Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

私たちの仕事は、ドイツのクレブシルフ、助成金番号:111647、ドイツ研究評議会(DFG)、助成番号:JA 2461/2-1からの助成金によって支えられました。

動物の被験者を含むすべての手順は、規制当局によって承認されています:LANUV(ランデサムト・フュール・ナチュラル、ウムウェルト・ウンド・ヴェルブラウシュツNRW)とレジエルンスプラシジウム・テュービンゲン。すべての操作は、滅菌試薬と器具(注射器、はさみ、鉗子、使い捨てメス、ペトリ皿)を使用して、滅菌条件(層状流フードの下で)で行われるべきです。
注: ...

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	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

外科的および薬理学的癌治療の進歩にもかかわらず、成功した治療は挑戦のままである。免疫細胞は腫瘍増殖の調節に重要な役割を果たすることが知られているので、このような細胞の腫瘍原性を阻害する新しい方法を確立する必要があります。ここでは、抗血管新生腫瘍関連好中球の養子転移を介して腫瘍増殖を抑制する新しいアプローチを示す。TANにおける血管新生性NAMPTシグナル伝達?...

タイプIインターフェロン(IFN)は、新生物に対する宿主応答の刺激において重要な役割を果たし、タイプI IFNシグナル伝達の欠如は腫瘍増殖を有意に上昇させる1.このプロセスに関与するメカニズムの1つは、腫瘍関連好中球の腫瘍活性の調節であり、これはコロニー刺激因子3受容体(CSF3R)下流シグナル伝達2によって制御される。コロニー刺激因子3(CSF3)、または顆粒球コロニー刺激因子は、ニコチンアミドホスオリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)3、4を含むシグナル伝達を活性化することが示された。NAMPTは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド合成のためのレート制限酵素であり、これは糖分解を増強し、DNA修復、遺伝子発現、および癌細胞の生存および増殖を促進するストレス応答を調節する5。NAMPTは、大腸、卵巣、乳房、胃、前立腺癌および神経膠腫6を含む複数の癌タイプで過剰発現される。NAMPTは、腫瘍細胞だけでなく、骨髄細胞などの腫瘍に存在する他の多種多様な細胞型に不可欠であり、その分化を促進し、アポトーシスを阻害し、複数のサイトカインの発現を刺激するか、マクロファージ7におけるマトリックス分解酵素。
腫瘍関連好中球は、腫瘍増殖の重要な調節因子を表す。TAN機能は、これらのサイトカインが好中球の主要な抗腫瘍活性として、I型IFNの利用可能性に強く依存する。反対に、IFNの不在は、これらの細胞、特に血管新生作用の腫瘍性活性化を支持する。これに合致して、IFNに欠損したマウスは、腫瘍/陽間異性好中球1、2、8、および強く浸潤している有意に大きく、より良い血管腫瘍を発症する。9,10.重要なことに、このような血管新生TANはNAMPTの活性の上昇を示し、好中球の腫瘍偏光にその重要な役割を示唆している。
Ly6G抗体を用いた好中球の枯渇またはそれらの移行の阻害(CXCR2抗体)は、腫瘍血管新生、増殖、および転移1、8の減少をもたらす。それにもかかわらず、生成されたモノクローナル抗体は免疫原性であり、その投与は生命を脅かす副作用の範囲と関連している11。好中球腫瘍原性を調節するNAMPT阻害剤FK866などの低分子による治療は、そのような合併症を回避するのに役立つ可能性がある。残念ながら、NAMPTの薬理学的全身阻害は、腫瘍増殖に対するその治療効果の隣に、胃腸毒性および血小板減少症を含む重篤な副作用をもたらす。したがって、NAMPT阻害剤の全身的な適用は、12、13、14では実現可能ではない。
このため、ここでは、NAMPT アクティビティが分離された TAN で直接ブロックされるプロトコルを提案します。このような抗腫瘍好中球は、次に、腫瘍担持宿主に採用的に伝達される。このプロトコルは、化合物の全身毒性副作用を回避するのに役立ちます, 標的細胞への影響が持続しながら、.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

腫瘍形成の調節に対する好中球の寄与が注目を集めている。これらの細胞は不均一であり、腫瘍に応じて、プロまたは抗腫瘍能力を有することができる。腫瘍コンテキストにおける好中球機能を調節する重要なサイトカインの1つは、I型インターフェロンである。インターフェロンの存在下では、好中球は、細胞毒性または免疫系の刺激を含む抗腫瘍特性を得る。逆に、インターフェロンシグナル伝達の欠如は顕著なプロ腫瘍活性をもたらす、腫瘍血管新生の強い刺激を特徴とする。最近、好中球の血管新生作用は、これらの細胞におけるニコチンアミドリンオリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)シグナル伝達経路の活性化に依存することを実証することができた。腫瘍関連好中球におけるこの経路の阻害は、それらの強力な抗血管新生表現型をもたらす。ここでは、新たに確立されたモデルを実証し、腫瘍関連好中球(TAN)の腫瘍性電位の生体内評価を可能にする。まもなく、腫瘍に関連する腫瘍関連好中球は、腫瘍担持性インターフェロン欠損マウスから単離し、NAMPTシグナル伝達の遮断によって抗血管新生表現型に再分極することができる。これらの細胞の血管新生活性は、その後、大動脈環アッセイを用いて評価することができる。抗血管新生TANは、腫瘍を有する野生型レシピエントに転移することができ、腫瘍の増殖を14日間監視する必要があります。14日目にマウスを屠殺し、腫瘍を除去し、血管を評価して切断する。全体として、我々のプロトコルは、人工好中球細胞株モデルを使用する必要なしに、腫瘍関連好中球などの一次細胞の血管新生容量を生体内で評価するための新しいツールを提供する。Vc

ここで説明する手順を用いて、Ifnar1-/-好中球を腫瘍から単離し、2時間のNAMPT阻害剤FK866で処理した未処理のIfnar1-/-好中球を対照として用いた。治療の効果は、血管新生に関与する主要なステップ(マトリックス分解、移行、増殖、再編成)を反映する大動脈環状アッセイを用いて評価した。FK866処理された好中球は、未処理細胞と比較して大...

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Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

ここで、腫瘍担持マウスへの移植後の抗血管新腫腫瘍関連好中球の治療可能性を示す。このプロトコルは、好中球活性ex vivoを操作し、その後、腫瘍の発達における生体内でその機能性を評価するために使用することができる。これは、潜在的な好中球ベースの免疫療法を研究するための適切なモデルです。

操作された腫瘍関連好中球を腫瘍性マウスに移植し、生体内の血管新生電位を研究する

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

我々のプロトコルは人工好中球細胞株モデルを使用する必要なしに生体内の腫瘍関連の一次好中球の血管新生潜在能力を評価するための新しいツールを提供する。ニコチンアミドホスホリボシルトランスセパーゼの直接阻害は、腫瘍関連好中球における腫瘍関連好中球における腫瘍関連性動物へのその後の導入移入により、全身性毒性副作用を伴わない好中球の操作を可能にする。異なるがんモデルにおける好中球ベースの免疫療法の可能性を研究するために、腫瘍を含む宿主に移管した後に操作された抗血管新生腫瘍関連好中球の治療可能性を実証する。同種腫瘍マウスモデルを設定するには、10 8〜12週齢の女性インターフェロンアルファとβ受容体サブユニット1ノックアウトマウスの皮膚を電気剃りで剃り、70%エタノールで皮膚を消毒し、 その後、0.4 by 19ミリメートルの針を装備した1ミリリットルの注射器でPBSのミリリットル当たり6つのB16F10黒色腫細胞に3倍10をロードし、各剃った各剃り口に後部側面に100マイクロリットルの懸濁液を皮下注射して注入する動物。好中球養子転写の場合、B16F10メラノーマ細胞をPBS中のミリリットル当たり6倍の10〜6番目の細胞に希釈し、NAMPT阻害剤FK866で処理した好中球をPBS濃度の1ミリリットル当たり5番目の細胞に6倍に希釈する。次に、非処置または阻害剤処理された好中球を黒色腫細胞と1:10の好中球対腫瘍比で混合し、皮下100マイクロリットルの細胞を1群当たり最大5匹のマウスに注入する。注射後、注射された雌マウスを1つのケージに入れ、キャリパーを使用して毎日14日間腫瘍の長さ、幅、深さを測定します。注射後14日目に、注入された各動物の皮膚を70%エタノールで消毒し、はさみと鉗子を使用して、氷の上に完全な媒体を含む50ミリリットルの円錐管に腫瘍を収穫する。組織学的分析のために腫瘍を切除するには、腫瘍を最適な切断温度化合物に沈め、液体窒素中のサンプルを氷結させてマイナス80°Cで貯蔵する。断面の日に、5マイクロメートルのセクションを得るためにクライオトームを使用する前に、マイナス20°Cにサンプルを解凍します。非特異的結合で固定した後、20°Cで1時間対象となる一次抗体を有する腫瘍組織切片を染色し、続いてPBSで3回のスッシュを行う。最後の洗浄後、DAPIのような核染色染色体に適した蛍光結合二次抗体を光から保護した摂氏20度で1時間染色します。インキュベーションの終わりに、無水の取り付け媒体でサンプルを取り付ける前に光から保護された20°Cでスライドを20分間乾燥させ、次にカバースリップで各スライドを覆い、取り付け媒体が37°Cで1時間乾燥してから、蛍光顕微鏡で組織をイメージングします。腫瘍関連好中球分離の場合、収穫時に滅菌された6ウェルプレートの個々の井戸に井戸あたり5つの腫瘍を配置し、滅菌はさみを使用して腫瘍を2〜3ミリメートルにミンチする。次に、1ミリリットルのディスパーゼコラゲナーゼd DNASe 1溶液で1ミリリットルのジスパーゼd DNAse 1溶液を湿度5%の二酸化炭素で摂氏37度で45分間消化し、15分ごとに10ミリリットルのシリンジとサンプルを混合する。インキュベーションの最後に、100マイクロメートルのストレーナーを通して15ミリリットルのチューブにフィルターを入れ、未消化の繊維を取り除き、PBSを15ミリリットルの最終体積に加えます。遠心分離によって解光細胞を収集し、チューブあたり1ミリリットルのライシスバッファーで赤血球をライスします。混合後、各チューブの内容物を15ミリリットルのチューブに組み合わせ、2分後に完全な4°Cの培地で11ミリリットルで反応を停止します。遠心分離後、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、氷上で15分間、Fcブロック抗体の3マイクロリットルで任意の非特異的結合をブロックします。インキュベーションの終了時に、抗CD11bおよびLy6G抗体および他の目的の抗体、およびDAPIを用いて、光から保護された氷上で30分間インキュベーションを行う。インキュベーションの終わりに、 細胞をPBSの14ミリリットルで洗浄し、氷上の新鮮な完全な媒体濃度のミリリットル当たり10倍の7番目の細胞にペレットを1回10回再懸濁し、標準的な選別プロトコルに従ってCD11b陽性、Ly6G、高DAPI陰性好中球を蛍光活性化細胞選別機で選別し、その流れの端で単離された好中球の純度をチェックする。インビトロ腫瘍関連好中球阻害の場合、種子1.5倍10〜5番目の好中球を96ウェルU-底板の2つの井戸のそれぞれに分類し、FK866を完全な培地中の100ナノモルの最終濃度に加え、完全な培地の体積を他方のウェルに均等にする。培養インキュベーターで2時間経過した後、細胞をPBSで2回洗浄し、その後の注射に適した濃度でPBS中のペレットを再懸濁した。NAMPT阻害剤は、治療された好中球は、未処理の細胞と比較して大動脈枝形成を刺激する能力を有意に低下させる。さらに、阻害剤処理抗血管新好中球の皮下注射は、未処理のインターフェロンαおよびβ受容体サブユニット1ノックアウト好中球を注射したマウスと比較して腫瘍増殖に有意な障害を誘発する。抽出された腫瘍の組織学的検査は、未治療のノックアウト好中球を注射したものと比較して、阻害剤治療された腫瘍関連好中球で治療されたマウスから単離された腫瘍における血管新生の有意な抑制をさらに確認する。FK866処理された腫瘍関連好中球の特性を評価するために、定量PCRおよびウェスタンブロットは、好中球分極に関与する細胞内経路の活性化を研究するために行うことができる。好中球は短命であるため、すべてのステップをできるだけ早く実行し、全手順中に好中球を冷たく保つ必要があります。この技術は、生体内の腫瘍関連好中球の血管形成および腫瘍形成特性の調節に関与する細胞内メカニズムおよび因子の研究に道を開く。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

大腸-26癌腫瘍を有するがん悪液質の研究のためのモデルとしてマウスを

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリー ナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

マウスの腫瘍増殖を減少させるマイクロRNAの生体内阻害

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Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

ゼブラフィッシュ腫瘍異種移植片における宿主血管新生応答の生体内イメージングと定量

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...