Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
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Este trabajo fue apoyado por la subvención Wellcome Trust (106954) otorgada a B. L. y Medical Research Council (MRC) Core Funding (MC-A652-5QA10). N. C. fue apoyado por EMBO Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. contó con el apoyo del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido; B. L. contó con el apoyo del Medical Research Council UK (MC UP 1102/1).

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

Se ha llenado una patente para ARN/ADN portador degradable.

Para preparaciones exitosas de la biblioteca SLIC-CAGE, es fundamental utilizar puntas y tubos de baja unión para evitar la pérdida de muestras debido a la adsorción de muestras. En todos los pasos que implican la recuperación del sobrenadante, se recomienda recuperar todo el volumen de muestra. Como el protocolo tiene varios pasos, la pérdida continua de muestras dará lugar a bibliotecas sin éxito.
Si CAGE (nAnT-iCAGE) no se ha realizado de forma rutinaria, lo mejor es probar SLIC-CAGE con diferentes cantidades de entrada (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) de la misma muestra total de ARN y compararlo con las bibliotecas nAnT-iCAGE que se preparan utilizando 5 g de ARN total. Si la biblioteca nAnT-iCAGE no tiene éxito (menos de 0,5-1 ng de la biblioteca de ADN obtenida por muestra), es poco probable que SLIC-CAGE funcione y que la pérdida de muestra sin batería deba minimizarse.
Un paso crítico para garantizar bibliotecas de alta calidad carentes de ARN degradado o ARNm sin acoto es el taponamiento de tapa descrito en la sección 7. Es muy importante que las perlas de estreptavidina se resuspendan a fondo en los tampones de lavado y que los tampones de lavado se retiren antes de continuar con el siguiente paso de lavado o la elución del ADNC.
Si los resultados del qPCR después de la primera ronda de degradación de portadora no muestran ninguna diferencia entre el uso de las imprimaciones adaptor_f1 y carrier_f1, se sigue recomendando continuar con el protocolo. Si después de la segunda ronda de degradación de portadora, la diferencia en los valores ct es inferior a cinco, se recomienda una tercera ronda de degradación de portadora. Nunca hemos encontrado una tercera ronda de degradación necesaria, y si se produce, se recomienda reemplazar las poblaciones de endonucleasa homing.
Se pueden añadir rondas adicionales de amplificación de PCR al protocolo si la cantidad final de la biblioteca obtenida no es suficiente para la secuenciación. La amplificación de PCR se puede ajustar con un número mínimo de ciclos de amplificación necesarios para producir suficiente material para la secuenciación, teniendo en cuenta la pérdida de muestra que no se puede evitar en la selección de tamaño. La purificación o selección de tamaño utilizando perlas magnéticas SPRI debe realizarse hasta que se eliminen todos los fragmentos pequeños (<200 bp) (si es necesario, utilice 0.6:1 perlas a la relación de muestra), y la biblioteca debe cuantificarse con Picogreen.
Las bibliotecas se pueden secuenciar en modo de extremo único o de extremo emparejado. Mediante la secuenciación de extremo emparejado, se puede obtener información sobre isoformas de transcripción. Además, como la transcripción inversa se realiza utilizando una imprimación aleatoria (TCT-N6, N6 siendo un hexamer aleatorio), la información del 3'-end secuenciado se puede utilizar como identificadores moleculares únicos (UMI) para contraer duplicados de PCR. Como se utiliza un número moderado de ciclos de amplificación de PCR (hasta 18), el uso de UMI se ha encontrado previamente innecesario.
Como el núcleo del protocolo se basa en nAnT-iCAGE11, SLIC-CAGE utiliza ocho códigos de barras. Por lo tanto, actualmente no se admite la multiplexación de más de ocho muestras. Además, tanto SLIC-CAGE como nAnT-iCAGE no son adecuados para capturar ARN inferiores a 200 bp, ya que los protocolos están diseñados para eliminar los enlaceres y artefactos PCR mediante la exclusión de tamaño con perlas AMPure XP.
SLIC-CAGE es el único método de resolución de un solo nucleótido de entrada baja imparcial para mapear los sitios de inicio de inicio de transcripción utilizando nanogramos de material de ARN total. Los métodos alternativos se basan en la actividad de conmutación de plantillas de la transcriptasa inversa al ARN tapado de código de barras en lugar de a la captura de tapa (por ejemplo, NanoCAGE15 y NanoPARE16). Debido a la conmutación de plantillas, estos métodos presentan sesgos específicos de la secuencia en la detección de TSS, lo que conduce a un mayor número de TSS falsos positivos y disminución del número de TSSs9,10.

El análisis de la tapa de la expresión génica (CAGE) es un método utilizado para el mapeo de resolución de un solo nucleótido en todo el genoma de los sitios de inicio de transcripción de ARN polimerasa II (TSSs)1. Su naturaleza cuantitativa también permite la generación de perfiles de expresión centrada de 5'-end. Las regiones que rodean los TSS (alrededor de 40 bp aguas arriba y aguas abajo) son promotores principales y representan la ubicación física donde el ARN polimerasa II y los factores de transcripción general se unen (revisado previamente2,3). La información sobre las ubicaciones exactas de los TSS se puede utilizar para el descubrimiento del promotor principal y para supervisar la dinámica del promotor. Además, a medida que los potenciadores activos exhiben firmas de transcripción bidireccional,los datos CAGE también se pueden utilizar para el descubrimiento de potenciadores y la supervisión de la dinámica del potenciador 4. La metodología CAGE ha aumentado recientemente en popularidad debido a su amplia aplicacióny uso en proyectos de investigación de alto perfil como ENCODE 5, modENCODE6y proyectos FANTOM7. Además, la información del SST también está demostrando ser importante para distinguir el tejido sanoy enfermo, ya que los TSS específicos de la enfermedad pueden utilizarse con fines de diagnóstico 8.
A pesar de que hay varios métodos para la asignación de TSS disponibles (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), nosotros y otros hemos demostrado recientemente que CAGE es el método más imparcial para capturar verdaderos TSS con el menor número de falsos positivos9 , 10. El protocolo CAGE reciente, nAnT-iCAGE11, es el protocolo más imparcial para la generación de perfiles TSS, ya que evita cortar los fragmentos a etiquetas cortas utilizando enzimas de restricción y no utiliza amplificación de PCR. Una limitación del protocolo nAnT-iCAGE es el requisito de una gran cantidad de material de partida (por ejemplo, 5 g de ARN total para cada muestra). Para responder a preguntas específicas y biológicamente relevantes, a menudo es imposible obtener cantidades tan altas de material de partida (por ejemplo, para células clasificadas con FACS o etapas embrionarias tempranas). Por último, si nAnT-iCAGE tiene éxito, solo 1-2 ng de material de la biblioteca de ADN está disponible en cada muestra, lo que limita la profundidad de secuenciación alcanzable.
Para permitir el perfilado TSS utilizando sólo nanogramos de ARN total, recientemente hemos desarrollado Super-low Input Carrier-CAGE10 (SLIC-CAGE, Figura 1). SLIC-CAGE requiere sólo 10 ng de ARN total para obtener bibliotecas de alta complejidad. Nuestro protocolo se basa en el portador de ARN sintético cuidadosamente diseñado añadido al ARN de interés para lograr un total de 5 g de material de ARN. El portador sintético imita la biblioteca de ADN objetivo en la distribución de la longitud para evitar posibles sesgos que podrían ser causados por moléculas homogéneas en exceso. La secuencia del portador se basa en la secuencia del gen Escherichia coli leucyl-tRNA sintetasa (Tabla 1) por dos razones. En primer lugar, cualquier resto del portador en la biblioteca final, incluso si se secuencia, no se asignará a un genoma eucariota. En segundo lugar, como E. coli es una especie mesofílica, sus genes de limpieza están optimizados para el rango de temperatura adecuado para SLIC-CAGE. La secuencia portadora también está integrada con sitios de reconocimiento de endonucleasa de homing para permitir la degradación específica del ADN derivado de las moléculas de ARN portadora. La biblioteca de destino derivada de la muestra permanece intacta, ya que los sitios de reconocimiento de endonucleasa de homing son largos (I-CeuI a 27 bp; I-SceI a 18 bp) y estadísticamente poco probable que se encuentre en los genomas eucariotas. Después de la degradación específica del portador y la eliminación de fragmentos por exclusión de tamaño, la biblioteca de destino se amplifica y está lista para la secuenciación de próxima generación. Dependiendo de la cantidad de ARN inicial (1-100 ng), se espera que se requieran entre 13-18 ciclos de amplificación de PCR. La cantidad final de ADN por cada muestra oscila entre 5-50 ng, produciendo suficiente material para una secuenciación muy profunda. Cuando se utiliza sólo 1-2 ng de ARN total, se pueden detectar Verdaderos SST; sin embargo, se espera que las bibliotecas sean de menor complejidad. Por último, como SLIC-CAGE se basa en el protocolo nAnT-iCAGE11, permite la multiplexación de hasta ocho muestras antes de la secuenciación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

El análisis de la tapa de la expresión génica (CAGE) es un método utilizado para la detección de resolución de un solo nucleótido de los sitios de inicio de transcripción de ARN polimerasa II (TSS). La detección precisa de TSS mejora la identificación y el descubrimiento de los promotores principales. Además, los potenciadores activos se pueden detectar a través de firmas de iniciación de transcripción bidireccional. Aquí se describe un protocolo para realizar la portadora de entrada súper baja-CAGE (SLIC-CAGE). Esta adaptación SLIC del protocolo CAGE minimiza las pérdidas de ARN aumentando artificialmente la cantidad de ARN mediante el uso de una mezcla de portadoras de ARN transcrita in vitro que se añade a la muestra de interés, permitiendo así la preparación de la biblioteca a partir de nanogramos-cantidades de total ARN (es decir, miles de células). El portador imita la distribución esperada de la longitud del fragmento de la biblioteca de ADN, eliminando así los sesgos que podrían ser causados por la abundancia de un portador homogéneo. En las últimas etapas del protocolo, el portador se elimina a través de la degradación con endonucleases homing y la biblioteca de destino se amplifica. La biblioteca de muestras objetivo está protegida contra la degradación, ya que los sitios de reconocimiento de endonucleasa homing son largos (entre 18 y 27 bp), lo que hace que la probabilidad de su existencia en los genomas eucariotas sea muy baja. El resultado final es una biblioteca de ADN lista para la secuenciación de próxima generación. Todos los pasos en el protocolo, hasta la secuenciación, se pueden completar dentro de 6 días. La preparación del portaaviones requiere un día de trabajo completo; sin embargo, se puede preparar en grandes cantidades y mantenerse congelado a -80 oC. Una vez secuenciadas, las lecturas se pueden procesar para obtener TSS de resolución de nucleótidos de un solo nucleótido para todo el genoma. Una vez agregados a los promotores, los datos también se pueden utilizar para la generación de perfiles de expresiones centrada en 5'.

Este informe describe el protocolo SLIC-CAGE completo para obtener bibliotecas listas para secuenciación a partir de nanogramos de material de ARN total inicial (Figura1). Para obtener la mezcla de portadoras de ARN sintético, en primer lugar, las plantillas portadoras de PCR deben prepararse y purificarse en gel para eliminar los productos secundarios de PCR (Figura2A). Cada plantilla de PCR (diez en total) se produce utilizando unaimprimación directa común, pero una imprimación inversa diferente (Tabla 2), que conduce a diferentes longitudes de la plantilla de PCR para permitir la variabilidad del tamaño de los portadores de ARN sintéticos. Una vez purificadas, las plantillas de PCR se utilizan para la transcripción in vitro de las moléculas portadoras. Se espera un único producto portador de ARN si las plantillas están purificadas en gel (ver análisis de gel representativo en la Figura 2B). La preparación del portador se puede ampliar dependiendo de la necesidad, y cuando se prepara, se mezcla y se congela a -80 oC para su uso futuro.
Utilizando la cantidad mínima recomendada de ARN total de muestra (10 ng) combinado con 16-18 ciclos de amplificación de PCR, se pueden lograr bibliotecas SLIC-CAGE de alta complejidad. El número de ciclos de PCR necesarios para amplificar la biblioteca final depende en gran medida de la cantidad de ARN de entrada total utilizado (el número esperado de ciclos se presenta en el Cuadro 4).
Después de la primera ronda de degradación, en los resultados qPCR (paso 17), la diferencia esperada entre los valores Ct obtenidos mediante la imprimación adaptor_f1 o carrier_f1 es 1-2, con valores Ct obtenidos con adaptor_f1 inferior que con carrier_f1.
La distribución de las longitudes de los fragmentos en la biblioteca final es de entre 200-2.000 bp con el tamaño medio del fragmento de 700-900 bp (basado en el análisis de la región utilizando el software Bioanalyzer, Figura 4B,D). Los fragmentos más cortos, tal como se presentan en la Figura 4A,C, deben eliminarse mediante rondas adicionales de exclusión de tamaño (pasos 20-21). Estos fragmentos cortos son artefactos de amplificación de PCR y no la biblioteca de destino. Tenga en cuenta que los fragmentos más cortos se agrupan mejor en las celdas de flujo de secuenciación y pueden causar problemas de secuenciación.
La cantidad esperada de material de biblioteca obtenido por muestra está entre 5-50 ng. Las cantidades significativamente más bajas son indicativas de la pérdida de muestra durante el protocolo. Si la cantidad baja obtenida es suficiente para la secuenciación (se necesitan 2-3 ng de las bibliotecas agrupadas), las bibliotecas pueden ser de menor complejidad (véase más adelante).
Dependiendo de la máquina de secuenciación, es posible que sea necesario optimizar la cantidad de la biblioteca cargada en la celda de flujo. Utilizando un Illumina HiSeq 2500, la carga de bibliotecas SLIC-CAGE de 8-12 pM da en promedio 150-200 millones de lecturas, con >80% de las lecturas pasando la puntuación de calidad Q30 como umbral.
Las lecturas obtenidas se asignan al genoma de referencia [para lecturas de 50 bp, Bowtie212 se puede utilizar con parámetros predeterminados que permiten cero desajustes por secuencia de semillas (22 bp)]. Las eficiencias de mapeo esperadas dependen de la cantidad total de entrada de ARN y se presentan en el Cuadro5. Las lecturas de mapa único se pueden cargar en el entorno de computación gráfica y estadística de R13 y procesarse utilizando CAGEr (paquete Bioconductor14). La viñeta del paquete es fácil de seguir y explica el flujo de trabajo y el procesamiento de los datos asignados en detalle. Un fácil control visual de la complejidad de la biblioteca es la distribución del ancho del promotor, ya que las bibliotecas de baja complejidad tendrán promotores artificialmente estrechos (Figura5A,Biblioteca SLIC-CAGE derivada de 1 ng de ARN total, para más detalles ver publicación10). Sin embargo, incluso las bibliotecas SLIC-CAGE de baja complejidad permiten la identificación de verdaderos CTSS,con mayor precisión que los métodos alternativos para la asignación TSS de entrada baja/media (Figura 5B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> Figura 1: Pasos en el protocolo SLIC-CAGE. El ARN de muestra se mezcla con la mezcla portadora de ARN para lograr 5 g de material de ARN total. el ADNc se sintetiza a través de la transcripción inversa y la tapa se oxida mediante el periodato de sodio. La oxidación permite la unión de la biotina a la tapa utilizando hidrida de biotina. La biotina se une al extremo de 3o del ARNm, ya que también se oxida con periodoato de sodio. Para eliminar la biotina de los híbridos mRNA:cDNA con ADNc sintetizado incompletamente y de los extremos de 3o de ARNm, las muestras se tratan con RNase I. cDNA que alcanzó el extremo de 5o de ARNm es seleccionado por purificación de afinidad en cuentas magnéticas de streptavidina ( captura de la tapa). Después de la liberación de cDNA, se ligan los enlaces de 5 y 3o. Las moléculas de la biblioteca que se originan en el portador se degradan utilizando endonucleaseas I-SceI e I-CeuI y los fragmentos se eliminan utilizando perlas magnéticas SPRI. La biblioteca se amplifica entonces PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Figura 2: Análisis en gel representativo de las plantillas de PCR portadoras y transcripciones in vitro portadoras. (A) Plantillas de PCR portadoras antes de la purificación de gel: el primer pozo contiene el marcador de 1 kbp, seguido de las plantillas de PCR portadoras 1, 1-10. (B) Transcripciones in vitro del transportista: el primer pozo contiene el marcador de 1 kbp, seguido de las transcripciones del portador 1-10. Las transcripciones portadoras fueron desnaturalizadas por calentamiento durante 5 minutos a 95 oC antes de la carga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Figura 3: Calidad representativa del ADN (chip de ADN de alta sensibilidad) rastro de SLIC-CAGE antes de la primera ronda de degradación portadora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Figura 4: Rastros representativos de calidad de ADN (chip de ADN de alta sensibilidad) de las bibliotecas SLIC-CAGE después de la amplificación de PCR. (A) Biblioteca SLIC-CAGE que requiere selección de tamaño adicional para la eliminación de fragmentos cortos. (B) Biblioteca SLIC-CAGE después de la selección del tamaño utilizando 0,6 x perlas SPRI a la relación de muestra. (C) Biblioteca SLIC-CAGE de menor cantidad de salida que requiere selección de tamaño para la eliminación de fragmentocorto. (D) Biblioteca SLIC-CAGE de menor cantidad de salida después de la selección de tamaño utilizando 0.6:1 SPRI perlas a la relación de muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Figura 5: Validación de bibliotecas SLIC-CAGE. (A) Distribución de anchos interdirequisitos de clúster de etiquetas en bibliotecas SLIC-CAGE preparadas a partir de 1, 5 o 10 ng de ARN total de S. cerevisiae, y en la biblioteca nAnT-iCAGE preparada a partir de 5 g de ARN total de S. cerevisiae. Una gran cantidad de clústeres de etiquetas estrechas en la biblioteca SLIC-CAGE de 1 ng indica su baja complejidad. (B) curvas ROC para la identificación CTSS en bibliotecas S. cerevisiae SLIC-CAGE. Todos los CTSS de S. cerevisiae nAnT-iCAGE se utilizaron como un verdadero conjunto. (C) curvas ROC para la identificación CTSS en bibliotecas de NanoCAGE de S. cerevisiae. Todos los CTSS de S. cerevisiae nAnT-iCAGE se utilizaron como un verdadero conjunto. La comparación de las curvas ROC muestra que SLIC-CAGE supera fuertemente a nanoCAGE en la identificación de CTSS. Se utilizaron datos de ArrayExpress E-MTAB-6519. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Secuencia del gen sintético portador. Los sitios de I-SceI son negritas y cursivas en púrpura, y los sitios de reconocimientos I-CeuI son verdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Portador</td>
			<td colspan="2">imprimación inversa 5'-3'</td>
			<td>Longitud del producto PCR / bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNNGCCGTCGATAACTTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTAACAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNNACCGCCGCCTCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* La imprimación delantera es la misma para todas las plantillas de portadora. Se subraya la secuencia del promotor T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Primers para amplificación de la plantilla portadora. La imprimación directa es la misma para todas las plantillas de portadora. Se subraya la secuencia del promotor T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA. Utilizando imprimaciones inversas diferentes, se producen plantillas de PCR y, por lo tanto, ARN portadoras de diferente longitud.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Portador</td>
			<td>Longitud</td>
			<td>sin tapar/g</td>
			<td>tapado/g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8.36</td>
			<td>0.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3.08</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2.64</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2.2</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Mezcla portadora de ARN. En total 49 g de la mezcla portadora 0,3-1 kbp: sin tapar a 44 g, con un límite de 5 g.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Entrada total de ARN /ng</td>
			<td>Ciclos de PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>Cuadro 4: Número esperado de ciclos de PCR en dependencia de la entrada total de ARN de la muestra. El número aproximado de ciclos se basa en experimentos realizados con Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster y ARN total de Mus musculus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Entrada total de ARN/ng</td>
			<td>% mapa general</td>
			<td>% de mapa único</td>
			<td>% portador</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 5: Eficiencia cartográfico esperada y en dependencia de la cantidad total de entrada de ARN. Los números aproximados se presentan y se basan en experimentos realizados con Saccharomyces cerevisiae y MUS musculus ARN total.

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Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Cap Analysis of Gene Expression (CAGE) es un método para la cartografía cuantitativa de los extremos de mRNA 5 para capturar sitios de inicio de transcripción de ARN polimerasa II con una resolución de un solo nucleótido. Este trabajo describe un protocolo de baja entrada (SLIC-CAGE) para la generación de bibliotecas de alta calidad utilizando nanogramos-cantidades de ARN total.

Transcripción Iniciar asignación de sitios usando portadora de entrada súper baja-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación genética, ya que permite el descubrimiento del promotor principal y potenciador utilizando cantidades bajas de material de partida. La principal ventaja de esta técnica es que permite un mapeo imparcial de resolución de nucleótido único en todo el genoma de los sitios de inicio transcripcional de ARN polimerasa II utilizando sólo 10 nanogramos de ARN total. CAGE está demostrando ser invaluable para descubrir sitios de inicio de transcripción asociados a la enfermedad que se pueden utilizar como marcadores de diagnóstico.SLIC-CAGE extiende estos descubrimientos para escalar muestras como biopsias de tejido. SLIC-CAGE es ideal para el análisis promotor en profundidad y de alta resolución de tipos de células frágiles, incluidas las primeras etapas del desarrollo embrionario o el tejido embrionario de una amplia gama de organismos modelo. Dado que hay numerosos pasos en este protocolo, es crucial minimizar la pérdida de muestra en cada paso teniendo cuidado de recuperar tanto material como sea posible al transferir entre tubos.Comience preparando la mezcla de PCR para cada plantilla. Combine buffer, dNTP, imprimación delantera única, plásmido de plantilla con el gen portador sintético y polimerasa de fusión de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Mezclar los reactivos por pipeteo.Agregue 90 microlitros de la mezcla de PCR a 10 microlitros de cada imprimación inversa y mezcle. Consulte el manuscrito para conocer las condiciones de termociclismo. Realice la transcripción inversa o RT en el ARN de interés.Combine un microlitro de imprimación de transcripción inversa, 10 nanogramos de ARN y 4. 990 nanogramos de mezcla portadora en un volumen total de 10 microlitros. Mezclar en pipeteando arriba y abajo. Calienta la mezcla a 65 grados centígrados durante cinco minutos y luego colóquela inmediatamente sobre hielo.Preparar la mezcla RT de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y añadir 28 microlitros de la mezcla a 10 microlitros de ARN. Mezclar el contenido del tubo pipeteando hasta que sea homogéneo. Ejecute RT en un termociclador.Una vez completada la transcripción inversa, purifique el producto con cuentas magnéticas SPRI libres de DNase y RNase. Agregue las perlas a la mezcla RT en una relación de volumen de 1.8 a uno y mezcle bien por pipeteo. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego, coloca las cuentas en un soporte magnético y deja que se separen durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 70% de etanol recién preparado a las perlas. No mezcle las perlas ni las quite del soporte magnético y retire el etanol inmediatamente después de añadirlo.Mantenga el tubo en el soporte magnético y retire todos los rastros de etanol empujando las gotas restantes hacia fuera con una pipeta P10. Agregue inmediatamente 42 microlitros de agua, y pipetee hacia arriba y hacia abajo 60 veces para eluir la muestra, teniendo cuidado de no causar espuma. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante cinco minutos sin la tapa y luego separar las perlas en el soporte magnético.A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos, teniendo cuidado de recuperar todo el sobrenadante, pero evitar el traspaso de cuentas. Después del tratamiento con RNase I, mezcle 45 microlitros de muestra con 105 microlitros de cuentas de estreptavidina preparadas e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, pipetear la muestra cada 10 minutos para mezclar.A continuación, separe las perlas en el soporte magnético y retire el sobrenadante. Lave las perlas con los buffers A, B y C.A partir del buffer A, resuspender las perlas en 150 microlitros de tampón. Separe en el soporte magnético durante dos o tres minutos, y luego retire el sobrenadante.Precaliente los tampones B y C a 37 grados Centígrados y repita los pasos de lavado. Para eliminar todo el ARN sin tapar, es crucial lavar a fondo las perlas de estreptavidina y las paredes del tubo y eliminar completamente el tampón de lavado antes de agregar el siguiente. Para liberar el ADNc, resuspender las perlas en 35 microlitros de 1X RNase I buffer e incubar a 95 grados Celsius durante cinco minutos.Después de la incubación, coloque inmediatamente las cuentas sobre hielo durante dos minutos. Separe las perlas en un soporte magnético y transfiera el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos. Resuspender las perlas en 30 microlitros de 1X RNase I buffer y luego separar en un soporte magnético.Combine el sobrenadante con el sobrenadante previamente recogido para un volumen total de aproximadamente 65 microlitros. Realice qPCR para determinar el número de ciclos de PCR para la amplificación de la biblioteca de destino. Prepare las mezclas maestras qPCR para amplificar bibliotecas enteras de ADN del portador.Establezca las condiciones de termociclismo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y amplíe la muestra preparada. El protocolo SLIC-CAGE permite obtener bibliotecas listas para la secuenciación a partir de nanogramos de material de ARN de arranque. La longitud del fragmento en la biblioteca final oscila entre 200 y 2.000 pares base.Los fragmentos más cortos son artefactos PCR y pueden causar problemas de secuenciación en la línea. Se pueden realizar rondas adicionales de selección de tamaño para eliminarlas. En comparación con NanoCAGE, SLIC-CAGE exhibe un rendimiento significativamente mejor en la identificación del sitio de inicio de transcripción, lo que es evidente a partir de las curvas características de funcionamiento del receptor de las dos técnicas realizadas en varias cantidades de ARN total de S.cerevisiae.Al realizar este protocolo, es importante tener en cuenta que la pérdida de muestra puede dar lugar a bibliotecas de baja complejidad. Para evitarlo, se deben utilizar puntas y tubos de pipeta de baja unión. Sin SLIC-CAGE, el análisis promotor de varios tipos de células ha sido hasta ahora inaccesible.Esto incluye el análisis de las etapas del desarrollo embrionario o tejido embrionario de una amplia gama de organismos modelo.

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