Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Nuestro trabajo fue apoyado por subvenciones de Deutsche Krebshilfe, Número de Concesión: 111647, y Consejo Alemán de Investigación (DFG), Número de Subvención: JA 2461/2-1.

Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, han sido aprobados por las autoridades reguladoras: LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) y Regierungspr-sidium T-bingen, Alemania. Todas las manipulaciones deben realizarse en condiciones estériles (bajo campana de flujo laminar) utilizando reactivos e instrumentos estériles (jeringas, tijeras, fórceps, bisturíes desechables, platos Petri).
NOTA: El esquema general del protocolo se muestra en la <strong clas...

<ol>
	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

A pesar de los progresos en el tratamiento quirúrgico y farmacológico del cáncer, la terapia exitosa sigue siendo un desafío. Dado que se sabe que las células inmunitarias desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento tumoral, deben establecerse métodos novedosos que inhibidoran la tumorigeniidad de dichas células. Aquí demostramos un enfoque novedoso para suprimir el crecimiento tumoral a través de la transferencia adoptiva de neutrófilos asociados a tumores anti-angiogénicos. La focalizac...

Los interferones tipo I (IFN) desempeñan un papel importante en la estimulación de las respuestas del huésped a las neoplasias, ya que la falta de señalización IFN de tipo I da como resultado un crecimiento tumoral significativamente elevado1. Uno de los mecanismos involucrados en este proceso es la regulación de la actividad tumorigénica de los neutrófilos asociados a tumores, que es controlada por el receptor del factor 3 estimulante de la colonia (CSF3R) señalización aguas abajo2. Se demostró que el factor 3 estimulante de colonias (CSF3), o factor estimulante de colonias de granulocitos, activa la señalización que implica nicotinamida fosfosibositransferasa (NAMPT)3,4. NAMPT es una enzima limitante de la tasa para la síntesis de dinucleótidos de adenina nicotinamida, que mejora la glucólisis y regula la reparación del ADN, la expresión génica y la respuesta al estrés promoviendo la supervivencia y proliferación de las células cancerosas5. NAMPT está sobreexpresado en múltiples tipos de cáncer, incluyendo colorrectal, ovario, mama, gástrico, cáncer de próstata y gliomas6. NAMPT es esencial no sólo para las células tumorales, sino también para una amplia variedad de otros tipos de células que están presentes en los tumores, tales como las células mieloides - impulsa su diferenciación4, inhibe la apoptosis y estimular la expresión de múltiples citoquinas o enzimas degradantes de matriz en macrófagos7.
Los neutrófilos asociados a tumores representan moduladores importantes del crecimiento tumoral. Las funciones TAN dependen en gran medida de la disponibilidad de IFN de tipo I, ya que estas citoquinas prima de la actividad antitumoral de los neutrófilos. Por el contrario, la ausencia de IFN apoya la activación tumorigénica de estas células, especialmente sus propiedades pro-angiogénicas. De acuerdo con esto, los ratones deficientes en IFN desarrollan tumores vascularizados significativamente más grandes y mejores, que están fuertemente infiltrados con neutrófilos protumorales/pro-angiogénicos1,2,8, 9,10. Es importante destacar que estos TAN pro-angiogénicos muestran una actividad elevada de NAMPT, lo que sugiere su papel esencial en la polarización protumoral de los neutrófilos.
El agotamiento de neutrófilos utilizando anticuerpos Ly6G o la inhibición de su migración (anticuerpo CXCR2) da como resultado una disminución de la angiogénesis tumoral, el crecimiento y la metástasis1,8. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales generados son inmunogénicos, y su administración se asocia con una serie de efectos secundarios potencialmente mortales11. El tratamiento con moléculas pequeñas, como el inhibidor de NAMPT FK866, que modulan la tumoriogenicidad de los neutrófilos, podría ayudar a evitar tales complicaciones. Desafortunadamente, inhibición sistémica farmacológica de NAMPT, junto a su efecto terapéutico sobre el crecimiento tumoral, conduce a efectos secundarios graves incluyendo toxicidad gastrointestinal y trombocitopenia. Por lo tanto, la aplicación sistémica de los inhibidores NAMPT no es factible12,13,14.
Por esta razón, sugerimos aquí un protocolo donde la actividad NAMPT se bloquee directamente en los TAN aislados. Estos neutrófilos antitumorales se transfieren de forma adoptiva a un huésped portador de tumores. Este protocolo ayudará a evitar efectos secundarios tóxicos sistémicos de los compuestos, mientras que su efecto sobre las células diana se mantendrá.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

La contribución de los neutrófilos a la regulación de la tumorigenesis está recibiendo mayor atención. Estas células son heterogéneas, y dependiendo del entorno tumoral puede poseer capacidad pro o antitumoral. Una de las citoquinas importantes que regulan las funciones neutrófilas en un contexto tumoral son los interferones de tipo I. En presencia de interferones, los neutrófilos adquieren propiedades antitumorales, incluyendo citotoxicidad o estimulación del sistema inmunitario. Por el contrario, la ausencia de una señalización de interferón da lugar a una actividad protumoral prominente, caracterizada por una fuerte estimulación de la angiogénesis tumoral. Recientemente, podríamos demostrar que las propiedades pro-angiogénicas de los neutrófilos dependen de la activación de la vía de señalización de nicotinamida fosforibosiltransferasa (NAMPT) en estas células. La inhibición de esta vía en neutrófilos asociados a tumores conduce a su potente fenotipo anti-angiogénico. Aquí, demostramos nuestro modelo recientemente establecido que permite la evaluación in vivo del potencial tumorigénico de neutrófilos asociados a tumores manipulados (TAN). En poco tiempo, los neutrófilos pro-angiogénicos asociados a tumores pueden aislarse de ratones con deficiencia de interferón con tumores y repolarizarse en fenotipo antiangiogénico mediante el bloqueo de la señalización NAMPT. La actividad angiogénica de estas células se puede evaluar posteriormente mediante un ensayo de anillo aórtico. Los TAN antiangiogénicos se pueden transferir a receptores de tipo silvestre portadores de tumores y se debe controlar el crecimiento tumoral durante 14 días. En el día 14 ratones son sacrificados, los tumores se extirpan y se cortan con su vascularización evaluada. En general, nuestro protocolo proporciona una herramienta novedosa para evaluar in vivo la capacidad angiogénica de las células primarias, como los neutrófilos asociados a tumores, sin necesidad de utilizar modelos de líneas celulares de neutrófilos artificiales. Vc

Utilizando el procedimiento descrito aquí, los neutrófilos Ifnar1-/- fueron aislados de tumores y tratados con el inhibidor de NAMPT FK866 durante 2 h. Se utilizaron como control los neutrófilos No tratados Ifnar1-/-. La efectividad del tratamiento se evaluó utilizando el ensayo del anillo aórtico, que refleja los pasos clave involucrados en la angiogénesis (degradación de la matriz, migración, proliferación, reorganización). Podríamos ...

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Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Aquí, mostramos el potencial terapéutico de los neutrófilos anti-angiogénicos asociados a tumores después de su transferencia a ratones portadores de tumores. Este protocolo se puede utilizar para manipular la actividad de neutrófilos ex vivo y para evaluar posteriormente su funcionalidad in vivo en el desarrollo de tumores. Es un modelo adecuado para estudiar posibles inmunoterapias basadas en neutrófilos.

Transferencia de neutrófilos asociados a tumores manipulados a ratones portadores de tumores para estudiar su potencial angiogénico en Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Nuestro protocolo proporciona una herramienta novedosa para evaluar el potencial angiogénico de los neutrófilos primarios asociados al tumor in vivo sin la necesidad de utilizar modelos de líneas celulares de neutrófilos artificiales. La inhibición directa de la nicotinamida fosforibosiltransferasa, en breve NAMPT, en neutrófilos asociados al tumor con su posterior transferencia adoptiva a animales portadores de tumores permite la manipulación de neutrófilos sin efectos secundarios tóxicos sistémicos. Demostraremos el potencial terapéutico de los neutrófilos manipulados asociados al tumor anti-angiogénicos después de la transferencia a huéspedes portadores de tumores para el estudio de posibles inmunoterapias basadas en neutrófilos en diferentes modelos de cáncer.Para configurar un modelo de ratón tumoral alogénico, afeite la piel de 10 de ocho a 12 semanas de edad mujer interferón alfa y beta-receptor subunidad 1 knockout ratones con una afeitadora eléctrica y desinfectar la piel con 70%etanol, luego cargue tres veces 10 a las seis células de melanoma B16F10 por mililitro de PBS en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de 0,4 por 19 milímetros e inyecte 100 microlitros de la suspensión por vía subcutánea en un flanco trasero en cada afeitado Animal. Para la transferencia neutrófilo-adoptiva, diluir las células de melanoma B16F10 a seis veces 10 a la sexta célula por mililitro de concentración en PBS y neutrófilos diluidos tratados con inhibidor de NAMPT FK866 a seis veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración de PBS. Luego, mezcle neutrófilos no tratados o tratados con inhibidores con las células del melanoma en una proporción de neutrófilos a tumores de 1:10 e inyecte por vía subcutánea 100 microlitros de células en hasta cinco ratones por grupo.Después de las inyecciones, coloque hasta cinco ratones hembra inyectados en una sola jaula y use pinzas para medir la longitud, anchura y profundidad del tumor todos los días durante 14 días. En el día 14 después de la inyección, desinfecte la piel de cada animal inyectado con 70%etanol y use tijeras y fórceps para cosechar los tumores en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga un medio completo sobre hielo. Para secuestrar los tumores para el análisis histológico, sumerja los tumores en un compuesto de temperatura de corte óptimo y congele las muestras en nitrógeno líquido para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados.El día de la seccionamiento, descongele las muestras a menos 20 grados Celsius antes de usar un criotomo para obtener secciones de cinco micrómetros. Después de la fijación en la unión no específica, mancha las secciones del tejido tumoral con los anticuerpos primarios de interés durante una hora a 20 grados Celsius, seguido de tres lavados en PBS. Después del último lavado, manche las células con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado en un tinte de tinción nuclear como DAPI durante una hora a 20 grados centígrados protegidos de la luz.Al final de la incubación, seque los portaobjetos durante 20 minutos a 20 grados Celsius protegidos de la luz antes de montar las muestras con un medio de montaje anhidro, luego cubra cada diapositiva con un resbalón de cubierta y deje que el medio de montaje se seque durante una hora a 37 grados Celsius antes de tomar imágenes de los tejidos por microscopía fluorescencia. Para el aislamiento de neutrófilos asociados al tumor, coloque cinco tumores por pozo en pozos individuales de una placa estéril de seis pozos a medida que se cosechan y use tijeras estériles para picar los tumores en piezas de dos a tres milímetros. A continuación, digiere los fragmentos tumorales con un mililitro de solución de colágenoasa d dnase 1 de dispase durante 45 minutos a 37 grados Centígrados en un 5% de dióxido de carbono con humedad, mezclando las muestras con una jeringa de 10 mililitros cada 15 minutos.Al final de la incubación, filtre las células a través de coladores de 100 micrómetros en un tubo de 15 mililitros por pozo para eliminar las fibras no digeridos y añadir PBS a un volumen final de 15 mililitros. Recoger las células disociadas por centrifugación y análisis de los glóbulos rojos con un mililitro de tampón de lelisis por tubo. Después de mezclar, combine el contenido de cada tubo en un solo tubo de 15 mililitros, deteniendo la reacción después de dos minutos con 11 mililitros de medio completo de cuatro grados centígrados.Después de la centrifugación, resuspender el pellet en un mililitro de PBS y bloquear cualquier unión no específica con tres microlitros de anticuerpos Fc-block durante 15 minutos con hielo. Al final de la incubación, etiquete las células con anticuerpos anti-CD11b y Ly6G y cualquier otro anticuerpo de interés, más DAPI, para una incubación de 30 minutos sobre hielo protegido de la luz. Al final de la incubación, lavar las células en 14 mililitros de PBS y resuspender los pellets a una vez 10 a las séptimas células por mililitro de concentración media completa fresca en hielo, a continuación, ordene los neutrófilos CD11b positivos, Ly6G, altos daPI negativos en un clasificador de células activado por fluorescencia de acuerdo con los protocolos de clasificación estándar, comprobando la pureza de los neutrófilos aislados en el citómetro de flujo al final del tipo.Para la inhibición de neutrófilos asociados al tumor in vitro, la semilla 1,5 veces 10 al quinto neutrófilos clasificados en cada uno de los dos pocillos de una placa inferior en U de 96 pocillos y añadir FK866 a una concentración final de 100 nanomolares en medio completo en un pozo y un volumen igual de medio completo solo al otro pozo. Después de dos horas en la incubadora de cultivo celular, lavar las células dos veces con PBS y resuspender los pellets en PBS a la concentración adecuada para la inyección posterior. Los neutrófilos tratados con inhibidores de NAMPT tienen una capacidad significativamente menor para estimular la formación de ramas aórticas en comparación con las células no tratadas.Además, la inyección subcutánea de neutrófilos antiangiogénicos tratados con inhibidores induce un deterioro significativo en el crecimiento tumoral en comparación con los ratones inyectados con interferón alfa no tratado y neutrófilos de la subunidad del receptor beta 1 noutphils. El examen histológico de los tumores extraídos confirma además la supresión significativa de la angiogénesis en tumores aislados de ratones tratados con neutrófilos asociados al tumor tratados con inhibidores en comparación con los inyectados con neutrófilos noututidos no tratados. Para evaluar las propiedades de los neutrófilos asociados al tumor tratados con FK866, se pueden realizar PCR cuantitativos y Western Blot para estudiar la activación de las vías intracelulares implicadas en la polarización de neutrófilos.Dado que los neutrófilos son de corta duración, es necesario realizar todos los pasos lo más rápido posible y mantener a los neutrófilos fríos durante todo el procedimiento. Esta técnica allana el camino para el estudio de los mecanismos intracelulares y los factores involucrados en la regulación de las propiedades angiogénicas y tumorigénicas de los neutrófilos asociados al tumor in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

El Colon-26 Carcinoma portadores de tumores de ratón como modelo para el estudio del cáncer de caquexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Extracción de muestras y cuantificación cromatográfica simultánea de doxorrubicina y mitomicina C siguiendo la combinación del fármaco en nanopartículas en ratones con tumores

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detección del potencial de membrana de las mitocondrias CLIC4 HN4 inducida por la caída de la célula Apoptosis In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

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In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

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Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

En Vivo inhibición de MicroRNA para disminuir el crecimiento tumoral en ratones

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...