Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Vores arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Krebshilfe, Tilskudsnummer: 111647 og det tyske Forskningsråd (DFG), Tilskudsnummer: JA 2461/2-1.

Alle procedurer, herunder animalske emner, er godkendt af de regulerende myndigheder: LANUV (Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) og Regierungspräsidium Tübingen, Tyskland. Alle manipulationer skal udføres under sterile forhold (under laminar flow Hood) ved hjælp af sterile reagenser og instrumenter (sprøjter, sakse, pincet, engangs Scalpels, Petri skåle).
Bemærk: protokollens overordnede skema er vist i figur 1.
<p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

Trods fremskridt i kirurgisk og farmakologisk kræftbehandling, vellykket behandling er fortsat en udfordring. Da immunceller er kendt for at spille en vigtig rolle i reguleringen af tumorvækst, bør der etableres nye metoder til at hæmme tumorigenicitet af sådanne celler. Her viser vi en ny tilgang til at undertrykke tumorvækst via adoptiv overførsel af anti-angiogen tumor-associerede neutrofiler. Selektiv målretning af Pro-angiogen NAMPT signalering i TANs, ved hjælp af FK866 inhibitor, forhindrer bivirkninger, ...

Type I Interferoner (IFNs) spiller en vigtig rolle i stimuleringen af vært svar til neoplasias, som manglen på type I IFN signalering resulterer i signifikant forhøjet tumorvækst1. En af de mekanismer, der er involveret i denne proces er reguleringen af tumorigent aktivitet af tumor-associerede neutrofiler, som styres af kolonistimulerende faktor 3 receptor (CSF3R) downstream signalering2. Kolonistimulerende faktor 3 (CSF3) eller granulocytkoloni stimulerende faktor, viste sig at aktivere signalering, der involverer nicotinamid phosphoribosyltransferase (nampt)3,4. NAMPT er et sats-begrænsende enzym for nicotinamid adenin dinucleotid syntese, som forbedrer glykolyse og regulerer DNA reparation, genekspression, og stress respons fremme kræftceller overlevelse og spredning5. Nampt er overudtrykt i flere kræfttyper, herunder kolorektal, æggestokkene, bryst, gastrisk, prostatakræft og gliomer6. NAMPT er afgørende ikke kun for tumorceller, men også for en bred vifte af andre celletyper, der er til stede i tumorer, såsom myeloide celler-det driver deres differentiering4, hæmmer apoptose og stimulere ekspression af flere cytokiner eller matrix-nedbrydende enzymer i makrofager7.
Tumor-associerede neutrofiler repræsenterer vigtige modulatorer af tumorvækst. TAN funktioner er stærkt afhængige af typen jeg IFN tilgængelighed, som disse cytokiner Prime anti-tumor aktivitet af neutrofiler. Tværtimod, fraværet af ifns understøtter tumorigent aktivering af disse celler, især deres Pro-angiogen egenskaber. Efter aftale med dette, mus mangelfuld i ifns udvikle betydeligt større og bedre vaskulariserede tumorer, som er stærkt infiltreret med Pro-tumoral/Pro-angiogen neutrofiler1,2,8, 9,10. Vigtigere, sådanne Pro-angiogen TANs viser forhøjet aktivitet af NAMPT, tyder sin væsentlige rolle i Pro-tumor polarisering af neutrofiler.
Nedbrydning af neutrofiler ved hjælp af Ly6G antistof eller hæmning af deres migration (CXCR2 antistof) resulterer i nedsat tumor angiogenesis, vækst, og metastase1,8. Ikke desto mindre er genererede monoklonale antistoffer immunogene, og deres administration er forbundet med en række livstruende bivirkninger11. Behandling med små molekyler, såsom NAMPT inhibitor FK866, at moduere neutrofile tumoriogenicitet, kunne bidrage til at undgå sådanne komplikationer. Desværre, farmakologisk systemisk hæmning af NAMPT, ved siden af sin terapeutiske virkning på tumorvækst, fører til alvorlige bivirkninger, herunder gastrointestinal toksicitet og trombocytopeni. Derfor er den systemiske anvendelse af nampt-hæmmere ikke gennemførlig12,13,14.
Af denne grund, foreslår vi her en protokol, hvor NAMPT aktivitet er blokeret direkte i isolerede Tanger. Sådanne anti-tumor neutrofiler er derefter adoptivt overføres til en tumor-bærende vært. Denne protokol vil hjælpe med at undgå systemiske toksiske bivirkninger af forbindelserne, mens dens virkning på målcellerne vil blive opretholdt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

Bidraget af neutrofiler til reguleringen af tumor bliver øget opmærksomhed. Disse celler er heterogene, og afhængigt af tumor Milieu kan besidde Pro-eller anti-tumor kapacitet. En af de vigtige cytokiner regulere neutrofile funktioner i en tumor sammenhæng er type I Interferoner. I nærværelse af Interferoner, neutrofiler få anti-tumor egenskaber, herunder cytotoksicitet eller stimulering af immunsystemet. Omvendt, fraværet af et interferon signalering resulterer i fremtrædende Pro-tumor aktivitet, karakteriseret med stærk stimulering af tumor angiogenese. For nylig kunne vi påvise, at proangiogene egenskaber af neutrofiler afhænger af aktivering af nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) signalering pathway i disse celler. Hæmning af denne vej i tumor-associerede neutrofiler fører til deres potente anti-angiogen fænotype. Her viser vi vores nyetablerede model giver in vivo evaluering af tumorigent potentiale manipulerede tumor-associerede neutrofiler (tans). Kort, Pro-angiogen tumor-associerede neutrofiler kan isoleres fra tumor-bærende interferon-mangelfulde mus og repolariseret i anti-angiogen fænotype ved blokering af NAMPT signalering. Den angiogene aktivitet af disse celler kan efterfølgende evalueres ved hjælp af en aorta ringanalyse. Anti-angiogen TANs kan overføres til tumor-bærende vilde type modtagere og tumorvækst bør overvåges for 14 dage. På dag 14 mus er ofret, tumorer fjernet og skåret med deres vaskularisering vurderes. Samlet set, vores protokol giver et nyt værktøj til in vivo evaluere angiogen kapacitet af primære celler, såsom tumor-associerede neutrofiler, uden behov for at bruge kunstige neutrofilcellellinie modeller. Vc

Ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde blev Ifnar1-/- neutrofiler isoleret fra tumorer og behandlet med nampt-hæmmer FK866 for 2 h. ubehandlet Ifnar1-/- neutrofiler blev brugt som kontrol. Behandlingens effektivitet blev evalueret ved hjælp af aorta Rings analysen, som afspejler de vigtigste trin i angiogenese (matrix nedbrydning, migration, spredning, reorganisering). Vi kunne påvise, at FK866-behandlede neutrofiler har en signifikant neds...

Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Her viser vi terapeutisk potentiale af anti-angiogen tumor-associerede neutrofiler efter deres overførsel til tumor bærende mus. Denne protokol kan bruges til at manipulere neutrofilaktiviteten ex vivo og til efterfølgende at evaluere deres funktionalitet in vivo i udviklingen af tumorer. Det er en hensigtsmæssig model til at studere potentielle neutrofilbaserede immunterapier.

Overførsel af manipulerede tumor-associerede neutrofiler til tumor bærende mus for at studere deres angiogene potentiale in vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Vores protokol giver et nyt værktøj til evaluering af det angiogene potentiale af tumor-associerede primære neutrofiler in vivo uden at skulle bruge kunstige neutrofil cellelinjemodeller. Direkte hæmning af nicotinamid phosphoribosyltransferase, kort NAMPT, i tumor-associerede neutrofiler med deres efterfølgende adoptivoverførsel til tumor-bærende dyr tillader manipulation af neutrofiler uden systemiske toksiske bivirkninger. Vi vil demonstrere det terapeutiske potentiale af manipulerede anti-angiogene tumor-associerede neutrofiler efter overførsel til tumor-bærende værter for studiet af potentielle neutrofil-baserede immunterapier i forskellige kræftmodeller.For at oprette en allogen tumor mus model, barbere huden på 10 otte til 12-uger gamle kvindelige interferon alfa og beta-receptor underenhed 1 knockout mus med en elektrisk barbermaskine og desinficere huden med 70% ethanol, derefter indlæses tre gange 10 til de seks B16F10 melanomceller pr. milliliter PBS i en en millilitersprøjte udstyret med en 0,4 gange 19-millimeter nål og indsprøjt 100 mikroliter af suspensionen subkutant på en bagflande i hver barberet Dyr. Ved overførsel af neutrofiler fortyndes B16F10 melanomcellerne til seks gange 10 til den sjette celle pr. milliliterkoncentration i PBS og fortyndes neutrofiler behandlet med NAMPT-hæmmer FK866 til seks gange 10 til de femte celler pr. milliliter PBS-koncentration. Derefter blandes ubehandlede eller inhibitorbehandlede neutrofiler med melanomcellerne i et neutrofil-til-tumor-forhold på 1:10 og subkutant injicere 100 mikroliter celler i op til fem mus pr. gruppe.Efter injektioner, sted op til fem injicerede kvindelige mus i et enkelt bur og bruge calipre til at måle tumor længde, bredde, og dybde hver dag i 14 dage. På dag 14 efter injektion, desinficere huden på hvert injiceret dyr med 70% ethanol og bruge saks og kraftæceser til at høste tumorer i en 50-milliliter konisk rør, der indeholder komplet medium på is. At afsnit tumorer til histologisk analyse, nedsænke tumorer i optimal skæretemperatur sammensatte og fryse prøverne i flydende kvælstof til opbevaring på minus 80 grader Celsius.På dagen for sektionen tø prøverne op til minus 20 grader Celsius, før der anvendes en kryotomi til at opnå fem mikrometersektioner. Efter fiksering i ikke-specifik binding, plette tumorvæv sektioner med de primære antistoffer af interesse for en time ved 20 grader Celsius, efterfulgt af tre vasker i PBS. Efter den sidste vask, pletter cellerne med en passende fluorescens-konjugeret sekundært antistof i en nuklear-farvning farvestof som DAPI i en time ved 20 grader Celsius beskyttet mod lys.Ved slutningen af inkubationen tørres objektglassene i 20 minutter ved 20 grader Celsius beskyttet mod lys, før prøverne monteres med et vandfrit monteringsmedium, derefter dække hvert dias med en dæksel og lade monteringsmediet tørre i en time ved 37 grader Celsius, før vævsscanning af vævet ved fluorescensmikroskopi. For tumor-associeret neutrofil isolation, placere fem tumorer per godt ind i individuelle brønde af en steril seks-godt plade, som de er høstet og bruge sterile saks til at hakke tumorer i to til tre-millimeter stykker. Dernæst fordøje tumor fragmenter med en milliliter af dispase collagenase d dnase 1 opløsning i 45 minutter ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid med fugtighed, blande prøverne med en 10-milliliter sprøjte hver 15 minutter.Ved slutningen af inkubationen filtreres cellerne gennem 100 mikrometerspatorer i et 15-milliliterrør pr. brønd for at fjerne de ufordøjede fibre og tilsættes PBS til et endeligt volumen på 15 milliliter. De dissocierede celler opsamres ved centrifugering, og de røde blodlegemer skal lyses med en milliliter lysisbuffer pr. rør. Efter blanding kombineres indholdet fra hvert rør i et enkelt 15-milliliterrør, hvor reaktionen stoppes efter to minutter med 11 milliliter komplet fire grader Celsius-medium.Efter centrifugering skal pelleten resuspendres i en milliliter PBS og enhver ikke-specifik binding med tre mikroliter af Fc-blokantistof i 15 minutter på is. Ved inkubationens afslutning skal cellerne mærkes med anti-CD11b- og Ly6G-antistoffer og alle andre interesseantistoffer samt DAPI for en 30-minutters inkubation på is beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne i 14 milliliter PBS, og pelletsene skal opsbruges én gang 10 til de syvende celler pr. milliliter frisk, komplet middelkoncentration på is derefter sortere CD11b-positive, Ly6G, høj DAPI-negative neutrofiler på en fluorescens-aktiveret celle sorterer i henhold til standard sortering protokoller, kontrol renheden af de isolerede neutrofiler på strømmen cytometer i slutningen af den slags.For in vitro tumor-associeret neutroil hæmning, frø 1,5 gange 10 til den femte sorteret neutrofiler i hver af to brønde af en 96-godt U-bund plade og tilsæt FK866 til en endelig koncentration af 100 nanomolar i komplet medium i en brønd og en tilsvarende mængde komplet medium alene til den anden brønd. Efter to timer i cellekulturinkubatoren vaskes cellerne to gange med PBS, og pillerne i PBS opslæmes igen ved den passende koncentration til den efterfølgende injektion. NAMPT-inhibitorbehandlede neutrofiler har en signifikant nedsat evne til at stimulere aortagrendannelse sammenlignet med ubehandlede celler.Desuden fremkalder den subkutane injektion af inhibitorbehandlede anti-angiogene neutrofiler en signifikant svækkelse af tumorvækst sammenlignet med mus injiceret med ubehandlet interferon alfa og beta receptor subunit 1 knockout neutrofiler. Histologisk undersøgelse af de ekstraherede tumorer yderligere bekræfter den betydelige undertrykkelse af angiogenese i tumorer isoleret fra mus behandlet med inhibitor-behandlede tumor-associerede neutrofiler i forhold til dem injiceres med ubehandlet knockout neutrofiler. At vurdere egenskaberne af FK866-behandlede tumor-associerede neutrofiler, kvantitative PCR og vestlige Blot kan udføres for at studere aktivering af intracellulære veje involveret i neutrofil polarisering.Da neutrofiler er kortvarige, er det nødvendigt at udføre alle trinene så hurtigt som muligt og at holde neutrofiler kolde under hele proceduren. Denne teknik baner vejen for studiet af de intracellulære mekanismer og faktorer, der er involveret i reguleringen af angiogene og tumorigenic egenskaber tumor-associerede neutrofiler in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Den Colon-26 Carcinoma Tumor-bærende mus som en model for Studiet af Cancer Kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identifikation og karakterisering af metastatisk faktorer af genoverførsel i romanen RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Prøven udvinding og samtidige kromatografiske kvantitering af Doxorubicin og Mitomycin C efter narkotika kombination levering i nanopartikler til Tumor-bærende mus

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Påvisning af mitokondrier membran potentiale til at studere CLIC4 Knockdown-induceret HN4 celle apoptose In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hæmning af MicroRNA at mindske tumor vækst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Påvisning og overvågning af tumor associeret cirkulerende DNA i patientens Biofluider

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo billeddannelse og Kvantitation af værten Angiogen respons i Zebrafish tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...