Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Unterstützt wurde unsere Arbeit durch Stipendien der Deutschen Krebshilfe, Fördernummer: 111647, und des Deutschen Forschungsrates (DFG), Fördernummer: JA 2461/2-1.

Alle Verfahren einschließlich Tiergegenständen wurden von den Aufsichtsbehörden GENEHMIGT: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) und Regierungspräsidium Tübingen, Deutschland. Alle Manipulationen sollten unter sterilen Bedingungen (unter laminarer Durchflusshaube) mit sterilen Reagenzien und Instrumenten (Spritzen, Scheren, Zangen, Einwegsskalpelle, Petrischalen) durchgeführt werden.
ANMERKUNG: Das Gesamtschema des Protokolls ist in Abbildung...

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	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

Trotz der Fortschritte in der chirurgischen und pharmakologischen Krebsbehandlung bleibt eine erfolgreiche Therapie eine Herausforderung. Da Immunzellen bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Tumorwachstums spielen, sollten neuartige Methoden etabliert werden, die die Tumorigenizität solcher Zellen hemmen. Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Unterdrückung des Tumorwachstums durch Adoptivtransfer antiangiogenicer Tumor-assoziierter Neutrophile. Selektives Targeting der pro-angiogenen NAMPT-S...

Typ-I-Interferone (IFNs) spielen eine wichtige Rolle bei der Stimulierung von Wirtsreaktionen auf Neoplasie, da der Mangel an Typ-I-IFN-Signalisierung zu einem signifikant erhöhten Tumorwachstum führt1. Einer der Mechanismen, die an diesem Prozess beteiligt sind, ist die Regulierung der tumorigenen Aktivität von tumorassoziierten Neutrophilen, die durch koloniestimulierenden Faktor 3-Rezeptor (CSF3R) nachgeschaltete Signalisierung2gesteuert wird. Der koloniestimulierende Faktor 3 (CSF3) oder granulozyten koloniestimulierender Faktor wurde gezeigt, dass die Signalisierung mit Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) aktiviert wird3,4. NAMPT ist ein ratenbegrenzendes Enzym für die Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Synthese, das die Glykolyse verbessert und DNA-Reparatur, Genexpression und Stressreaktion reguliert, die das Überleben und die Proliferation von Krebszellen fördern5. NAMPT ist bei mehreren Krebsarten überexprimiert, einschließlich Dickdarm-, Eierstock-, Brust-, Magen-, Prostatakrebs- und Gliome6. NAMPT ist nicht nur für Tumorzellen wichtig, sondern auch für eine Vielzahl anderer Zelltypen, die in Tumoren vorhanden sind, wie z. B. myeloische Zellen - es treibt ihre Differenzierungan 4, hemmt die Apoptose und stimuliert die Expression mehrerer Zytokine oder Matrixabbauende Enzyme in Makrophagen7.
Tumorassoziierte Neutrophile stellen wichtige Modulatoren des Tumorwachstums dar. TAN-Funktionen sind stark abhängig von der Verfügbarkeit des Typs I IFN, da diese Zytokine die Antitumoraktivität von Neutrophilen prime. Im Gegenteil, das Fehlen von IFNs unterstützt die tumorgene Aktivierung dieser Zellen, insbesondere ihre pro-angiogenen Eigenschaften. In Übereinstimmung damit entwickeln Mäuse mit einem Mangel an IFNs signifikant größere und besser vaskularisierte Tumoren, die stark mit protumoralen/pro-angiogenen Neutrophilen infiltriert werden1,2,8, 9,10. Wichtig ist, dass solche pro-angiogenen TANs eine erhöhte Aktivität von NAMPT aufweisen, was auf seine wesentliche Rolle bei der Pro-Tumor-Polarisation von Neutrophilen hindeutet.
Die Erschöpfung von Neutrophilen mit Ly6G-Antikörpern oder Hemmung ihrer Migration (CXCR2-Antikörper) führt zu verminderter Tumorangiogenese, Wachstum und Metastasierung1,8. Dennoch sind erzeugte monoklonale Antikörper immunogen, und ihre Verabreichung ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Nebenwirkungen verbunden11. Die Behandlung mit kleinen Molekülen, wie dem NAMPT-Hemmer FK866, der die neutrophile Tumoriogenität modulieren, könnte helfen, solche Komplikationen zu vermeiden. Leider, pharmakologische systemische Hemmung von NAMPT, neben seiner therapeutischen Wirkung auf das Tumorwachstum, führt zu schweren Nebenwirkungen einschließlich gastrointestinaler Toxizität und Thrombozytopenie. Daher ist die systemische Anwendung von NAMPT-Inhibitoren nicht möglich12,13,14.
Aus diesem Grund schlagen wir hier ein Protokoll vor, bei dem NAMPT-Aktivitäten direkt in isolierten TANs blockiert werden. Solche Anti-Tumor-Neutrophile werden dann adoptiv in einen tumortragenden Wirt übertragen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, systemische toxische Nebenwirkungen der Verbindungen zu vermeiden, während seine Wirkung auf die Zielzellen erhalten bleibt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

Der Beitrag von Neutrophilen zur Regulierung der Tumorgenese wird immer mehr beachtet. Diese Zellen sind heterogen und können je nach Tumormilieu pro- oder antitumor-Kapazität besitzen. Eines der wichtigen Zytokine, die neutrophile Funktionen in einem Tumorkontext regulieren, sind Typ-I-Interferone. In Gegenwart von Interferonen, Neutrophile gewinnen Anti-Tumor-Eigenschaften, einschließlich Zytotoxizität oder Stimulation des Immunsystems. Umgekehrt führt das Fehlen einer Interferon-Signalisierung zu einer ausgeprägten Pro-Tumor-Aktivität, die durch eine starke Stimulation der Tumorangiogenese gekennzeichnet ist. Kürzlich konnten wir zeigen, dass pro-angiogene Eigenschaften von Neutrophilen von der Aktivierung von Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) Signalweg in diesen Zellen abhängen. Die Hemmung dieses Weges bei tumorassoziierten Neutrophilen führt zu ihrem potenten antiangiogenen Phänotyp. Hier zeigen wir unser neu etabliertes Modell, das die In-vivo-Bewertung des tumorgenen Potenzials manipulierter tumorassoziierter Neutrophilen (TANs) ermöglicht. Kurz darauf können pro-angiogene tumorassoziierte Neutrophile von tumortragenden Interferon-Mäusen isoliert und durch Blockierung der NAMPT-Signalisierung zu antiangiogenem Phänotyp repolarisiert werden. Die angiogene Aktivität dieser Zellen kann anschließend mit einem Aortenring-Assay bewertet werden. Antiangiogene TANs können in tumortragende Wildtyp-Empfänger übertragen werden und das Tumorwachstum sollte 14 Tage lang überwacht werden. Am Tag werden 14 Mäuse geopfert, Tumore entfernt und mit ihrer Vaskularisation geschnitten. Insgesamt bietet unser Protokoll ein neuartiges Werkzeug zur In-vivo-Bewertung der angiogenen Kapazität von Primärzellen, wie tumorassoziierten Neutrophilen, ohne künstliche neutrophile Zelllinienmodelle verwenden zu müssen. Vc

Mit dem hier beschriebenen Verfahren wurden Ifnar1-/- Neutrophile von Tumoren isoliert und mit DemAmpT-Hemmer FK866 für 2 h behandelt. Unbehandelte Ifnar1-/- Neutrophile wurden als Kontrolle verwendet. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde mit dem Aortenring-Assay bewertet, der die wichtigsten Schritte der Angiogenese (Matrixdegradation, Migration, Proliferation, Reorganisation) widerspiegelt. Wir konnten nachweisen, dass FK866-behandelte Neutroph...

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Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Hier zeigen wir das therapeutische Potenzial antiangiogener Tumor-assoziierter Neutrophilen nach ihrer Übertragung in tumortragende Mäuse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um neutrophile Aktivität ex vivo zu manipulieren und anschließend ihre Funktionalität in vivo bei der Entwicklungvon Tumoren zu bewerten. Es ist ein geeignetes Modell für die Untersuchung potenzieller neutrophiler Immuntherapien.

Transfer von manipulierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse zur Untersuchung ihres angiogenen Potenzials in Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Unser Protokoll bietet ein neuartiges Werkzeug zur Bewertung des angiogenetischen Potenzials tumorassoziierter Primärneutrophilen in vivo, ohne künstliche neutrophile Zelllinienmodelle verwenden zu müssen. Die direkte Hemmung der Nicotinamidphosphoribosyltransferase, kurz NAMPT, bei tumorassoziierten Neutrophilen mit ihrem anschließenden Adoptivtransfer in tumortragende Tiere ermöglicht die Manipulation von Neutrophilen ohne systemische toxische Nebenwirkungen. Wir zeigen das therapeutische Potenzial manipulierter antiangiogener tumorassoziierter Neutrophilen nach der Übertragung in tumortragende Wirte für die Untersuchung potenzieller neutrophiler Immuntherapien in verschiedenen Krebsmodellen.Um ein allogenes Tumor-Maus-Modell einzurichten, rasieren Sie die Haut von 10 acht bis 12 Wochen alten weiblichen Interferon alpha und Beta-Rezeptor-Untereinheit 1 Knockout-Mäuse mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 70%Ethanol, dann dreimal 10 bis zu den sechs B16F10 Melanomzellen pro Milliliter PBS in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 0,4 mal 19-Millimeter-Nadel laden und 100 Mikroliter der Suspension subkutan an einer hinteren Flanke in jede rasierte Tier. Bei Neutrophil-Adoptivübertragung die B16F10-Melanomzellen auf sechsmal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration in PBS verdünnen und mit NAMPT-Hemmer FK866 behandelte Neutrophile auf sechsmal 10 bis fünf Milliliter PBS-Konzentration verdünnen. Mischen Sie dann unbehandelte oder inhibitorbehandelte Neutrophile mit den Melanomzellen bei einem Neutrophilen-Tumor-Verhältnis von 1:10 und injizieren subkutan 100 Mikroliter Zellen in bis zu fünf Mäuse pro Gruppe.Legen Sie nach den Injektionen bis zu fünf injizierte weibliche Mäuse in einen einzigen Käfig und verwenden Sie Sättel, um die Tumorlänge, -breite und -tiefe jeden Tag 14 Tage lang zu messen. An Tag 14 nach der Injektion, desinfizieren Sie die Haut jedes injizierten Tieres mit 70% Ethanol und verwenden Sie Schere und Zange, um die Tumore in ein 50-Milliliter konisches Rohr mit komplettem Medium auf Eis zu ernten. Um die Tumoren für die histologische Analyse zu schneiden, tauchen Sie die Tumore in eine optimale Schnitttemperaturverbindung und frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein, um sie bei minus 80 Grad Celsius zu lagern.Tauen Sie die Proben am Tag des Schnitts auf minus 20 Grad Celsius, bevor Sie ein Kryotome verwenden, um Fünf-Mikrometer-Abschnitte zu erhalten. Nach der Fixierung in der unspezifischen Bindung, färben Sie die Tumorgewebeabschnitte mit den primären Antikörpern von Interesse für eine Stunde bei 20 Grad Celsius, gefolgt von drei Wäbungen in PBS. Nach der letzten Wäsche die Zellen mit einem geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper in einem kernnächtigen Farbstoff wie DAPI eine Stunde bei 20 Grad Celsius vor Licht geschützt färben.Trocknen Sie die Dias am Ende der Inkubation 20 Minuten bei 20 Grad Celsius, bevor Sie die Proben mit einem wasserfreien Montagemedium montieren, dann bedecken Sie jeden Schlitten mit einem Deckelschlupf und lassen Sie das Montagemedium eine Stunde bei 37 Grad Celsius trocknen, bevor sie die Gewebe mittels Fluoreszenzmikroskopie abbilden. Für die tumorassoziierte Neutrophilenisolierung legen Sie fünf Tumoren pro Brunnen in einzelne Brunnen einer sterilen Sechs-Brunnen-Platte, wie sie geerntet werden, und verwenden Sie sterile Scheren, um die Tumore in zwei bis drei Millimeter Stücke zu zerkleinern. Als nächstes verdauen Sie die Tumorfragmente mit einem Milliliter Dispase-Kollagenase d-Dnase 1-Lösung für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit und mischen die Proben alle 15 Minuten mit einer 10-Milliliter-Spritze.Filtern Sie die Zellen am Ende der Inkubation durch 100-Mikrometer-Siebe in eine 15-Milliliter-Röhre pro Brunnen, um die unverdauten Fasern zu entfernen und PBS zu einem Endvolumen von 15 Millilitern hinzuzufügen. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation und lyse die roten Blutkörperchen mit einem Milliliter Lysepuffer pro Tube. Nach dem Mischen den Inhalt aus jedem Rohr in einem einzigen 15-Milliliter-Rohr kombinieren und die Reaktion nach zwei Minuten mit 11 Millilitern komplettem Vier-Grad-Celsius-Medium stoppen.Nach der Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aufhängen und jede unspezifische Bindung mit drei Mikrolitern Fc-Block-Antikörper n.A. 15 Minuten auf Eis blockieren. Am Ende der Inkubation die Zellen mit Anti-CD11b- und Ly6G-Antikörpern und allen anderen von Interesse entfernten Antikörpern sowie DAPI für eine 30-minütige Inkubation auf lichtgeschütztem Eis kennzeichnen. Am Ende der Inkubation Waschen Sie die Zellen in 14 Milliliter PBS und setzen Sie die Pellets mit einem Mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter frischer vollständiger mittlerer Konzentration auf Eis aus, und sortieren Sie dann die CD11b-positiven, Ly6G, hohen DAPI-negativen Neutrophilen auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer nach Standard-Sortierprotokollen, und überprüfen die Reinheit der isolierten Neutrophilen auf dem Durchflusszytometer am Ende der Art.Zur in vitro tumorassoziierten Neutrophilenhemmung, Samen 1,5 mal 10 bis die fünfte sortierte Neutrophile in jedem von zwei Brunnen einer 96-well U-Bodenplatte und fügen FK866 zu einer Endkonzentration von 100 Nanomolar in vollständigem Medium in einem Brunnen und ein gleiches Volumen des vollständigen Mediums allein zum anderen Gut hinzu. Nach zwei Stunden im Zellkultur-Inkubator die Zellen zweimal mit PBS waschen und die Pellets in PBS in der entsprechenden Konzentration für die anschließende Injektion wieder aufsetzen. NAMPT-hemmerbehandelte Neutrophile haben eine signifikant verminderte Fähigkeit, die Aortenzweigbildung im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu stimulieren.Darüber hinaus induziert die subkutane Injektion von inhibitorbehandelten antiangiogenen Neutrophilen eine signifikante Beeinträchtigung des Tumorwachstums im Vergleich zu Mäusen, die mit unbehandeltem Interferon alpha und Beta-Rezeptor-Untereinheit 1 Knockout-Neutrophilen injiziert werden. Die histologische Untersuchung der extrahierten Tumoren bestätigt ferner die signifikante Unterdrückung der Angiogenese bei Tumoren, die von Mäusen isoliert wurden, die mit mit Inhibitoren behandelten tumorassoziierten Neutrophilen im Vergleich zu solchen, die mit unbehandelten Knockout-Neutrophilen injiziert wurden. Um die Eigenschaften von FK866-behandelten tumorassoziierten Neutrophilen zu bewerten, können quantitative PCR und Western Blot durchgeführt werden, um die Aktivierung intrazellulärer Bahnen zu untersuchen, die an der neutrophilen Polarisation beteiligt sind.Da Neutrophile kurzlebig sind, ist es notwendig, alle Schritte so schnell wie möglich durchzuführen und Neutrophile während des gesamten Eingriffs kalt zu halten. Diese Technik ebnet den Weg für die Untersuchung der intrazellulären Mechanismen und Faktoren, die an der Regulierung angiogener und tumoriogener Eigenschaften tumorassoziierter Neutrophilen in vivo beteiligt sind.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Die Colon-26-Karzinom Tumor-tragenden Maus als Modell für die Untersuchung von Krebs Kachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Erkennung von Mitochondrien-Membran-Potential, CLIC4 Knockdown-induzierte HN4 Zelle Apoptosis In-vitro- Studie

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...