Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

وقد تم دعم عملنا بمنح من دويتشه كريبسيليف، رقم المنحة: 111647، ومجلس البحوث الألماني (DFG)، رقم المنحة: JA 2461/2-1.

وقد وافقت السلطات التنظيمية على جميع الإجراءات بما في ذلك المواضيع الحيوانية: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) وRegierungspräsidium Tübingen, Germany. وينبغي أن يتم إجراء جميع التلاعب في ظروف معقمة (تحت غطاء تدفق laminar) باستخدام الكواشف المعقمة والأدوات (المحاقن، مقص، ملقط، مشرط المتاح، أطباق بيتري).
<p ...

<ol>
	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

على الرغم من التقدم المحرز في علاج السرطان الجراحي والدوائي، لا يزال العلاج الناجح يشكل تحديا. وبما أن الخلايا المناعية معروفة بلعب دور هام في تنظيم نمو الورم، ينبغي إنشاء أساليب جديدة تمنع الورم في هذه الخلايا. هنا نبرهن على نهج جديد لقمع نمو الورم عن طريق نقل بالتبني من العدلات المضادة ل...

النوع الأول الإنترفيرون (IFNs) تلعب دورا هاما في تحفيز ردود المضيف على الأورام، كما أن عدم وجود نوع I IFN إشارات النتائج في ارتفاع كبير في نمو الورم1. واحدة من الآليات المشاركة في هذه العملية هو تنظيم النشاط الورمي من العدلات المرتبطة بالورم، والتي يتم التحكم فيها من قبل مستعمرة تحفيز عامل 3 مستقبلات (CSF3R) المصب إشارة2. وقد تبين أن عامل تحفيز المستعمرة 3 (CSF3)، أو عامل تحفيز مستعمرة المحببات، لتنشيط الإشارات التي تنطوي على نيكوتيناميد فوسفوريبوسيلترانسفيراز (NAMPT)3،4. NAMPT هو إنزيم الحد من معدل لتوليف الأدينين الدينوكليوتيد نيكوتيناميد, الذي يعزز تحلل الدم وتنظيم إصلاح الحمض النووي, التعبير الجيني, واستجابة الإجهاد تعزيز الخلايا السرطانية البقاء على قيد الحياة وانتشار5. يتم الإفراط في NAMPT في أنواع السرطان متعددة، بما في ذلك القولونوالمستقيم، المبيض، الثدي، المعدة، سرطان البروستاتا والأورام الدبقية 6. NAMPT ضروري ليس فقط للخلايا السرطانية، ولكن أيضا لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الأورام، مثل الخلايا النخاعية - فإنه يدفع تمايزها4،ويمنع المبرمج وتحفيز التعبير عن السيتوكينات متعددة أو مصفوفة الانزيمات المهينة في الضامة7.
يمثل العدلات المرتبطة بالورم المغيرين اتلاف نمو الورم. وظائف تان تعتمد بشدة على توافر نوع IIFN، وهذه السيتوكينات الرئيسية النشاط المضادة للورم من العدلات. على العكس من ذلك، فإن غياب IFNs يدعم تنشيط الورم من هذه الخلايا، وخاصة خصائصها المؤيدة للأوعية الدموية. وبالاتفاق مع ذلك، فإن الفئران التي تعاني من نقص في الشبكات الدولية للأمراض تتطور إلى أورام الأوعية الدموية الأكبر بشكل كبير وأفضل، والتي يتم اختراقها بقوة مع العدلات المؤيدة للأورام/المؤيدة للأوعية الدموية1،2،8، 9،10. والأهم من ذلك، أن هذه النفثالينات المضادة للأوعية تظهر نشاطًا مرتفعًا من NAMPT، مما يشير إلى دورها الأساسي في استقطاب العدلات المؤيد للورم.
استنفاد العدلات باستخدام الأجسام المضادة Ly6G أو تثبيط هجرتهم (CXCR2 الأجسام المضادة) يؤدي إلى انخفاض تكوين الأوعية الدموية الورم, النمو, والنقيل1,8. ومع ذلك, ولدت الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي المناعية, ويرتبط إدارتها مع مجموعة من الآثار الجانبية التي تهدد الحياة11. العلاج مع جزيئات صغيرة، مثل مثبطات NAMPT FK866، أن تعدل الورم العدلات، يمكن أن تساعد على تجنب مثل هذه المضاعفات. لسوء الحظ, تثبيط الجهازية الدوائية من NAMPT, بجانب تأثيرها العلاجي على نمو الورم, يؤدي إلى آثار جانبية شديدة بما في ذلك سمية الجهاز الهضمي ونقص الصفيحات. ولذلك، فإن التطبيق المنهجي لمثبطات NAMPT غير ممكن12،13،14.
ولهذا السبب، نقترح هنا بروتوكولاً يتم فيه حظر نشاط حركة عدم الانحياز مباشرة في شبكات الاتصال المحلية المعزولة. ثم يتم نقل هذه العدلات المضادة للورم بالتبني إلى مضيف تحمل الورم. وسيساعد هذا البروتوكول على تجنب الآثار الجانبية السمية النظامية للمركبات، في حين أن تأثيره على الخلايا المستهدفة سيستمر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

مساهمة العدلات في تنظيم تكوين الأورام هو الحصول على مزيد من الاهتمام. هذه الخلايا غير متجانسة، واعتمادا على محيط الورم يمكن أن تمتلك القدرة المؤيدة أو المضادة للورم. واحدة من السيتوكينات الهامة التي تنظم وظائف العدلات في سياق الورم هي نوع I الإنترفيرون. في وجود الإنترفيرون، العدلات اكتساب خصائص مضادة للورم، بما في ذلك السمية الخلوية أو تحفيز الجهاز المناعي. وعلى العكس من ذلك، يؤدي عدم وجود إشارة الإنترفيرون إلى نشاط بارز مؤيد للورم، يتميز بالتحفيز القوي لتكوين الأوعية الدموية الورمي. في الآونة الأخيرة، يمكننا أن نثبت أن الخصائص المؤيدة للأوعية الدموية من العدلات تعتمد على تنشيط النيوتيناميد فوسفوريبوسيلترانسفيراز (NAMPT) إشارة المسار في هذه الخلايا. تثبيط هذا المسار في العدلات المرتبطة بالورم يؤدي إلى النمط الظاهري المضاد للأوعية الدموية قوية. هنا، نقوم بإظهار نموذجنا المنشأ حديثاً الذي يسمح في تقييم الجسم الحي للإمكانات الورمية للالعدلات المرتبطة بالأورام (TANs). قريبا، يمكن عزل العدلات المرتبطة بالأورام المؤيدة للأوعية من الفئران التي تعاني من نقص الإنترفيرون ويعاد استقطابها إلى النمط الظاهري المضاد للأوعية من خلال حجب إشارات NAMPT. ويمكن تقييم النشاط الوعائي لهذه الخلايا في وقت لاحق باستخدام فحص حلقة الأبهر. يمكن نقل TANs المضادة للأوعية إلى متلقي النوع البري الحامل للورم وينبغي مراقبة نمو الورم لمدة 14 يوما. في اليوم 14 يتم التضحية الفئران، وإزالة الأورام وقطع مع تقييم الأوعية الدموية الخاصة بهم. بشكل عام، يوفر بروتوكولنا أداة جديدة لتقييم القدرة الوعائية للخلايا الأولية في الجسم الحي، مثل العدلات المرتبطة بالورم، دون الحاجة إلى استخدام نماذج خط الخلايا الاصطناعية في العدلات. Vc

باستخدام الإجراء الموضح هنا، تم عزل العدلات Ifnar1-/- من الأورام وعولجت مع مثبطات NAMPT FK866 لمدة 2 ح. تم استخدام Ifnar1 غير المعالجة -/- العدلات كسيطرة. تم تقييم تأثير العلاج باستخدام فحص الحلقة الأبهرية، الذي يعكس الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها تكوين الأوع...

Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

هنا، نعرض الإمكانات العلاجية للالعدلات المضادة للأوعية المرتبطة بالورم بعد نقلها إلى الفئران الحاملة للورم. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتعامل مع نشاط العدلات في الجسم الحي السابق ولتقييم وظائفها في الجسم الحي في تطوير الأورام. وهو نموذج مناسب لدراسة العلاجات المناعية المحتملة القائمة على العدلات.

نقل العدلات المرتبطة بالورم إلى الفئران الحاملة للورم لدراسة إمكاناتها الوعائية في الجسم الحي

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

يوفر بروتوكولنا أداة جديدة لتقييم الإمكانات الوعائية للعدّيات الأولية المرتبطة بالورم في الجسم الحي دون الحاجة إلى استخدام نماذج خط خلايا العدلات الاصطناعية. تثبيط مباشر من الفوسفورية نيكوتيناميد نيستروليففيراز, قريبا NAMPT, في العدلات المرتبطة بالورم مع نقلها بالتبني في وقت لاحق إلى الحيوانات الحاملة للورم يسمح التلاعب العدلات دون آثار جانبية سامة النظامية. سوف نبرهن على الإمكانات العلاجية للعديات المرتبطة بالورم المضاد للأوعية العصبية بعد نقلها إلى مضيفين يحملون الورم لدراسة العلاجات المناعية المحتملة المستندة إلى العدلات في نماذج السرطان المختلفة.لإعداد نموذج فأر ورم مسبب للحساسية ، حلق الجلد من 10 إلى 12 أسبوعًا من العمر إناث إنترفيرون ألفا وبيتا مستقبلات فرعية 1 فئران بالضربة القاضية مع ماكينة حلاقة كهربائية وتطهير الجلد بالإيثانول بنسبة 70٪ ، ثم تحميل ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الست B16F10 سرطان الجلد في المليلتر من برنامج تلفزيوني في حقنة ملليلتر واحدة مجهزة بإبرة 0.4 من 19 ملليمتر وحقن 100 ميكرولترات من التعليق تحت الجلد على الجناح الخلفي في كل حلق الحيوان. لنقل العدلات بالتبني، تمييع خلايا الورم الميلانيني B16F10 إلى ست مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر تركيز في PBS وتمييع العدلات تعامل مع مثبطات NAMPT FK866 إلى ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز PBS. ثم، مزيج العدلات غير المعالجة أو المثبطة المعالجة مع خلايا سرطان الجلد في نسبة العدلات إلى الورم من 1:10 وحقن تحت الجلد 100 ميكرولترات من الخلايا في ما يصل إلى خمسة فئران لكل مجموعة.بعد الحقن، ضع ما يصل إلى خمسة فئران أنثى تم حقنها في قفص واحد واستخدم الفرجر لقياس طول الورم وعرضه وعمقه كل يوم لمدة 14 يومًا. في اليوم 14 بعد الحقن، وتطهير الجلد من كل حقن مع 70٪ الإيثانول واستخدام مقص ملقط لحصاد الأورام في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على متوسطة كاملة على الجليد. لقسم الأورام للتحليل النسيجي، غمر الأورام في مجمع درجة حرارة القطع الأمثل وتجميد العينات في النيتروجين السائل للتخزين عند ناقص 80 درجة مئوية.في يوم اقسام، ذوبان العينات إلى ناقص 20 درجة مئوية قبل استخدام cryotome للحصول على خمسة ميكرومتر أقسام. بعد التثبيت في الربط غير محددة، وصمة عار أقسام أنسجة الورم مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لمدة ساعة واحدة في 20 درجة مئوية، تليها ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير، وصمة عار الخلايا مع جسم مضاد ثانوي مترافق fluorescence المناسبة في صبغة تلطيخ نووي مثل DAPI لمدة ساعة واحدة في 20 درجة مئوية محمية من الضوء.في نهاية الحضانة، يجف الشرائح لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية محمية من الضوء قبل تركيب العينات مع وسيط تصاعد لا يئي، ثم تغطية كل شريحة مع زلة غطاء والسماح لوسيلة تصاعد لتجف لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية قبل تصوير الأنسجة عن طريق المجهر الفلوري. لعزلة العدلات المرتبطة بالورم، ضع خمسة أورام في البئر في آبار فردية من لوحة ستة آبار معقمة حيث يتم حصادها واستخدام مقص معقمة لرمز الأورام إلى قطعتين إلى ثلاثة ملليمترات. بعد ذلك، هضم شظايا الورم مع ملليلتر واحد من الكولاجيناز د dnase 1 حل لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة، وخلط العينات مع حقنة 10 ملليلتر كل 15 دقيقة.في نهاية الحضانة، تصفية الخلايا من خلال 100 ميكرومتر مصافي في أنبوب واحد 15 ملليلتر في بئر لإزالة الألياف غير مهضومة وإضافة برنامج تلفزيوني إلى حجم النهائي من 15 ملليلتر. جمع الخلايا المتفككة عن طريق الطرد المركزي وlyse خلايا الدم الحمراء مع ملليلتر واحد من عازلة تحلل في الأنبوب الواحد. بعد الاختلاط ، والجمع بين محتويات كل أنبوب في أنبوب واحد 15 ملليلتر ، ووقف رد الفعل بعد دقيقتين مع 11 ملليلتر من المتوسط أربع درجات مئوية كاملة.بعد الطرد المركزي، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ومنع أي ربط غير محددة مع ثلاثة microliters من الأجسام المضادة FC-كتلة لمدة 15 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة، وتسمية الخلايا مع المضادة لـ CD11b و Ly6G الأجسام المضادة وأية أجسام مضادة أخرى ذات أهمية، بالإضافة إلى DAPI، لاحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا في 14 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الكريات في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من تركيز متوسط كامل جديد على الجليد، ثم فرز CD11b إيجابية، Ly6G، العدلات DAPI-السلبية عالية على فارز الخلية المطهرة الفلورية وفقا لبروتوكولات الفرز القياسية، والتحقق من نقاء العدلات المعزولة على جهاز قياس تدفق في نهاية هذا النوع.لتثبيط العدلات المرتبطة بالورم في المختبر، بذور 1.5 مرات 10 إلى العدلات الخامسة المرتبة في كل من بئرين من لوحة U-القاع 96-well وإضافة FK866 إلى تركيز نهائي من 100 نانوموللار في المتوسط الكامل في بئر واحد وحجم متساو من المتوسط الكامل وحده إلى بئر أخرى. بعد ساعتين في حاضنة ثقافة الخلية، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الكريات في برنامج تلفزيوني في التركيز المناسب للحقن اللاحقة. إن العدلات المعالجة في مثبطات NAMPT لديها قدرة متناقصة بشكل كبير لتحفيز تكوين الفرع الأبهري مقارنة بالخلايا غير المعالجة.بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحقن تحت الجلد من العدلات المضادة للأنجيوجينية المعالجة بالمثبطات تحفز ضعفًا كبيرًا في نمو الورم مقارنة بالفئران التي يتم حقنها مع الإنترفيرون ألفا غير المعالجة و subunit 1 بالضربة القاضية. الفحص النسيجي للأورام المستخرجة يؤكد كذلك قمع كبير من تولد الأوعية في الأورام المعزولة من الفئران المعالجة مع العدلات المرتبطة بالورم المعالجة بالمثبطات مقارنة بتلك التي حقنت مع العدلات خروج المغلوب غير المعالجة. لتقييم خصائص العدلات المرتبطة بالورم المعالجة FK866 ، يمكن إجراء PCR الكمي وBlot الغربي لدراسة تنشيط المسارات داخل الخلايا المشاركة في استقطاب العدلات.منذ العدلات قصيرة الأجل، فمن الضروري لأداء جميع الخطوات في أسرع وقت ممكن، والحفاظ على العدلات الباردة خلال العملية بأكملها. هذه التقنية تمهد الطريق لدراسة الآليات والعوامل داخل الخلايا المشاركة في تنظيم خصائص الأوعية الدموية والأورام من العدلات المرتبطة بالورم في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

تحديد وتوصيف العوامل المنتشر بنقل الجينات في رواية التمزق--الوسم؛ مزق--tva النموذجي مورين

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

استخراج عينة والمتزامن كوانتيتيشن الكروماتوغرافي ميتوتريكسات وج ميتوميسين عقب تسليم تركيبة المخدرات في جسيمات نانوية للفئران الحاملة للورم

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا لدراسة CLIC4 HN4 المستحثة بضربه قاضية الخلية المبرمج في المختبر

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

في تثبيط فيفو من MicroRNA لتقليل نمو الورم في الفئران

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

في التصوير في الجسم الحي وتكميم الاستجابة الوعائية المضيف في ورم حمار وحشي Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...