Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

우리의 일은 도이치 크렙실페의 보조금에 의해 지원되었다, 보조금 번호: 111647, 독일 연구 위원회 (DFG), 보조금 번호: JA 2461/2-1.

동물 과목을 포함한 모든 절차는 규제 당국에 의해 승인되었습니다: LANUV (란데삼트 퓌르 나투르, 움웰트 und Verbraucherschutz NRW) 및 Regierungspräsidium 튀빙겐, 독일. 모든 조작은 멸균 시약 및 기기 (주사기, 가위, 집게, 일회용 메스, 페트리 접시)를 사용하여 멸균 조건 (층류 흐름 후드 아래)에서 수행해야합니다.
참고: 프로토콜의 전체 구성표는 그림1에 나와 ?...

<ol>
	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

외과 및 약리암 치료의 진행에도 불구하고 성공적인 치료는 여전히 도전과제로 남아 있습니다. 면역 세포는 종양 성장의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 세포의 종양 발생을 억제하는 새로운 방법이 확립되어야 한다. 여기에서 우리는 항 혈관신생 종양 관련 호중구의 입양 전달을 통해 종양 성장을 억제하는 새로운 접근법을 입증한다. FK866 억제제를 사용하여 탄에...

타입 I 인터페론(IFN)은 신생물에 대한 숙주 반응의 자극에 중요한 역할을 하며, I형 IFN 신호의결여는 종양 성장을 현저히 상승시키는 결과이다 1. 이 과정에 관여하는 메커니즘 중 하나는 종양 관련 호중구의 종양 성 활성의 조절이며, 이는 콜로니 자극 인자 3 수용체 (CSF3R) 다운스트림 신호에 의해 제어된다. 콜로니-자극 인자 3(CSF3) 또는 과립구 콜로니-자극 인자, 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)를 포함하는시그널링을 활성화시키는 것으로 나타났다 3,4. NAMPT는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 합성을 위한 속도 제한 효소로서, 이는 글리콜분해를 강화하고 DNA 수리, 유전자 발현 및 스트레스 반응을 조절하여 암세포의 생존및 증식을 촉진시킨다. 5. NAMPT는 대장, 난소, 유방, 위, 전립선암 및 글리오마 6을 포함하는다중 암 모형에서 과발현됩니다. NAMPT는 종양 세포뿐만 아니라 골수성 세포와 같은 종양에 존재하는 다양한 다른 세포 유형에 필수적입니다 - 그것은그들의 분화 4를 구동하고, 세포 자멸을 억제하고 다중 사이토카인의 발현을 자극하거나 대식세포에서 매트릭스 분해 효소7.
종양 관련 호중구는 종양 성장의 중요한 변조기를 나타냅니다. TAN 함수는 이들 사이토카인이 호중구의 항종양 활성을 주요화함에 따라 I IFN 유형의 가용성에 강하게 의존한다. 반대로 IFN의 부재는 이러한 세포, 특히 친 혈관 신생 특성의 종양 성 활성화를 지원합니다. 이에 동의하여 IFN결핍 마우스는 상당히 크고 더 나은 혈관화 종양을 개발하며, 이는 종양/친혈관성 호중구1, 2,8, 9,10. 중요한 것은, 이러한 친 혈관신생 TAn은 NAMPT의 높은 활성을 보여주며, 호중구의 종양 편광에 필수적인 역할을 시사합니다.
Ly6G 항체를 이용한 호중구의 고갈 또는 이들의 이동(CXCR2 항체)의 억제는 종양 혈관신생, 성장 및 전이 감소를 초래하는1,8. 그럼에도 불구하고, 생성된 단일클론 항체는 면역원성이며, 이들의 투여는 생명을 위협하는다양한 부작용(11)과 연관된다. 호중구 종양발생성을 조절하는 NAMPT 억제제 FK866과 같은 소분자를 치료하는 것은 그러한 합병증을 피하는 데 도움이 될 수 있다. 불행히도, 종양 성장에 대한 치료 효과 옆에 있는 NAMPT의 약리학적 전신 억제는 위장 독성 및 혈소판 감소증을 포함한 심각한 부작용을 초래한다. 따라서 NAMPT 억제제의 전신 적용은12,13,14.
이러한 이유로 NAMPT 활동이 격리된 TAN에서 직접 차단되는 프로토콜을 제안합니다. 이러한 항종양 호중구는 종양 베어링 숙주로 채택적으로 전달됩니다. 이 프로토콜은 화합물의 전신 독성 부작용을 피하는 데 도움이 될 것입니다., 대상 세포에 미치는 영향은 지속 될 것 이다 하는 동안.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

종양 발생의 조절에 호중구의 기여는 증가 관심을 받고있다. 이들 세포는 이질적이며, 종양에 따라 milieu는 프로-또는 항종양 용량을 보유할 수 있다. 종양 문맥에서 호중구 기능을 조절하는 중요한 사이토카인 중 하나는 타입 I 인터페론이다. 인터페론이있는 경우 호중구는 세포 독성 또는 면역 계통의 자극을 포함한 항 종양 특성을 얻습니다. 반대로, 인터페론 신호의 부재는 종양 혈관 신생의 강한 자극을 특징으로하는 눈에 띄는 프로 종양 활성을 초래합니다. 최근, 우리는 호중구의 친 혈관 신생 특성이 이들 세포에서 니코틴아미드 포스포리보실 트랜스퍼라제 (NAMPT) 신호 전달 경로의 활성화에 의존한다는 것을 입증 할 수 있었다. 종양 관련 호중구에서이 통로의 억제는 강력한 항 혈관 신생 표현형으로 이어집니다. 여기에서, 우리는 조작된 종양 관련 호중구 (TAN)의 종양성 잠재력의 생체 내 평가를 허용하는 우리의 새로 확립된 모형을 설명합니다. 곧, 프로-혈관신생 종양 관련 호중구는 종양 베어링 인터페론 결핍 마우스로부터 분리되고 NAMPT 신호의 차단에 의해 항 혈관신생 표현형으로 재편분화될 수 있다. 이들 세포의 혈관신생 활성은 대동맥 고리 분석술을 사용하여 이후에 평가될 수 있다. 항-혈관신생 TAN은 종양을 지탱하는 야생형 수용자로 옮겨질 수 있으며 종양 성장은 14일 동안 모니터링되어야 한다. 일째에 14 마우스는 희생되고, 종양은 그들의 혈관세포로 제거되고 절단됩니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜은 인공 호중구 세포주 모델을 사용할 필요 없이 종양 관련 호중구와 같은 1차 세포의 혈관신생 용량을 생체 내에서 평가하는 새로운 도구를 제공한다. Vc

여기에 기재된 절차를 사용하여, Ifnar1---- 호중구는 종양으로부터 분리되었고, 2시간 동안 NAMPT 억제제 FK866으로 처리하였다. 치료의 효과는 혈관 신생 (매트릭스 분해, 이동, 증식, 재구성)에 관련된 주요 단계를 반영하는 대동맥 고리 분석술을 사용하여 평가되었다. 우리는 FK866 처리된 호중구가 치료되지 않은 세포에 비해 대동맥 분지 형성?...

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Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

여기에서, 우리는 종양 을 지탱하는 마우스로의 그들의 전송 후에 항 혈관신생 종양 관련 호중구의 치료 잠재력을 보여줍니다. 이 프로토콜은 생체외 호중구 활성을 조작하고 이후에 종양 을 개발하는 생체 내에서 그들의 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 그것은 잠재적인 호중구 기지를 둔 면역 요법을 공부를 위한 적당한 모형입니다.

조작된 종양 관련 호중구를 종양 베어링 마우스로 옮겨 생체 내 혈관신생 잠재력을 연구합니다.

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

우리의 프로토콜은 인공 호중구 세포주 모델을 사용할 필요없이 생체 내에서 종양 관련 1 차 호중구의 혈관 신생 잠재력을 평가하기위한 새로운 도구를 제공합니다. 니코티나미드 인지질 전달효소의 직접적인 억제는 종양-관련 호중구에서 종양 을 낳는 동물로의 후속 입양 전달으로 전신 독성 부작용 없이 호중구를 조작할 수 있게 한다. 우리는 다른 암 모형에 있는 잠재적인 호중구 기지를 둔 면역 요법의 연구 결과에 대한 종양 베어링 호스트로 전송한 후에 조작된 항 혈관형성 종양 관련 호중구의 치료 잠재력을 보여줄 것입니다.동종 종양 마우스 모델을 설정하려면, 10 8- 12주 된 암컷 인터페론 알파 및 베타 수용체 하위 유닛 1 녹아웃 마우스를 전기 면도기로 면도하고 70%에탄올로 피부를 소독하고, 그런 다음 PBS밀리리터 당 6개의 B16F10 흑색종 세포에 0.4 x 19밀리미터 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기에 3번 10번 로드하고, 각 면도에 후면 측면에 피하현의 100 마이크로리터를 주입합니다. 동물. 호중구-입양 전이의 경우, B16F10 흑색종 세포를 PBS의 밀리리터 농도당 6배 10으로 희석하고, NAMPT 억제제 FK866으로 치료된 호중구를 PBS 농도의 밀리리터당 5번째 세포당 6배 10으로 희석한다. 그런 다음, 치료되지 않은 또는 억제제 처리된 호중구를 1:10의 호중구-종양 비율로 혼합하고 1군당 최대 5마리의 마우스로 세포의 100마이크로리터를 피하한다.주사 후, 단일 케이지에 최대 5개의 주입된 암컷 마우스를 배치하고 14일 동안 매일 종양 길이, 폭 및 깊이를 측정하기 위해 캘리퍼를 사용합니다. 주사 후 14 일째에, 70%에탄올로 각 주입된 동물의 피부를 소독하고 가위와 집게를 사용하여 종양을 얼음에 완전한 배지를 함유한 50밀리리터 원추형 튜브로 수확합니다. 조직학적 분석을 위해 종양을 절제하기 위해 최적의 절삭 온도 화합물에 종양을 잠그고 영하 80도에서 저장을 위해 액체 질소로 샘플을 동결한다.단면의 날에는 저온을 사용하여 5마이크로미터 섹션을 얻기 전에 샘플을 영하 20도까지 해동합니다. 비특이적 결합에 고정한 후, 20°C에서 1시간 동안 관심있는 1차 항체를 가진 종양 조직 섹션을 얼룩지게 하고 PBS에서 3개의 세차재가 뒤따릅니다. 마지막 세척 후, 빛으로부터 보호되는 섭씨 20도에서 DAPI와 같은 핵 염색염에 적절한 형광-컨쥬게이징이 있는 이차 항체로 세포를 얼룩지게 한다.인큐베이션의 끝에서, 무수 장착 매체로 샘플을 장착하기 전에 빛으로부터 보호 되는 섭씨 20도에서 20 분 동안 슬라이드를 건조한 다음 각 슬라이드를 덮개 슬립으로 덮고 형광 현미경 으로 조직을 이미징하기 전에 섭씨 37도에서 1 시간 동안 마운팅 매체를 건조시키십시오. 종양 관련 호중구 절연을 위해, 멸균 6웰 플레이트의 개별 우물에 잘 5개의 종양을 넣고 멸균 가위를 사용하여 종양을 2~3mm 조각으로 다진다. 다음으로, 디스파스 콜라게나아제 d dnase 1 용액의 1밀리리터로 종양 조각을 습도가 5%의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 45분 동안 소화하여 샘플을 15분마다 10밀리리터 주사기와 혼합합니다.인큐베이션의 끝에서, 100 마이크로미터 스트레이너를 통해 세포를 잘 15 밀리리터 튜브로 필터링하여 소화되지 않은 섬유를 제거하고 15 밀리리터의 최종 부피에 PBS를 추가합니다. 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집하고 튜브 당 용해 완충제의 1 밀리리터로 적혈구를 용인한다. 혼합 후 각 튜브의 내용을 단일 15 밀리리터 튜브에 결합하여 2 분 후에 완전한 섭씨 4도 의 11 밀리리터로 반응을 멈춥춥시다.원심 분리 후, PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 15 분 동안 Fc 블록 항체의 세 마이크로 리터와 비 특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 항 CD11b 및 Ly6G 항체 및 관심있는 다른 항체, 플러스 DAPI로 세포를 표시, 빛으로부터 보호 얼음에 30 분 인큐베이션. 인큐베이션의 끝에서, PBS의 14 밀리리터에서 세포를 세척하고 얼음에 대한 신선한 완전한 중간 농도의 밀리리터 당 7 세포에 10 번 10에서 펠릿을 다시 중단한 다음, 표준 선별 프로토콜에 따라 CD11b 양성, Ly6G, 높은 DAPI 음성 호중구를 형광 활성화 셀러에 정렬하여 세포에 절연 된 세포체의 순도를 확인합니다.체외 종양 관련 호중구 억제를 위해, 종자 1.5 배 10 다섯 번째 정렬 호중구 96-잘 U-바닥 플레이트의 두 개의 우물각각에 FK866을 추가하고 하나의 우물로 완전한 배지와 다른 우물에 혼자 완전한 배지의 동등한 부피로 100 나노 몰라의 최종 농도에 FK866을 추가한다. 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 후, PBS로 세포를 두 번 세척하고 후속 주입에 적합한 농도로 PBS에서 펠릿을 재보중단한다. NAMPT-억제제 처리 호중구는 치료되지 않은 세포에 비해 대동맥 분기 형성을 자극하는 능력이 현저히 감소한다.또한, 억제제-처리된 항혈관신생 호중구의 피하 주사는 치료되지 않은 인터페론 알파 및 베타 수용체 하위유닛 1 녹아웃 호중구로 주입된 마우스에 비해 종양 성장에 상당한 손상을 유도한다. 추출된 종양의 조직학적 검사는 치료되지 않은 녹아웃 호중구를 주입한 종양에 비해 억제제 처리된 종양 관련 호중구로 치료된 마우스로부터 분리된 종양에서 혈관신생의 현저한 억제를 더욱 확인한다. FK866 처리된 종양 관련 호중구의 특성을 평가하기 위해, 정량적인 PCR 및 웨스턴 블롯은 호중구 편광에 관여하는 세포내 통로의 활성화를 연구하기 위해 수행될 수 있다.호중구는 수명이 짧기 때문에 가능한 한 빨리 모든 단계를 수행하고 전체 절차 중에 호중구를 차갑게 유지할 필요가 있습니다. 이 기술은 생체 내에서 종양 관련 호중구의 혈관신생 및 종양 생성 특성의 조절에 관여하는 세포 내 메커니즘 및 요인에 대한 연구를 위한 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

연구

암 연구학

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

콜론-26 암 종양 베어링 암 악액질의 연구를위한 모델로 마우스를

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

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식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

샘플 추출 및 독 소 루비와 미토마이신 C 다음 약물 조합을 전달 나노 입자에 종양 방위 쥐의 동시 크로마 정량

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

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CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...