Name: transcription start site mapping using super-low input carrier-cage
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Bu çalışma, B. L. ve tıbbi araştırma Konseyi (MRC) çekirdek finansmanı (MC-A652-5QA10) tarafından verilen Wellcome Trust Grant (106954) tarafından destekleniyordu. N. C. EMBO uzun dönem Bursu (EMBO ALTF 1279-2016) tarafından destekleniyordu; E. P. Tıbbi Araştırma Konseyi INGILTERE tarafından destekleniyordu; B. L. Tıbbi Araştırma Konseyi INGILTERE tarafından desteklenmektedir (MC UP 1102/1).

<ol>
	<li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage.">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li><li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation.">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li><li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation.">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+secrets+of+the+genome.">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li><li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promoter-level+mammalian+expression+atlas.">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li><li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies.">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparative+analysis+of+5'-end+RNA-sequencing+methods.">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li><li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIC-CAGE:+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA.">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li><li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+expressed+genes+using+CAGE.">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357 (2012).</li><li>A language and environment for statistical computing. Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017)</li><li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAGEr:+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses.">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).</li><li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoCAGE:+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5'-Capped+Transcriptomes.">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li><li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoPARE:+parallel+analysis+of+RNA+5'+ends+from+low-input+RNA.">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li></ol>

Çözünebilir taşıyıcı RNA/DNA için bir patent doldurulur.

Başarılı dılım kafes Kütüphane preparatları için, örnek adsorpsiyon nedeniyle numune kaybını önlemek için düşük ciltli ipuçları ve tüpler kullanmak önemlidir. Supernatant alma içeren tüm adımlarda, tüm hacmi kurtarmak için tavsiye edilir. Protokolün birden çok adımı olduğu için, sürekli örnek kaybı başarısız kitaplıklara yol açacaktır.
CAGE (nAnT-ıcage) rutin olarak yapılmadı ise, aynı toplam RNA örneğinin farklı giriş tutarları (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) ile SLıC-CAGE test etmek ve toplam RNA 5 μg kullanılarak hazırlanan nAnT-ıcage kütüphaneleri karşılaştırmak en iyisidir. NAnT-ıcage Kütüphanesi başarısız olursa (numune başına elde edilen DNA kütüphanesinin 0,5-1 ng 'den az), dılım-kafes çalışma olasılığı düşüktür ve örnek kaybın minimize edilmesi gerekir.
Bozulmuş RNA veya rRNA yoksun yüksek kaliteli kütüphaneler sağlamak için kritik bir adım Bölüm 7 ' de açıklanan kap bindirme olduğunu. Streptavidin boncuk iyice yıkama tamponları resuspended ve yıkama tamponları önce bir sonraki yıkama adım veya cDNA elüsyon devam etmek kaldırılır önemlidir.
Taşıyıcı bozulması ilk turda qPCR sonuçları adaptor_f1 ve carrier_f1 astar kullanımı arasında hiçbir fark gösteriyorsanız, protokol devam hala önerilir. Taşıyıcı bozulması ikinci turda sonra, CT değerleri farkı beşten az, taşıyıcı bozulması üçüncü turda önerilir. Biz bozulması gerekli üçüncü bir turda bulamadık ve oluşursa, bu homing endonükleaz stokları yerine tavsiye edilir.
Alınan kütüphanenin son tutarı sıralama için yeterli değilse, ek PCR amplifikasyon turlarında protokole eklenebilir. PCR amplifikasyonu daha sonra boyut seçimi kaçınılamaz dikkate örnek kaybına alarak, sıralama için yeterli malzeme verim için gereken en az sayıda amplifikasyon döngüleri ile ayarlanabilir. SPRı manyetik boncuk kullanarak arıtma veya boyut seçimi daha sonra tüm küçük (< 200 BP) parçaları kaldırılıncaya kadar yapılmalıdır (gerekirse, 0.6:1 boncuk örnek oranı kullanın), ve Kütüphane Picogreen kullanılarak nicelik olmalıdır.
Kitaplıkları tek uç veya eşleştirilmiş uç modunda sıralanabilir. Eşleştirilmiş uç sıralamasını kullanarak, transkript izoformlarının hakkında bilgi elde edilebilir. Buna ek olarak, Ters transkripsiyon rasgele bir astar kullanılarak gerçekleştirilir gibi (TCT-N6, n6 rasgele bir hexamer olmak), sıralı 3 '-End bilgileri benzersiz moleküler TANıMLAYıCıLARı olarak kullanılabilir (UMı) PCR çoğaltır daraltmak için. Orta sayıda PCR amplifikasyon döngüsü kullanıldığında (18 ' e kadar), Umıs 'in kullanımı daha önce gereksiz olarak bulunmuştur.
Protokolün çekirdeği nAnT-ıcage11' e dayanır, dılım-Cage sekiz barkodları kullanır. Bu nedenle, sekiz örneklerden fazla çoğullama Şu anda desteklenmiyor. Buna ek olarak, hem dilim-kafes ve nAnT-ıcage Rnas 200 BP 'den daha kısa yakalamak için uygun değildir, protokolleri ampure XP boncuklar ile boyut-dışlama yoluyla Linkler ve PCR eserler kaldırmak için tasarlanmıştır gibi.
DILIM-kafes toplam RNA malzemesi Nanogramlar kullanarak transkripsiyon başlatılması başlangıç siteleri haritalama için tek tarafsız düşük giriş tek nüklemotid çözünürlük yöntemidir. Alternatif Yöntemler, Cap-bindirme (örn., nanocage15 ve nanopare16) yerine barkodlu RNA 'ya ters transkriptaz etkinliğinin geçiş şablonuna dayanır. Şablon geçişi nedeniyle, bu yöntemler tsss algılama serisine özgü önyargıları sergiler, yanlış pozitif tsss sayısı arttı ve gerçek tsss9,10azalan numaraları yol.

Gen ifadesinin Cap Analizi (Cage), RNA polimeraz II transkripsiyon başlangıç sitelerindeki (tsss)1tek nüklenotid çözünürlüğünde genom çapında haritalama için kullanılan bir yöntemdir. Nicel niteliği de 5 ' End merkezli ifade profilleme sağlar. Tsss (yaklaşık 40 BP upstream ve downstream) çevreleyen bölgeler çekirdek promotörler ve RNA polimeraz II ve genel transkripsiyon faktörleri bind (daha önce2,3gözden) fiziksel konumunu temsil eder. Tsss tam konumları hakkında bilgi temel Organizatör Discovery ve organizatör dinamikleri izlemek için kullanılabilir. Ayrıca, aktif arttırıcılar çift yönlü transkripsiyon imzaları sergiler olarak, CAGE verileri de arttırıcı keşif ve geliştirici dinamiklerinin izlenmesi için kullanılabilir4. CAGE metodolojisi son zamanlarda geniş uygulama ve ENCODE5, modencode6ve Fantom projeleri7gibi yüksek profilli araştırma projelerinde kullanımı nedeniyle popülaritesi artmıştır. Buna ek olarak, TSS bilgileri de hastalık özgü TSSs tanılama amacıyla8kullanılabilir olarak, sağlıklı ve hastalıklı doku ayırt etmek için önemli olduğunu kanıtlıyor.
TSS haritalama için çeşitli yöntemler kullanılabilir olsa da (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), biz ve diğerleri son zamanlarda kafes en tarafsız yöntemi yanlış pozitif9 en az sayıda gerçek tsss yakalamak için gösterilmiştir , 10. son Cage protokolü, NAnT-ıcage11, TSS profil için en tarafsız protokoldür, bu kısıtlama enzimleri kullanarak kısa etiketlere parçaları kesme önler ve PCR amplifikasyon kullanmaz gibi. NAnT-ıcage protokolünün bir sınırlaması, büyük miktarda başlangıç malzemesi (örn. her örnek için 5 μg toplam RNA) gereksinimdir. Belirli, biyolojik olarak alakalı soruları yanıtlamak için, genellikle bu kadar yüksek miktarlarda başlangıç malzemesi elde etmek imkansız (örn., FACS sıralı hücreler veya erken embriyonik aşamaları için). Son olarak, nAnT-ıcage başarılı olursa, her örnekten sadece 1-2 ng DNA Kütüphane malzemesi kullanılabilir, böylece ulaşılabilir sıralama derinliği sınırlandırılabilir.
Sadece Nanogramlar toplam RNA kullanarak TSS profil etkinleştirmek için, son zamanlarda süper düşük giriş taşıyıcı-kafes10 geliştirdik (dılım-kafes, Şekil 1). DILIM-kafes yüksek karmaşıklık kütüphaneler elde etmek için toplam RNA sadece 10 ng gerektirir. Protokollerimiz, toplam 5 μg RNA malzemesi elde etmek için ilgi RNA 'ya eklenen özenle tasarlanan sentetik RNA taşıyıcısına dayanır. Sentetik taşıyıcı, aşırı homojen moleküllerin neden olabilecek potansiyel önyargıları önlemek için uzunluk dağılımı hedef DNA kütüphanesini taklit eder. Taşıyıcının sırası, iki nedenden ötürü Escherichia coli leucyl-tRNA sentetaz geni (Tablo 1) dizisine dayanır. İlk olarak, son kütüphanede taşıyıcı herhangi bir kalan, sıralı olsa bile, bir ökaryotik genom harita olmayacaktır. İkinci olarak, E. coli mezofilik türler olarak, temızlık genler dılım-kafes için uygun sıcaklık aralığı için optimize edilmiştir. Taşıyıcı dizisi aynı zamanda taşıyıcı RNA moleküllerinden türetilen DNA spesifik bozulması sağlamak için homing endonükleaz tanıma siteleri ile gömülür. Hedef, örnek-türetilen kitaplık sağlam kalır, homing endonükleaz tanıma siteleri uzun olduğu gibi (ı-ceui = 27 BP; I-SceI = 18 BP) ve istatistiksel olarak ökaryotik genomlar içinde bulunmak imkansız. Taşıyıcı ve boyutu dışlama tarafından parçaların çıkarılması belirli bozulması sonra, hedef Kütüphane PCR amplifikatörlüğünü ve yeni nesil sıralı için hazır. Başlangıç RNA miktarına (1-100 ng) bağlı olarak, 13-18 PCR amplifikasyon döngüleri arasında gerekli olması bekleniyor. 5-50 ng arasında her örnek aralıkları başına DNA son miktarı, çok derin sıralı için yeterli malzeme verimli. Toplam RNA sadece 1-2 ng kullanırken, gerçek TSSs tespit edilebilir; Ancak, kitaplıkları daha düşük karmaşıklık olması bekleniyor. Son olarak, SLıC-CAGE, nAnT-ıcage protokol11' e dayanır olarak, sıralamanın öncesinde sekiz örneğe kadar çoğullama sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-propanol, Bioultra, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59304-100ML-F</td>
			<td>Used in RNAclean XP purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; linkers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5&#39;linkers is described in the supplementary of this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt RNAClean XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td>Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-02CP-C</td>
			<td>Caps for PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>MCT-150-L-C</td>
			<td>Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td>
			<td>Axygen (available through Corning)</td>
			<td>PCR-96-C</td>
			<td>Low-binding PCR plates - have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Long Arm) Hydrazide</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>SP-1100</td>
			<td>Biotinylation/tagging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0259S</td>
			<td>Second strand synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit, Mighty Mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6023</td>
			<td>Used for 5&#39; and 3&#39;-linker ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18427013</td>
			<td>dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65305</td>
			<td>Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand for 1.5 ml tubes - used to prepare Streptavidin beads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) - used with cut plates to contain 2 x 8 wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.8%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51976-500ML-F</td>
			<td>Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I (E. coli)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>Leftover primer degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>agarose gel loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Kit for carrier in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>purification of carrier DNA templates from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-Ceu</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0699S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0694S</td>
			<td>Homing endonuclease used for carrier degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR mix for target library amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x</td>
			<td>Kapa Biosystems (Supplied by Roche)</td>
			<td>KK4600</td>
			<td>qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 &#181;l, 1-20 &#181;l, 20-200 &#181;)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nuclease free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>incubation steps and PCR amplficication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purification of carrier PCR templates from agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P11495</td>
			<td>Used to measure final library concentration - recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0551S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0550S</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease H</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2150A</td>
			<td>Digestion of RNA after cap-trapping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase ONE Ribonuclease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M4261</td>
			<td>Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ63669-AK</td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or any nuclease (DNase and RNase) free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311448-100G</td>
			<td>Oxidation of vicinal diols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 &#956;L, Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719390-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719463-1000EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719412-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 &#956;L , Graduated</td>
			<td>Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH)</td>
			<td>Z719447-960EA</td>
			<td>Low-binding tips - recommended use throughout the protocol to minimise sample loss.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Vacuum Concentrator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrating samples in various steps to lower volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Used for reverse transcription (1st CAGE step)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose/sorbitol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 M solution, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (20 mg/mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td>Or any suitable pure low-melt agarose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td>
			<td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td>
			<td>78390500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M5505S</td>
			<td>Degradation of 3&#39;linker&#39;s upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2080S</td>
			<td>Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcription start site mapping using super-low input carrier-cage

Gen ifadesinin Cap Analizi (Cage), RNA polimeraz II transkripsiyon başlangıç sitelerinin (tsss) tek nükle çözünürlüğü tespiti için kullanılan bir yöntemdir. TSSs 'nin doğru tespiti, çekirdek promotörleri tanıma ve keşfi geliştirir. Ayrıca, aktif arttırıcılar çift yönlü transkripsiyon başlatma imzaları ile tespit edilebilir. Burada açıklanan süper düşük giriş taşıyıcı-kafes (dılım-kafes) gerçekleştirmek için bir protokoldür. CAGE protokolünün bu dılım adaptasyonu, ilgi örneğine eklenen bir in vitro transkripsiyonu RNA taşıyıcı karışımı kullanarak RNA miktarını yapay olarak artırarak RNA kaybını en aza indirir ve böylece nanogram-toplam miktardan Kütüphane hazırlığı sağlar RNA (yani, binlerce hücre). Taşıyıcı beklenen DNA Kütüphanesi parça uzunluğu dağılımı taklit, böylece homojen bir taşıyıcı bolluğu neden olabilir önyargıları ortadan kaldırmak. Protokolün son aşamalarında, taşıyıcı endonükleases ile bozulma yoluyla kaldırılır ve hedef Kütüphane amplifikatörlü. Hedef örnek kütüphane bozulmaya karşı korunmaktadır, homing endonükleaz tanıma siteleri uzun (arasında 18 ve 27 BP), ökaryotik genomlar içinde varoluşunun olasılığını çok düşük hale. Sonuç, yeni nesil sıralama için hazır bir DNA kütüphanesidir. Protokoldeki tüm adımlar, sıralama kadar, 6 gün içinde tamamlanabilir. Taşıyıcı hazırlığı tam bir çalışma günü gerektirir; Ancak, büyük miktarlarda hazırlanabilir ve dondurulmuş tutulması-80 °C. Sıralı olarak, genom çapında tek nükle çözünürlüğü elde etmek için okuma işlenebilir TSSs. TSSs, gen Yönetmeliğine ilişkin anlayış sağlayan çekirdek promotör veya arttırıcı keşif için kullanılabilir. Bir kez Promoters için toplanan veri 5 ' merkezli ifade profil oluşturma için de kullanılabilir.

Bu raporda, toplam RNA malzemesi başlangıç nanogramlardan sıralı hazır kütüphaneler elde etmek için tam dılım kafes Protokolü açıklanmaktadır (Şekil 1). Sentetik RNA taşıyıcı karışımı elde etmek için, önce PCR taşıyıcı şablonlarının hazırlanması ve PCR yan ürünlerini ortadan kaldırmak için jel arıtması gerekir (Şekil 2a). Her PCR şablonu (Toplam on) ortak bir ileri kullanılarak üretilir, ancak farklı bir ters astar (Tablo 2), sentetik RNA taşıyıcıları boyutu değişkenliği sağlamak için PCR şablonunun farklı uzunluklarına yol. Bir kez arıtılmış, PCR şablonları taşıyıcı moleküllerin in vitro transkripsiyon için kullanılır. Şablonlar jel arıtılırsa tek RNA taşıyıcı ürün bekleniyor (bkz. Şekil 2B'de temsili jel Analizi). Taşıyıcının hazırlanması, ihtiyaca bağlı olarak ve gelecekteki kullanım için-80 °C ' de hazırlanmış, karışık ve dondurulmuş olduğunda yükseltilebilir.
16-18 PCR amplifikasyonu döngüleri ile birlikte önerilen en az miktarda numune toplam RNA (10 ng) kullanarak, yüksek karmaşıklık dılım-kafes kütüphaneler elde edilebilir. Son kütüphaneyi yükseltmek için gereken PCR döngülerinin sayısı çok kullanılan toplam giriş RNA sayısına bağlıdır (beklenen döngü sayısı Tablo 4' te sunulmuştur).
İlk düşüş turunun ardından, qPCR sonuçlarında (adım 17), adaptor_f1 veya carrier_f1 primer kullanılarak elde edilen CT değerleri arasındaki beklenen fark 1-2, adaptor_f1 ile carrier_f1 'den daha düşük olan CT değerleri ile elde edilir.
Son kütüphanede parça uzunlukları dağılımı 700-900 BP ortalama parça boyutu ile 200-2000 BP arasındadır (Bioanalyzer yazılımı kullanarak bölge analizine dayalı, Şekil 4b, D). Şekil 4A, C'de sunulan daha kısa parçalar, boyut-dışlama ek Tur tarafından kaldırılması gerekir (Steps 20-21). Bu kısa parçalar PCR amplifikasyon eserleri ve hedef kütüphanesidir. Daha kısa parçaları sıralama akışı hücrelerinde daha iyi küme ve sıralama sorunlarına neden olabilir unutmayın.
Örnek başına elde edilen Kütüphane malzemesi beklenen miktarda 5-50 ng arasındadır. Önemli ölçüde daha düşük tutarlar protokol sırasında örnek kaybın göstergesidir. Elde edilen düşük miktar sıralama için yeterli ise (2-3 ng havuzlanmış kitaplıkları gerekli), kitaplıkları daha düşük karmaşıklık olabilir (aşağıya bakın).
Sıralı makineye bağlı olarak, akış hücresine yüklenen kütüphanenin miktarı optimize edilmesi gerekebilir. Bir ıllıina HiSeq 2500 kullanarak, 8-12 pM SLıC-CAGE kütüphaneler yükleme ortalama 150-200 milyon okuma verir, >% 80 ile kalite puanı Q30 eşik olarak geçen okur.
Elde edilen okur daha sonra referans genomuna eşleştirilir [için 50 BP okur, Bowtie212 çekirdek sırası başına sıfır uyuşmazlık (22 BP)] izin varsayılan parametrelerle kullanılabilir. Beklenen eşleme verimliliği toplam RNA giriş miktarına bağlıdır ve Tablo 5' te sunulur. Benzersiz olarak eşlenen okuma daha sonra R grafik ve istatistiksel bilgi işlem ortamına yüklenebilir13 ve Cager (bioconductor paketi14) kullanılarak işlenir. Paket sahne takip etmek kolaydır ve iş akışı ve ayrıntılı olarak eşlenen verilerin işlenmesi açıklar. Kütüphane karmaşıklığının kolay bir görsel kontrolü, düşük karmaşıklık kitaplıkları yapay olarak dar promotörler (Şekil 5A, toplam RNA 1 ng dan türetilen dilim-kafes Kütüphanesi olacak gibi, organizatör genişliğinin dağılımı, Ayrıntılar için önceki görmek yayını10). Ancak, hatta düşük karmaşıklığı SLıC-CAGE kütüphaneler gerçek CTSSs, düşük/orta giriş TSS haritalama (Şekil 5B, C) için alternatif yöntemlerden daha fazla hassasiyet ile tanımlaması sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> Şekil 1: SLıC-Cage protokolünde adımlar. Örnek RNA, 5 μg toplam RNA malzemesi elde etmek için RNA taşıyıcı karışımı ile karıştırılır. cDNA Ters transkripsiyon ile sentezlenir ve kap sodyum periodat kullanılarak oksitlenir. Oksidasyon biotin hidazid kullanarak kapağın biotin eki sağlar. Biotin mRNA 's bağlı alır 3 ′ End, aynı zamanda sodyum periodate kullanılarak oksitlenmiş olduğu gibi. MRNA gelen biotin ortadan kaldırmak için: cDNA tamamen sentezlenmiş CDA ile melez ve 3 ′ den mRNA biter, örnekler RNase ı. cDNA ile tedavi edilir 5 ulaştı ′ mRNA sonuna kadar daha sonra streptavidin manyetik boncuk üzerinde yakınlık arıtma tarafından seçilir ( Cap-bindirme). CDNA serbest bıraktıktan sonra, 5 ′-ve 3 ′-linkers bağlandı. Taşıyıcı kaynaklanan Kütüphane molekülleri ı-scei ve ı-ceui homing restriksiyon endonükleazlarına benzer ve parçaları SPRI manyetik boncuklar kullanılarak kaldırılır kullanılarak bozulur. Kütüphane daha sonra PCR amplifikatörlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> Şekil 2: taşıyıcı PCR şablonları ve taşıyıcı in vitro transkriptler temsilcisi jel-analizi. (A) TAŞıYıCı PCR şablonları jel arıtma önce: ilk iyi içerir 1 KBP Marker, takip taşıyıcı PCR şablonları 1, 1-10. (B) taşıyıcı in vitro transkriptler: ilk iyi 1 KBP Marker içerir, taşıyıcı transkriptler 1-10 takip. Taşıyıcı transkriptler, yüklemeden önce 95 °C ' de 5 dakika ısıtarak denattandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> Şekil 3: temsılcı DNA kalitesi (yüksek HASSASIYET DNA çip) taşıyıcı bozulması ilk turda önce dilim-kafes izi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> Şekil 4: PCR amplifikasyonu sonrasında temsılcı DNA kalitesi (yüksek HASSASIYET DNA çipi) dilim-kafes kütüphanelerinin izleri. (A) kısa parçaların çıkarılması için ek boyut seçimi GEREKTIREN dilim kafes Kütüphanesi. (B) boyut seçiminden sonra 0.6 x SPRI boncukları kullanarak dılım-kafes Kütüphanesi örnek oranı. (C) kısa parça çıkarılması için boyut seçimi gerektiren alt çıkış miktarının dılım-kafes Kütüphanesi. (D) boyut-seçim sonra 0.6:1 SPRI boncuk örnek oranı kullanarak daha düşük çıkış MIKTARı dilim kafes Kütüphanesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> Şekil 5: SLıC-Cage kütüphanelerinin doğrulanması. (A) 1, 5 veya 10 ng s. cerevisiae toplam RNA 'dan hazırlanan ve 5 μg s. cerevisiae toplam RNA 'Dan hazırlanan nAnT-ıCAGE KÜTÜPHANESINDE bulunan dilim-kafes kütüphanelerinde etiket kümesi interquantile genişlikleri dağılımı. 1 ng SLıC-CAGE kitaplığında yüksek miktarda dar etiket kümeleri, düşük karmaşıklığı gösterir. (B) S. cerevisiae dilim-kafes kütüphanelerinde CTSS tanımlaması için Roc eğrileri. Tüm S. cerevisiae NAnT-ıcage CTSSS gerçek bir set olarak kullanıldı. (C) S. cerevisiae nanocage kütüphanelerinde CTSS tanımlaması için Roc eğrileri. Tüm S. cerevisiae NAnT-ıcage CTSSS gerçek bir set olarak kullanıldı. ROC eğrilerinin karşılaştırılması, SLıC-CAGE ' in CTSS kimliğinde nanoCAGE 'yi güçlü bir şekilde gerçekleştirdiğini gösterir. ArrayExpress E-MTAB-6519 verileri kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 1: taşıyıcı sentetik geni dizisi. I-SceI siteleri kalın ve mor olarak italik ve ı-CeuI tanınırları siteleri yeşil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Taşıyıcı</td>
			<td colspan="2">ters astar 5 '-3 '</td>
			<td>PCR ürün uzunluğu/BP</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">* Forward astar tüm taşıyıcı şablonları için aynıdır. Altı çizili T7 Organizatör dizisidir. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: taşıyıcı şablon amplifikasyon Için astar. İleri astar tüm taşıyıcı şablonları için aynıdır. Altı çizili T7 Organizatör dizisidir. PCR_GN5_f1: Taatacgactcactatagnnnnncagcgttcgcta. Farklı ters astar kullanarak, PCR şablonları ve dolayısıyla farklı uzunlukta taşıyıcı RNAs üretilmektedir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Taşıyıcı</td>
			<td>Uzun -luğu</td>
			<td>unapped/μg</td>
			<td>capped/μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8,36</td>
			<td>0,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6,6</td>
			<td>0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3,08</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4,4</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3,96</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2,64</td>
			<td>0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2,2</td>
			<td>0,25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: RNA taşıyıcı karışımı. Toplam 49 μg taşıyıcı karışımı 0.3-1 KBP: unapped = 44 μg, capped = 5 μg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Toplam RNA girişi/ng</td>
			<td>PCR döngüleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 Bisiklet</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng üzerinde</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 adede kadar</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng 'ye kadar</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: Örnek Toplam RNA girişine bağımlılığında beklenen PCR döngüsü sayısı. Döngülerin yaklaşık sayısı, Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster ve Mus musculus Total RNA kullanılarak gerçekleştirilen deneylere dayanır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Toplam RNA girişi/ng</td>
			<td>% genel eşlenen</td>
			<td>% benzersiz olarak eşlenen</td>
			<td>% taşıyıcı</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 Bisiklet</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng üzerinde</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 adede kadar</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng 'ye kadar</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 5: beklenen eşleme verimliliği ve toplam RNA giriş tutarının bağımlılığı. Yaklaşık sayılar sunulur ve Saccharomyces cerevisiae ve Mus musculus Total RNA kullanılarak gerçekleştirilen deneylere dayanır.

Watch this Scientific Journal Video about Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE at JoVE.com

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Gen ifadesinin Cap Analizi (Cage), RNA polimeraz II transkripsiyon başlangıç sitelerini tek nükle çözünürlüğe yakalamak için mRNA 5 ' ucu genom çapında nicel haritalama için bir yöntemdir. Bu çalışma, nanogram-toplam RNA miktarını kullanarak yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturmak için düşük giriş (dılım-kafes) protokolünü açıklar.

Transkripsiyon başlangıç site haritalama süper düşük giriş taşıyıcı-kafes kullanarak

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Bu yöntem, düşük miktarda başlangıç materyali kullanarak çekirdek organizatörü ve arttırıcı keşfini sağladığından, gen düzenlemesi alanındaki anahtar soruların yanıtlatılmasını sağlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, sadece 10 nanogram toplam RNA kullanarak RNA polimeraz II transkripsiyonel başlangıç alanlarının tarafsız, genom genişliğinde tek nükleotit çözünürlüğü haritalamasına olanak sağlamasıdır. CAGE tanı belirteçleri olarak kullanılabilecek hastalık ile ilişkili transkripsiyon başlangıç sitelerini ortaya çıkarmak için paha biçilmez olduğunu kanıtlıyor.SLIC-CAGE bu keşifleri doku biyopsisi gibi örnekleri ölçeklendirmek için genişletir. SLIC-CAGE, çok çeşitli model organizmaların erken embriyonik gelişim evreleri veya embriyonik dokular dahil olmak üzere zayıf hücre tiplerinin derinlemesine ve yüksek çözünürlüklü organizatörüanalizi için idealdir. Bu protokolde çok sayıda adım olduğundan, tüpler arasında transfer ederken mümkün olduğunca çok malzeme almaya özen yaparak her adımda numune kaybını en aza indirmek çok önemlidir.Her şablon için PCR karışımını hazırlayarak başlayın. Tampon, dNTPs, benzersiz ileri astar, sentetik taşıyıcı gen ile şablon plazmid ve füzyon polimeraz el yazması yönlere göre birleştirin. Pipetleme ile reaktifleri karıştırın.Her ters astar ve karışımı 10 mikrolitre PCR karışımı 90 mikrolitre ekleyin. Termobisiklet koşulları için el yazmasına bakın. RNA'da ters transkripsiyon veya RT gerçekleştirin.Bir mikrolitre ters transkripsiyon astarını, 10 nanogram RNA'yı ve 4,990 nanogram taşıyıcı karışımını toplam 10 mikrolitre lik hacimde birleştirin. Yukarı ve aşağı boru lar karıştırarak karıştırın. Karışımı 65 dereceye kadar beş dakika ısıtın ve hemen buza yerleştirin.RT karışımını el yazması yönlere göre hazırlayın ve 10 mikrolitre RNA'ya 28 mikrolitre karışımı ekleyin. Homojen olana kadar boru ile tüp içeriğini karıştırın. Rt'yi bir termocycler ile çalıştırın.Ters transkripsiyon tamamlandıktan sonra ürünü DNase ve RNase içermeyen SPRI manyetik boncuklarla arındırın. 1,8'e bir hacim oranında RT karışımına boncukları ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika oturalım.Sonra, bir manyetik standı üzerine boncuk yerleştirin ve onları beş dakika ayrı bırakın. Supernatant atın ve boncuklar için taze hazırlanmış% 70 etanol 200 mikrolitre ekleyin. Boncukları karıştırmayın veya manyetik standdan çıkarmayın ve ekledikten hemen sonra etanolü çıkarmayın.Tüpü manyetik standda tutun ve kalan damlacıkları P10 pipetiyle dışarı iterek tüm etanol izlerini çıkarın. Hemen 42 mikrolitre su ekleyin ve pipet 60 kez yukarı ve aşağı örnek elute, köpük neden değil dikkat ederek. Tüpü kapaksız 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın ve sonra boncukları manyetik standa ayırın.Sonra, tüm supernatant almak için özen, tüpler yeni bir dizi supernatant aktarın ama boncuk taşıma önlemek. RNase I tedavisinden sonra, 45 mikrolitre numuneyi 105 mikrolitre hazırlanmış streptavidin boncuklarla karıştırın ve 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, pipet her 10 dakikada bir karıştırmak için örnek.Sonra, manyetik standı nda boncuk ayırın ve supernatant çıkarın. A, B ve C tamponları ile boncukları yıkayın. Manyetik standı 2-3 dakika ayırın ve sonra supernatant çıkarın.B ve C tamponlarını 37 santigrat dereceye ısıtın ve yıkama adımlarını tekrarlayın. Tüm kapaksız RNA kaldırmak için, iyice streptavidin boncuk ve tüp duvarları yıkamak ve tamamen bir sonraki eklemeden önce yıkama tampon kaldırmak için çok önemlidir. CDNA'yı serbest bırakmak için, 1X RNase I tamponunun 35 mikrolitresinde boncukları yeniden askıya alın ve 95 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, boncukları hemen iki dakika buzun üzerine yerleştirin. Boncukları manyetik bir standa ayırın ve süpernatant'ı yeni bir tüp setine aktarın. 1X RNase I tampon 30 mikrolitre boncuk resuspend ve daha sonra manyetik bir stand üzerinde ayrı.Yaklaşık 65 mikrolitre toplam hacmi için daha önce toplanan supernatant ile supernatant birleştirin. Hedef kitaplık lağvetme için PCR döngülerinin sayısını belirlemek için qPCR gerçekleştirin. QPCR ana karışımlarını taşıyıcıdan tüm DNA kitaplıklarını yükseltmek için hazırlayın.Termobisiklet koşullarını el yazması talimatlara göre ayarlayın ve hazırlanan numuneyi yükseltin. SLIC-CAGE protokolü, başlangıç RNA materyalinin nanogramlarından sıralamaya hazır kitaplıklar elde etmeyi mümkün kılar. Son kitaplıktaki parça uzunluğu 200 ile 2,000 baz çifti arasında değişir.Daha kısa parçalar PCR yapılarıdır ve satır aşağı sıralama sorunlarına neden olabilir. Bunları kaldırmak için ek boyut seçimi turları gerçekleştirilebilir. NanoCAGE ile karşılaştırıldığında, SLIC-CAGE transkripsiyon başlangıç yeri tanımlamada önemli ölçüde daha iyi performans sergiler, bu da s.cerevisiae toplam RNA'nın çeşitli miktarlarında yapılan iki tekniğin alıcı işletim karakteristik eğrilerinden belirgindir.Bu protokolü gerçekleştirirken, örnek kaybının düşük karmaşıklıkta kitaplıklara yol açabileceğini unutmayın. Bunu önlemek için, düşük bağlayıcı pipet uçları ve tüpler kullanılmalıdır. SLIC-CAGE olmadan, çeşitli hücre türlerinin organizatör analizi şimdiye kadar erişilemez olmuştur.Bu model organizmaların geniş bir yelpazede embriyonik gelişim aşamaları veya embriyonik doku analizi içerir.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...