Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området för genreglering, eftersom det möjliggör kärnpromotor och förstärkare upptäckt med hjälp av låga mängder utgångsmaterial. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter opartisk, genom-wide enda nukleotid upplösning kartläggning av RNA polymeras II transkriptionella startplatser med endast 10 nanogram av totalt RNA. CAGE har visat sig vara ovärderlig för att avslöja sjukdomsrelaterade transkription startplatser som kan användas som diagnostiska markörer.
SLIC-CAGE utökar dessa upptäckter för att skala prover såsom vävnadsbiopsier. SLIC-CAGE är idealiskt lämpad för djupgående och högupplöst promotoranalys av svaga celltyper, inklusive tidiga embryonala utvecklingsstadier eller embryonal vävnad från ett brett spektrum av modellorganismer. Eftersom det finns talrika steg i detta protokoll, är det avgörande att minimera provförlust i varje steg genom att ta hand för att hämta så mycket material som möjligt vid överföring mellan rör.
Börja med att förbereda PCR-mixen för varje mall. Kombinera buffert, dNTPs, unika framåt primer, mall plasmid med den syntetiska bärargenen, och fusion polymeras enligt manuskriptet riktningar. Blanda reagenser genom pipettering.
Lägg till 90 mikroliter av PCR-mixen till 10 mikroliter av varje omvänd primer och mix. Hänvisa till manuskriptet för termocyklingsförhållanden. Utför omvänd transkription eller RT på RNA av intresse.
Kombinera en mikroliter av omvänd transkription primer, 10 nanogram RNA, och 4, 990 nanogram av transportören blanda i en total volym av 10 mikroliter. Blanda genom pipettering upp och ner. Värm blandningen till 65 grader Celsius i fem minuter och sedan omedelbart placera den på is.
Förbered RT-mixen enligt manuskriptriktningarna och lägg till 28 mikroliter av blandningen till 10 mikroliter av RNA. Blanda innehållet i röret genom pipettering tills homogen. Kör RT i en termocyklare.
När omvänd transkription är klar, rena produkten med DNase och RNase-fria SPRI magnetiska pärlor. Tillsätt pärlorna till RT-mixen vid en volymkvot på 1,8 till en och blanda väl genom pipettering. Låt blandningen sitta i rumstemperatur i fem minuter.
Placera sedan pärlorna på ett magnetiskt stativ och låt dem separera i fem minuter. Kassera supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av nyberedda 70%etanol till pärlorna. Blanda inte pärlorna och ta inte bort dem från magnetstativet och ta bort etanolen omedelbart efter tillsats.
Håll röret på magnetstativ och ta bort alla spår av etanol genom att trycka ut eventuella kvarvarande droppar med en P10-pipett. Omedelbar lägga till 42 mikroliter vatten, och pipetten upp och ner 60 gånger för att elute prov, var noga med att inte orsaka skumbildning. Inkubera röret i 37 grader Celsius i fem minuter utan lock och sedan separera pärlorna på magnetstativ.
Sedan överföra supernatanten till en ny uppsättning rör, var noga med att hämta alla supernatant men undvik pärlöverföring. Efter RNase I behandling, blanda 45 mikroliter prov med 105 mikroliter av beredda streptavidin pärlor och inkubera vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Under inkubationen pipettera provet var 10:e minut för att blanda.
Därefter, separera pärlorna på magnetstativ och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna med buffertar A, B och C.Från och med buffert A, resuspend pärlorna i 150 mikroliter buffert. Separera på magnetstativ i två till tre minuter, och ta sedan bort supernatanten.
Förvärm buffertar B och C till 37 grader Celsius och upprepa tvättstegen. För att ta bort alla icke-utjämnade RNA är det avgörande att tvätta streptavidin pärlor och rörväggar noggrant och att helt ta bort tvättbufferten innan du lägger till nästa. För att frigöra cDNA, resuspend pärlorna i 35 mikroliter av 1X RNase I buffert och inkubera vid 95 grader Celsius i fem minuter.
Efter inkubation, placera omedelbart pärlorna på is i två minuter. Separera pärlorna på ett magnetiskt stativ och överför supernatanten till en ny uppsättning rör. Resuspend pärlorna i 30 mikroliter av 1X RNase jag buffert och sedan separera på ett magnetiskt stativ.
Kombinera supernatanten med den tidigare insamlade supernatanten för en total volym på ca 65 mikroliter. Utför qPCR för att bestämma antalet PCR-cykler för målbiblioteksförstärkning. Förbered qPCR-mästermixerna för att förstärka hela bibliotek med DNA från bäraren.
Ställ in termocyklingsförhållanden enligt manuskriptriktningar och förstärka det preparerade provet. SLIC-CAGE-protokollet gör det möjligt att erhålla sekvenseringsklara bibliotek från nanogram av start av RNA-material. Fragmentlängden i det slutliga biblioteket sträcker sig mellan 200 och 2, 000 baspar.
Kortare fragment är PCR-artefakter och kan orsaka sekvenseringsproblem nedåt linjen. Ytterligare omgångar av storleksval kan utföras för att ta bort dem. Jämfört med NanoCAGE uppvisar SLIC-CAGE betydligt bättre prestanda vid transkribering startplatsidentifiering, vilket framgår av mottagarens drifts karakteristiska kurvor av de två tekniker som utförs på olika mängder av S.cerevisiae totala RNA.
När du utför det här protokollet är det viktigt att tänka på att provförlust kan leda till bibliotek med låg komplexitet. För att förhindra det måste lågbindande pipettspetsar och rör användas. Utan SLIC-CAGE har promotoranalys av olika celltyper hittills varit otillgänglig.
Detta inkluderar analys av embryonala utvecklingsstadier eller embryonal vävnad från ett brett spektrum av modellorganismer.
