Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Wellcome Trust Grant (106954) tilldelas B. L. och medicinsk forskning rådet (MRC) kärn finansiering (MC-A652-5QA10). N. C. stöddes av EMBO Long-term Fellowship (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. stöddes av medicinska forsknings rådet i Storbritannien; B. L. stöddes av medicinska forsknings rådet i Storbritannien (MC UP 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

Ett patent för nedbrytbart bärar-RNA/DNA har fyllts.

För framgångs rik skära upp i skivor-bur bibliotek förberedelserna, det er kritisk till använda låg-bindande spets och rören till hindra prov förlust på grund av prov adsorption. I alla steg som involverar hämtning av supernatanten bör du återställa entiresample-volymen. Eftersom protokollet har flera steg, kommer kontinuerlig prov förlust leda till misslyckade bibliotek.
Om bur (nAnT-iCAGE) har inte blitt utfört rutinmässigt, den er bäst till prov skära upp i skivor-bur med olik insatsen beloppen (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) om samma räkna samman RNA prov och jämföra med nAnT-iCAGE bibliotek så pass är beredd Använd ande 5 μg av räkna samman RNA. Om den nAnT-iCAGE bibliotek är misslyckad (mindre en 0.5-1 ng om DNA bibliotek skaffat per prov), skära upp i skivor-bur är osannolikt till verk, och prov förlust nödvändigt vis till vara reducera.
Ett viktigt steg för att säkerställa hög kvalitet bibliotek saknar icke-utjämnade försämrat RNA eller rRNA är Cap-fångst som beskrivs i avsnitt 7. Det är mycket viktigt att streptividin-pärlorna grundligt återsuspenderas i tvättbuffertar och att tvättbuffertarna avlägsnas innan de fortsätter till nästa tvättsteg eller eluering av cDNA.
Om resultaten från qPCR efter den första omgången av bärare nedbrytning visar ingen skillnad mellan användning av adaptor_f1 och carrier_f1 primers, fortsätter protokollet rekommenderas fortfarande. Om det efter den andra omgången av bärare nedbrytning, skillnaden i CT-värden är mindre än fem, en tredje omgång bärare nedbrytning rekommenderas. Vi har aldrig funnit en tredje omgång av nedbrytning behövs, och om det inträffar, det rekommenderas att ersätta homing endonuclease bestånd.
Ytterligare omgångar med PCR-förstärkning kan läggas till protokollet om det slutliga beloppet för det bibliotek som erhålls inte är tillräckligt för sekvensering. PCR-förstärkning kan sedan ställas in med minimalt antal amplifieringscykler som behövs för att ge tillräckligt med material för sekvensering, med beaktande av prov förlust som inte kan undvikas vid storleks val. Rening eller storleks val med hjälp av SPRI magnetiska pärlor bör sedan utföras tills alla små (< 200 BP) fragment avlägsnas (om det behövs, Använd 0,6:1 pärlor till provet ratio), och biblioteket bör kvantifieras med Picogreen.
Bibliotek kan ordnas i enslutsläge eller ihopparad. Med hjälp av Parade-end sekvensering, information om transkription ISO former kan erhållas. Dessutom, som omvänd transkription utförs med hjälp av en slumpmässig primer (tct-n6, N6 är en slumpmässig hexamer), information från sekvenserade 3 '-End kan användas som unika molekyl ära identifierare (Umi) för att komprimera PCR dubbletter. Eftersom ett måttligt antal PCR-amplifieringscykler används (upp till 18), har användningen av UMIs tidigare befunnits vara onödig.
Som kärnan i protokollet förlitar sig på nAnT-iCAGE11, SLIC-Cage använder åtta streckkoder. Multiplexering av mer än åtta prover stöds därför för närvarande inte. Dessutom, båda skära upp i skivor-bur och nAnT-iCAGE är inte passande för erövrare RNAs kortare än 200 BP, så protokollen är planerat på flytta Linkers och PCR artefakt igenom storlek-uteslutandet med AMPure XP pärlor.
Skära upp i skivor-bur är den bara opartisk låg-insatsen enkel-nukleotid beslutsamhet metod för kart läggande transkription inledande börja tomten Använd ande nanogram av räkna samman RNA material. Alternativa metoder förlitar sig på mallen växling aktivitet omvänt transkriptase till streckkod utjämnat RNA i stället för Cap-svällning (t. ex. NanoCAGE15 och NanoPARE16). På grund av mall växling, dessa metoder uppvisar sekvens-specifika fördomar i Tsss upptäckt, vilket leder till ökat antal falska positiva Tsss och minskat antal sanna Tsss9,10.

Cap analys av gen uttryck (CAGE) är en metod som används för Single-nucleotide resolution genom-wide kart läggning av RNA-polymeras II transkription start platser (TSSs)1. Dess kvantitativa karaktär tillåter också 5 '-End centrerad uttryck profilering. Regioner som omger Tsss (ca 40 BP uppströms och nedströms) är centrala initiativtagare och representerar den fysiska platsen där RNA-polymeras II och allmänna transkriptionsfaktorer binder (granskat tidigare2,3). Information om exakta platser för TSSs kan användas för att identifiera kärn Promotorn och för att övervaka Promotorns dynamik. Dessutom, som aktiva förstärkare uppvisar signaturer för dubbelriktad transkription, kan CAGE data också användas för förstärkare upptäckt och övervakning av förstärkare dynamik4. CAGE metodik har nyligen ökat i popularitet på grund av dess breda tillämpning och användning i hög profil forsknings projekt som ENCODE5, modencode6, och fantom projekt7. Dessutom har TSS-information också visat sig vara viktig för att särskilja frisk och sjuk vävnad, eftersom sjukdomsspecifika TSSs kan användas för diagnostiska ändamål8.
Även om flera metoder för TSS-mappning finns tillgängliga (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), har vi och andra nyligen visat att CAGE är den mest objektiva metoden för att fånga sanna TSSs med det minsta antalet falska positiva identifieringar9 , 10. den nyligen Cage protokoll, NAnT-icage11, är den mest objektiva protokoll för TSS profilering, eftersom det undviker att skära fragment till korta Taggar med restriktionsenzymer och inte använder PCR-förstärkning. En begränsning av nAnT-iCAGE-protokollet är kravet på en stor mängd utgångs material (t. ex. 5 μg totalt RNA för varje prov). För att besvara specifika, biologiskt relevanta frågor är det ofta omöjligt att få så stora mängder utgångs material (t. ex. för FACS-sorterade celler eller tidiga embryonala stadier). Slutligen, om nAnT-iCAGE är framgångs rik, endast 1-2 ng av DNA-bibliotek material finns från varje prov, vilket begränsar uppnåeliga sekvensering djup.
För att möjliggöra TSS profilering med endast nanogram av totalt RNA, har vi nyligen utvecklat Super-low input Carrier-CAGE10 (SLIC-Cage, figur 1). Skära upp i skivor-bur behöver bara 10 ng av räkna samman RNA till få hög invecklad bibliotek. Vårt protokoll förlitar sig på den omsorgsfullt utformade syntetiska RNA bärare läggas till RNA av intresse för att uppnå totalt 5 μg av RNA-material. Den syntetiska bäraren härmar målet DNA-bibliotek i längd distribution för att undvika eventuella fördomar som kan orsakas av homogena molekyler i överskott. Sekvensen av bäraren är baserad på sekvensen av Escherichia coli leucyl-tRNA synt Etas genen (tabell 1) av två skäl. Först, eventuella överblivna av bäraren i det slutliga biblioteket, även om sekvenserade, kommer inte att mappa till en eukaryotisk genomet. För det andra, som E. coli är en mesofil art, dess hushållninggener är optimerade för det temperatur område som lämpar sig för SLIC-Cage. Bärvågen sekvensen är också inbäddad med homing endonuclease erkännande platser för att möjliggöra specifik nedbrytning av DNA som härrör från bärare RNA-molekyler. Målet, exempel-härledda bibliotek förblir intakt, eftersom homing endonuclease erkännande platser är långa (I-CeuI = 27 BP; I-SceI = 18 BP) och statistiskt sett osannolikt att påträffas i eukaryota genom. Efter specifik nedbrytning av bäraren och avlägsnande av fragment av storlek uteslutning, mål biblioteket är PCR förstärks och redo för nästa generations sekvensering. Beroende på utgångs RNA-mängden (1-100 ng) förväntas mellan 13-18 PCR-amplifiering cykler krävas. Den slutliga mängden DNA per varje prov varierar mellan 5-50 ng, vilket ger tillräckligt med material för mycket djup sekvensering. Vid användning av endast 1-2 ng av totalt RNA kan sanna TSSs detekteras; biblioteken förväntas dock vara av lägre komplexitet. Slutligen, som SLIC-CAGE är baserad på nAnT-iCAGE protokoll11, det möjliggör multiplexering av upp till åtta prover före sekvensering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

Cap analys av gen uttryck (CAGE) är en metod som används för singel-nukleotid upplösning detektion av RNA-polymeras II transkription start platser (TSSs). Noggrann detektering av TSSs förbättrar identifieringen och upptäckten av centrala initiativtagare. Dessutom kan aktiva förstärkare detekteras genom signaturer för dubbelriktad transkription initiering. Beskrev här är en protokoll för utförande toppen-låg insatsen bärare-bur (skära upp i skivor-bur). Denna SLIC-anpassning av CAGE-protokollet minimerar RNA-förluster genom att artificiellt öka RNA-mängden genom användning av en in vitro-transkriberad RNA-bärar blandning som läggs till i urvalet av intresse, vilket möjliggör biblioteks beredning från nanogram-mängder av totalt RNA (dvs. tusentals celler). Bäraren imiterar den förväntade fördelningen av DNA-biblioteksfragmentlängden och eliminerar därmed fördomar som kan orsakas av överflödet av ett homogent transport företag. I protokollets sista stadier tas bäraren bort genom nedbrytning med homing-slutonukleaser och mål biblioteket förstärks. Mål provet biblioteket är skyddat från nedbrytning, eftersom homing endonuclease erkännande platser är långa (mellan 18 och 27 BP), vilket gör sannolikheten för deras existens i eukaryota genomar mycket låg. resultatet är ett DNA-bibliotek redo för nästa generations sekvensering. Alla steg i protokollet, upp till sekvensering, kan slutföras inom 6 dagar. Transport ören förberedelse kräver en hel arbets dag; den kan dock beredas i stora kvantiteter och hållas fryst vid-80 ° c. En gång sekvenserade, läser kan bearbetas för att få genombred singel-nukleotid upplösning TSSs. TSSs kan användas för Core promotor eller förstärkare upptäckt, ger insikt i gen reglering. När aggregerad till initiativtagare, kan data också användas för 5 '-centrerad uttryck profilering.

Denna rapport beskriver det fullständiga SLIC-CAGE-protokollet för att erhålla sekvenserings färdiga bibliotek från nanogram av start totalt RNA-material (figur 1). För att erhålla den syntetiska RNA-bärar blandningen måste först PCR-bärar mallar förberedas och gelrenas för att eliminera PCR-sidoprodukter (figur 2A). Varje PCR-mall (totalt tio) produceras med hjälp av en vanlig forward, men en annan omvänd primer (tabell 2), vilket leder till olika längder av PCR-mallen för att möjliggöra storleks variation hos syntetiska RNA-bärare. När de har renats används PCR-mallar för in vitro-transkription av bärar molekylerna. En enda RNA-bärar produkt förväntas om mallarna är gel-renade (se representativ gel-analys i figur 2b). Beredning av transport ören kan skalas upp beroende på behov, och när beredd, blandad och fryst vid-80 ° c för framtida bruk.
Med hjälp av den rekommenderade minimala mängden prov totalt RNA (10 ng) kombinerat med 16-18 cykler av PCR-förstärkning, hög komplexitet SLIC-CAGE bibliotek kan uppnås. Antal PCR-cykler som krävs för att förstärka det slutliga biblioteket beror i hög grad på mängden av det totala indata-RNA som används (det förväntade antalet cykler presenteras i tabell 4).
Efter den första omgången av nedbrytning, i qPCR-resultat (steg 17), är den förväntade skillnaden mellan CT-värden som erhålls med adaptor_f1 eller carrier_f1 primer 1-2, med CT-värden erhållna med adaptor_f1 lägre än med carrier_f1.
Fördelningen av fragment längder i det slutliga biblioteket är mellan 200-2000 BP med den genomsnittliga fragmentstorleken på 700-900 BP (baserat på region analys med hjälp av Bioanalyzer program vara, figur 4b, D). Kortare fragment, som visas i figur 4a, C, måste tas bort med ytterligare storleks rundor-uteslutning (steg 20-21). Dessa korta fragment är PCR-amplifiering artefakter och inte mål biblioteket. Observera att kortare fragment klustret bättre på sekvensering flöde celler och kan orsaka problem med sekvensering.
Den förväntade mängden biblioteks material som erhålls per prov är mellan 5-50 ng. Betydligt lägre belopp är ett tecken på prov förlust under protokollet. Om den erhållna låga kvantiteten är tillräcklig för sekvensering (2-3 ng av de poolade biblioteken behövs), kan biblioteken vara av lägre komplexitet (se nedan).
Beroende på sekvenserings maskinen kan antalet bibliotek som läses in på flödes cellen behöva optimeras. Med hjälp av en Illumina HiSeq 2500, lastning 8-12 pM SLIC-CAGE bibliotek ger i genomsnitt 150-200 miljoner läser, med > 80% läser passerar kvalitet poäng Q30 som tröskel.
De erhållna läsningar mappas sedan till referengenomet [för 50 BP läsningar, Bowtie212 kan användas med standard parametrar som tillåter noll Miss matchningar per frö sekvens (22 BP)]. Förväntad kart effektivitet beror på det totala RNA-inmatningsbeloppet och presenteras i tabell 5. De unikt mappade läsningar kan sedan läsas in i R grafisk och statistisk dator miljö13 och bearbetas med cager (bioconductor paket14). Paketet vinjett är lätt att följa och förklarar arbets flödet och bearbetning av mappade data i detalj. En lätt visuell kontroll av bibliotekets komplexitet är fördelningen av Promotorns bredd, eftersom låg komplexitet bibliotek kommer att ha artificiellt smala initiativtagare (figur 5a, SLIC-Cage bibliotek härrör från 1 ng av totalt RNA, för detaljer se tidigare publikation10). Hur... än, jämn den låg-invecklad skära upp i skivor-bur bibliotek tillåta identifieringen av sann CTSSs, med betydlig exakthet än alternativ metoderna för låg/medels Tor-insatsen TSS kart läggande (Figur 5b, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> I figur 1: Stegen i SLIC-Cage-protokollet. Prov-RNA blandas med RNA-bärar blandningen för att uppnå 5 μg totalt RNA-material. cDNA syntetiseras genom omvänd transkription och locket oxideras med natriumperiodate. Oxidation gör det möjligt att fästa biotin på locket med biotin hydrazid. Biotin blir knuten till mRNA ' s 3 ′ End, eftersom det också oxideras med natriumperiodate. För att eliminera biotin från mRNA: cDNA hybrider med ofullständigt syntetiserade cDNA och från 3 ′ ändarna av mRNA, proverna behandlas med RNase I. cDNA som nådde 5 ′ slutet av mRNA väljs sedan av affinitet rening på streptividin magnetiska pärlor ( lock-svällning). Efter release av cDNA, 5 ′-och 3 ′-Linkers är ligated. De biblioteks molekyler som kommer från bäraren bryts ned med hjälp av I-SceI-och I-CeuI-homing-slutonukleaser och fragmenten avlägsnas med magnet pärlor från SPRI. Biblioteket är sedan PCR Amplified. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Figur 2: representativ gel analys av bärare PCR-mallar och bärare in vitro-utskrifter. (A) bärare PCR-mallar före gel rening: den första brunnen innehåller 1 KBP markör, följt av bärare PCR mallar 1, 1-10. (B) bärare in vitro-utskrifter: den första brunnen innehåller 1 KBP markör, följt av bärare avskrifter 1-10. Carrier avskrifter denaturerades genom upphettning i 5 min vid 95 ° c före lastning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Figur 3: representativ DNA-kvalitet (hög känslighet DNA-chip) spår av SLIC-Cage före första omgången av bärare nedbrytning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Figur 4: representativ DNA-kvalitet (hög känslighet DNA-chip) spår av SLIC-Cage bibliotek efter PCR-förstärkning. (A) SLIC-Cage-bibliotek som kräver ytterligare storleks val för avlägsnande av korta fragment. (B) skära upp i skivor-bur bibliotek efter storlek-utväljande Använd ande 0.6 x spri pärlor till prov förhållande. (C) skära upp i skivor-bur bibliotek av sänka produktionen belopp så pass behöver storlek-val för flyttande av kort fragment. (D) skära upp i skivor-bur bibliotek av sänka produktionen belopp efter storlek-utväljande Använd ande 0.6:1 spri pärlor till prov förhållande. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Figur 5: Validering av SLIC-Cage-bibliotek. (A) distribution av taggen kluster interquantile bredder i SLIC-Cage bibliotek beredda från 1, 5, eller 10 ng av S. cerevisiae totalt RNA, och i NAnT-icage biblioteket beredd från 5 μg S. cerevisiae totalt RNA. En hög mängd smala tag kluster i 1 ng SLIC-CAGE biblioteket visar sin låga komplexitet. (B) Roc kurvor för CTSS identifiering i S. cerevisiae SLIC-Cage bibliotek. Alla S. cerevisiae NAnT-icage ctsss användes som en sann uppsättning. (C) Roc kurvor för CTSS-identifiering i S. cerevisiae nanocage bibliotek. Alla S. cerevisiae NAnT-icage ctsss användes som en sann uppsättning. Jämförelse av ROC kurvor visar att SLIC-CAGE kraftigt överträffar nanoCAGE i CTSS identifiering. Data från ArrayExpress E-MTAB-6519 användes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: sekvens av bäraren syntetiska genen. I-SceI platser är fet och kursiv i lila, och I-CeuI erkännanden platser är gröna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bärare</td>
			<td colspan="2">omvänd primer 5 '-3 '</td>
			<td>PCR-produktens längd/BP</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* Forward primer är densamma för alla bärare mallar. Understruken är T7-Promotorns sekvens. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: grund färger för amplifiering av bärar mal len. Framåtprimer är densamma för alla transportmallar. Understruken är T7-Promotorns sekvens. PCR_GN5_f1: Taatacgactcactatagnnnnncagcgttcgcta. Med olika omvänd primers, tillverkas PCR-mallar och därmed bärare RNAs av olik längd.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bärare</td>
			<td>Längd</td>
			<td>icke-utjämnade/μg</td>
			<td>begränsat/μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8,36</td>
			<td>0,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6,6</td>
			<td>0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3,08</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2,64</td>
			<td>0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2,2</td>
			<td>0,25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: RNA-bärar blandning. Totalt 49 μg av bärar blandningen 0,3-1 KBP: icke-utjämnade = 44 μg, utjämnade = 5 μg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totalt RNA-ingång/ng</td>
			<td>PCR-cykler</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng till</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng till</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng till</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng till</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng till</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 till</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 till</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>I tabell 4: Förväntat antal PCR-cykler i beroende av provets totala RNA-ingång. Ungefärligt antal cykler är baserat på experiment som utförs med Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, och mus Musculus totala RNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Totalt RNA-ingång/ng</td>
			<td>% totalt kartlagd</td>
			<td>% unikt kartlagd</td>
			<td>% transportör</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng till</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng till</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng till</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng till</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng till</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 till</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 till</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 5: förväntad kart effektivitet och beroende av totalt RNA-invärde. Ungefärliga siffror presenteras och baseras på experiment som utförs med Saccharomyces cerevisiae och mus MUSCULUS totala RNA.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Cap analys av Gene Expression (CAGE) är en metod för genombred kvantitativ kart läggning av mRNA 5 ' ändar för att fånga RNA-polymeras II transkription start platser vid en enda-nukleotid upplösning. Detta arbete beskriver en låg-input (SLIC-CAGE) protokoll för generering av högkvalitativa bibliotek med nanogram-mängder av totalt RNA.

Transkription start webbplats mappning med Super-low ingång Carrier-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området för genreglering, eftersom det möjliggör kärnpromotor och förstärkare upptäckt med hjälp av låga mängder utgångsmaterial. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter opartisk, genom-wide enda nukleotid upplösning kartläggning av RNA polymeras II transkriptionella startplatser med endast 10 nanogram av totalt RNA. CAGE har visat sig vara ovärderlig för att avslöja sjukdomsrelaterade transkription startplatser som kan användas som diagnostiska markörer.SLIC-CAGE utökar dessa upptäckter för att skala prover såsom vävnadsbiopsier. SLIC-CAGE är idealiskt lämpad för djupgående och högupplöst promotoranalys av svaga celltyper, inklusive tidiga embryonala utvecklingsstadier eller embryonal vävnad från ett brett spektrum av modellorganismer. Eftersom det finns talrika steg i detta protokoll, är det avgörande att minimera provförlust i varje steg genom att ta hand för att hämta så mycket material som möjligt vid överföring mellan rör.Börja med att förbereda PCR-mixen för varje mall. Kombinera buffert, dNTPs, unika framåt primer, mall plasmid med den syntetiska bärargenen, och fusion polymeras enligt manuskriptet riktningar. Blanda reagenser genom pipettering.Lägg till 90 mikroliter av PCR-mixen till 10 mikroliter av varje omvänd primer och mix. Hänvisa till manuskriptet för termocyklingsförhållanden. Utför omvänd transkription eller RT på RNA av intresse.Kombinera en mikroliter av omvänd transkription primer, 10 nanogram RNA, och 4, 990 nanogram av transportören blanda i en total volym av 10 mikroliter. Blanda genom pipettering upp och ner. Värm blandningen till 65 grader Celsius i fem minuter och sedan omedelbart placera den på is.Förbered RT-mixen enligt manuskriptriktningarna och lägg till 28 mikroliter av blandningen till 10 mikroliter av RNA. Blanda innehållet i röret genom pipettering tills homogen. Kör RT i en termocyklare.När omvänd transkription är klar, rena produkten med DNase och RNase-fria SPRI magnetiska pärlor. Tillsätt pärlorna till RT-mixen vid en volymkvot på 1,8 till en och blanda väl genom pipettering. Låt blandningen sitta i rumstemperatur i fem minuter.Placera sedan pärlorna på ett magnetiskt stativ och låt dem separera i fem minuter. Kassera supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av nyberedda 70%etanol till pärlorna. Blanda inte pärlorna och ta inte bort dem från magnetstativet och ta bort etanolen omedelbart efter tillsats.Håll röret på magnetstativ och ta bort alla spår av etanol genom att trycka ut eventuella kvarvarande droppar med en P10-pipett. Omedelbar lägga till 42 mikroliter vatten, och pipetten upp och ner 60 gånger för att elute prov, var noga med att inte orsaka skumbildning. Inkubera röret i 37 grader Celsius i fem minuter utan lock och sedan separera pärlorna på magnetstativ.Sedan överföra supernatanten till en ny uppsättning rör, var noga med att hämta alla supernatant men undvik pärlöverföring. Efter RNase I behandling, blanda 45 mikroliter prov med 105 mikroliter av beredda streptavidin pärlor och inkubera vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Under inkubationen pipettera provet var 10:e minut för att blanda.Därefter, separera pärlorna på magnetstativ och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna med buffertar A, B och C.Från och med buffert A, resuspend pärlorna i 150 mikroliter buffert. Separera på magnetstativ i två till tre minuter, och ta sedan bort supernatanten.Förvärm buffertar B och C till 37 grader Celsius och upprepa tvättstegen. För att ta bort alla icke-utjämnade RNA är det avgörande att tvätta streptavidin pärlor och rörväggar noggrant och att helt ta bort tvättbufferten innan du lägger till nästa. För att frigöra cDNA, resuspend pärlorna i 35 mikroliter av 1X RNase I buffert och inkubera vid 95 grader Celsius i fem minuter.Efter inkubation, placera omedelbart pärlorna på is i två minuter. Separera pärlorna på ett magnetiskt stativ och överför supernatanten till en ny uppsättning rör. Resuspend pärlorna i 30 mikroliter av 1X RNase jag buffert och sedan separera på ett magnetiskt stativ.Kombinera supernatanten med den tidigare insamlade supernatanten för en total volym på ca 65 mikroliter. Utför qPCR för att bestämma antalet PCR-cykler för målbiblioteksförstärkning. Förbered qPCR-mästermixerna för att förstärka hela bibliotek med DNA från bäraren.Ställ in termocyklingsförhållanden enligt manuskriptriktningar och förstärka det preparerade provet. SLIC-CAGE-protokollet gör det möjligt att erhålla sekvenseringsklara bibliotek från nanogram av start av RNA-material. Fragmentlängden i det slutliga biblioteket sträcker sig mellan 200 och 2, 000 baspar.Kortare fragment är PCR-artefakter och kan orsaka sekvenseringsproblem nedåt linjen. Ytterligare omgångar av storleksval kan utföras för att ta bort dem. Jämfört med NanoCAGE uppvisar SLIC-CAGE betydligt bättre prestanda vid transkribering startplatsidentifiering, vilket framgår av mottagarens drifts karakteristiska kurvor av de två tekniker som utförs på olika mängder av S.cerevisiae totala RNA.När du utför det här protokollet är det viktigt att tänka på att provförlust kan leda till bibliotek med låg komplexitet. För att förhindra det måste lågbindande pipettspetsar och rör användas. Utan SLIC-CAGE har promotoranalys av olika celltyper hittills varit otillgänglig.Detta inkluderar analys av embryonala utvecklingsstadier eller embryonal vävnad från ett brett spektrum av modellorganismer.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Transkription in vitro analyser och deras tillämpning i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analys av terminering av transkription Använda BrUTP strängspecifik transkription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tvåriktad retroviral integrationsplats PCR-metodik och kvantitativ dataanalys arbetsflöde

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Kartläggning av MLV-integrationswebbplatser för att definiera cellspecifika reglerande regioner

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralåga ingående Genome Sequencing bibliotek förberedelse från enda Tardigrade prov

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Förbättrad jäst en-hybrid skärmar att identifiera transkriptionsfaktor som binder till humant DNA sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskriminering och kartläggning av de primära och bearbetade Transkripterna i Mitokonskbaserade majs med hjälp av en cirkulär RT-PCR-baserad strategi

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...