетки P10. Немедленно добавьте 42 микролитров воды, и пипетки вверх и вниз 60 раз, чтобы elute образца, заботясь, чтобы не вызвать вспенивание. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут без крышки, а затем отделить шарики на магнитной подгоде.Затем перенесите супернатант в новый набор трубок, заботясь о том, чтобы получить все супернатанты, но избегайте переноса бисера. После лечения RNase I смешайте 45 микролитров образца со 105 микролитров подготовленных стриптавидиновых бусин и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время инкубации, пипетка образца каждые 10 минут, чтобы смешать.Затем разделим шарики на магнитной подгоке и удалите супернатант. Вымойте бусины буферами A, B и C.Starting с буфером A, повторно помесив бисер в 150 микролитров буфера. Разделить на магнитную подстоять на две-три минуты, а затем удалить супернатант.Разогреть буферы B и C до 37 градусов по Цельсию и повторить шаги мытья. Чтобы удалить все неохвачатые РНК, очень важно тщательно промыть стрептавидин бусы и стенки трубки и полностью удалить буфер мытья перед добавлением следующего. Чтобы освободить cDNA, повторно использовать бисер в 35 микролитров 1X RNase I буфера и инкубировать при 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут.После инкубации сразу же поместите бисер на лед на две минуты. Раздели шарики на магнитном стенде и перенесите супернатант на новый набор трубок. Повторное посовещение бисера в 30 микролитров буфера 1X RNase I, а затем отделить на магнитной подготе.Объедините супернатант с ранее собранным супернатантом общим объемом около 65 микролитров. Выполните qPCR, чтобы определить количество циклов ПЦР для усиления целевой библиотеки. Подготовь мастер-миксы qPCR для усиления целых библиотек ДНК от носителя.Установите условия термоцикла в соответствии с рукописными указаниями и усилите подготовленный образец. Протокол SLIC-CAGE позволяет получать библиотеки, готовые к секвенированию, из нанограммов исходного РНК-материала. Длина фрагмента в окончательной библиотеке колеблется от 200 до 2000 базовых пар.Более короткие фрагменты являются артефактами ПЦР и могут вызвать проблемы с секвенированием вниз по линии. Дополнительные раунды выбора размера могут быть выполнены, чтобы удалить их. По сравнению с NanoCAGE, SLIC-CAGE демонстрирует значительно лучшую производительность при идентификации места начала транскрипции, что видно из приемника операционных характерных кривых двух методов, выполненных в различных количествах общей РНК S.cerevisiae.При выполнении этого протокола важно иметь в виду, что потеря выборки может привести к низкой сложности библиотек. Чтобы предотвратить это, необходимо использовать низкооплетающие пипетки и трубки. Без SLIC-CAGE промоутерный анализ различных типов клеток до сих пор был недоступен.Это включает анализ эмбриональных стадий развития или эмбриональной ткани из широкого спектра модельных организмов.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Анализ терминации транскрипции с помощью BrUTP прядей специфичную Транскрипция выбега (TRO) подход

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Дискриминация и картирование первичных и обработанных стенограмм в митохондрии кукурузы с использованием круговой стратегии на основе РТ-ПЦР

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...