Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Çalışmalarımız Deutsche Krebshilfe, Grant numarası: 111647 ve Alman Araştırma Konseyi (DFG), Grant numarası: JA 2461/2-1 ' den gelen hibe tarafından destekleniyordu.

Hayvan konuları dahil tüm prosedürler düzenleyici yetkililer tarafından onaylanmıştır: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) ve Regierungspräsidium Tübingen, Almanya. Tüm manipülasyonlar steril reaktifler ve aletler (şırıngalar, makas, forseps, tek kullanımlık neşter, Petri Yemekleri) kullanılarak steril koşullarda (laminar akış kaputu altında) yapılmalıdır.
Not: protokol genel şeması Şekil 1' de gösterilir.</...

<ol>
	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

Cerrahi ve farmakolojik kanser tedavisinde ilerlemeye rağmen başarılı tedavi bir zorluk olarak kalır. Bağışıklık hücrelerinin tümör büyümesi düzenlenmesi önemli bir rol oynamak için bilinen bu yana, bu tür hücrelerin tümörleri inhibe yeni yöntemler kurulmalıdır. Burada, Anti-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofillerin evlatlık aktarımı yoluyla tümör büyümesini bastırmak için yeni bir yaklaşım gösteriyoruz. FK866 inhibitörü kullanarak TANs 'de Pro-anjiyojenik NAMPT sinyallerinin se?...

Tip ı Interferonlar (ıfns) neoplasias ana tepkiler stimülasyon önemli bir rol oynar, tip ı ıFN eksikliği önemli ölçüde yüksek tümör büyümesi sonuçları sinyal1. Bu süreçte yer alan mekanizmalardan biri, koloniye uyarıcı faktör 3 reseptör (CSF3R) aşağı sinyal2ile kontrol edilen tümör ilişkili nötrofiller, tümör-genetik aktivitesinin düzenlenmesi. Koloniye uyarıcı faktör 3 (CSF3) veya granülosit kolonisi uyarıcı faktör, nikotinamid phosphoribosyltransferase (nampt)3,4içeren sinyalizasyon etkinleşmeye gösterilmiştir. NAMPT, glikoliz geliştirir ve DNA onarımı, gen ifadesi ve stres tepkisi kanser hücrelerinin hayatta kalma ve proliferasyon teşvik düzenleyen nikotinamide adenin dinükleotit sentezini için bir oran sınırlayıcı enzimdir5. NAMPT, kolorektal, ovaryalı, meme, mide, prostat kanseri ve gliomas6dahil olmak üzere birden fazla kanser tipinde aşırı ifade edilir. NAMPT sadece tümör hücreleri için değil, aynı zamanda miyeloid hücreler gibi tümörlerde bulunan diğer hücre türlerinin geniş bir çeşitliliği için de önemlidir-onların farklılaşma4Sürücüler, apoptozis inhibe ve çoklu sitokinlerin ifade teşvik veya makrofajlar içinde matris-aşağılayıcı enzimler7.
Tümör ilişkili nötrofiller tümör büyümesinin önemli modülatörlerini temsil eder. BRONZLAŞMA fonksiyonları nötrofiller bu sitokinler Prime anti-tümör aktivitesi olarak, türü ı ıFN kullanılabilirlik güçlü bağlıdır. Aksine, ıfns yokluğunda bu hücrelerin tümör aktivasyonunu destekler, özellikle kendi yanlısı anjiyojenik özellikleri. Bununla anlaşmada, INS eksikliği fareler önemli ölçüde daha büyük ve daha iyi vaskülarize tümörlerin geliştirmek, hangi güçlü yanlısı tümörü ile sızan/Pro-anjiyojenik nötrofiller1,2,8, 9,10. Daha da önemlisi, bu tür Pro-anjiyojenik TANs NAMPT yüksek aktivite göstermek, nötrofiller Pro-tümör polarizasyon temel rolünü düşündürmektedir.
Nötrofiller Ly6G antikor veya göç inhibisyonu kullanarak tükenmesi (CXCR2 antikor) azalmış tümör anjiyogenez sonuçları, büyüme, ve metasjen1,8. Yine de, oluşturulan monoklonal antikorlar immunogenic, ve onların yönetimi yaşam tehdit yan etkileri bir dizi ile ilişkilidir11. Nötrofil tumoriogenicity modüle nampt inhibitörü FK866 gibi küçük moleküller ile tedavi, bu tür komplikasyonları önlemek için yardımcı olabilir. Ne yazık ki, NAMPT farmakolojik sistemik inhibisyonu, tümör büyümesi üzerinde terapötik etkisi yanında, gastrointestinal toksisite ve trombositopeni de dahil olmak üzere şiddetli yan etkilere yol açar. Bu nedenle, nampt inhibitörlerinin sistemik uygulanması mümkün değildir12,13,14.
Bu nedenle, burada NAMPT aktivitesinin doğrudan yalıtılmış TANs 'de engellendiği bir protokol öneriyoruz. Bu tür anti-tümör nötrofiller sonra adoptively bir tümör taşıyan ev sahibi aktarılır. Bu protokol, bileşiklerin sistemik toksik yan etkilerini önlemeye yardımcı olur, ancak hedef hücreler üzerindeki etkisi sürdürülecektir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

Nötrofiller, tümörijenezde düzenlenmesi katkısı artan dikkat çekiyor. Bu hücreler heterojen ve tümör ortama bağlı olarak yanlısı veya anti-tümör kapasitesine sahip olabilir. Tümör bağlamında nötrofil fonksiyonlarını düzenleyen önemli sitokinlerden biri ben interferonlar türüdür. İnterferonlar varlığında, nötrofil anti-tümör özellikleri kazanmak, sitotoksisite veya bağışıklık sisteminin stimülasyon dahil. Bunun tersi olarak, bir interferon sinyalinin eksikliği, tümör anjiyogenezinin güçlü stimülasyon ile karakterize belirgin Pro-tümör aktivitesinde sonuçlanır. Son zamanlarda, nötrofiller yanlısı anjiyojenik özelliklerinin bu hücrelerdeki nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) sinyalizasyon yolunun aktivasyonuna bağlı olduğunu gösterebiliriz. Tümör ilişkili nötrofiller bu yolun inhibisyonu onların güçlü anti-anjiyojenik fenotipi yol açar. Burada, yeni kurulan modelimizi, manipüle tümör ilişkili nötrofiller (Tans) ' nın tümörojenik potansiyelinin in vivo olarak değerlendirilmesine olanak tanıyarak gösteriyoruz. Kısa bir süre, Pro-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofiller tümör taşıyan interferon-eksikliği fareler izole edilebilir ve NAMPT sinyalizasyon bloke ederek Anti-anjiyojenik fenotipi içine repolarize. Bu hücrelerin anjiyojenik aktivite daha sonra bir aort halka tahlil kullanılarak değerlendirilebilir. Anti-anjiyojenik TANs tümör taşıyan vahşi tip alıcılara aktarılabilir ve tümör büyümesi 14 gün boyunca izlenmelidir. Günde 14 fare feda edilir, tümör kaldırıldı ve vazkülarizasyon ile kesilmiş değerlendirildi. Genel olarak, protokollerimiz, yapay nötrofil hücre hattı modellerini kullanmaya gerek kalmadan, tümör ilişkili nötrofiller gibi primer hücrelerin anjiyojenik kapasitesini değerlendirmek için yeni bir araç sağlar. Vc

Burada açıklanan prosedürü kullanarak, Ifnar1-/- nötrofiller tümörlerden izole edildi ve 2 h için nampt inhibitörü FK866 ile tedavi edildi. tedavi edilmemiş Ifnar1-/- nötrofiller bir kontrol olarak kullanıldı. Tedavinin etkinliği anjiyogenez (matris bozulması, göç, proliferasyon, yeniden yapılanma) içinde yer alan önemli adımları yansıtan aort halka tahlil kullanılarak değerlendirildi. FK866 tedavi nötrofiller, tedavi ed...

Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Burada, tümör taşıyan farelere transferinden sonra anti-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofiller terapötik potansiyelini gösteriyoruz. Bu protokol, nötrofil aktivitesini ex vivo olarak işlemek ve daha sonra tümörlerin geliştirilmesinde in vivo olarak işlevselliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Potansiyel nötrofil bazlı immünoterapileri incelemek için uygun bir modeldir.

Anjiogenik potansiyelinin In vivo çalışması için Işlenmiş tümör ilişkili Nötroflelerin tümör taşıyan fareler içine aktarılması

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Protokolümüz, yapay nötrofil hücre serisi modelleri kullanmaya gerek kalmadan in vivo in tümörilişkili primer nötrofillerin anjiyojenik potansiyelini değerlendirmek için yeni bir araç sağlamaktadır. Nikotinamid fosforibosiltransferaz doğrudan inhibisyonu, kısaca NAMPT, tümör taşıyan hayvanlara sonraki benimseyen transferi ile tümör ilişkili nötrofiller sistemik toksik yan etkileri olmadan nötrofillerin manipülasyon sağlar. Farklı kanser modellerinde potansiyel nötrofil bazlı immünoterapilerin incelenmesi için tümör taşıyan konaklara geçtikten sonra manipüle edilen anti-anjiyojenik tümör ilişkili nötrofillerin terapötik potansiyelini göstereceğiz.Allojenik tümör fare modeli kurmak için, 10-12 haftalık dişi interferon alfa ve beta-reseptör alt ünitesi 1 nakavt farelerin derisini elektrikli tıraş makineli olarak tıraş edin ve cildi %70 etanol ile dezenfekte edin, sonra pbs mililitre başına altı B16F10 melanom hücrelerine üç kez yükleyin bir mililitre şırınga bir mililitre şırınga ile donatılmış bir mililitre lik iğne ile 0.4 tarafından 19 milimetrelik iğne ve her tıraş içine bir arka kanadında süspansiyon subkutan 100 mikrolitre enjekte Hayvan. Nötrofil-benimseyen transfer için, PBS mililitre konsantrasyonu başına altı kez 10 B16F10 melanom hücreleri seyreltmek ve seyreltik nötrofiller NAMPT inhibitörü FK866 ile tedavi altı kez 10 PBS konsantrasyonu mililitre başına beşinci hücrelere. Daha sonra, tedavi edilmeyen veya inhibitör le tedavi edilen nötrofilleri 1:10 nötrofil-tümör oranında melanom hücreleriyle karıştırın ve deri altı 100 mikrolitre hücreyi grup başına en fazla beş fareye enjekte edin.Enjeksiyonlardan sonra, tek bir kafese beş kadar enjekte edilen dişi fare yerleştirin ve 14 gün boyunca her gün tümör uzunluğunu, genişliğini ve derinliğini ölçmek için kaliper kullanın. Enjeksiyondan sonra 14. Histolojik analiz için tümörleri kesmek için, tümörleri optimum kesme sıcaklığı bileşiğinde batırın ve eksi 80 santigrat derecede depolanması için numuneleri sıvı nitrojenle dondurun.Kesit günü, beş mikrometrelik kesitler elde etmek için bir kriyotom kullanmadan önce örnekleri eksi 20 santigrat dereceye kadar eritin. Spesifik olmayan bağlamafikse fiksasyonsonra, 20 santigrat derece ilgi birincil antikorlar ile tümör doku bölümleri leke, PBS üç yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, 20 santigrat derece ışıktan korunan bir saat boyunca DAPI gibi nükleer boyama boya uygun floresan konsültonlu ikincil antikor ile hücreleri leke.Kuluçka sonunda, 20 derece santigrat bir susuz montaj ortamı ile örnekleri monte etmeden önce ışıktan korunan 20 dakika slaytlar kuru, sonra bir kapak kayma ile her slayt kapağı ve floresan mikroskop ile dokuları görüntülemeden önce 37 santigrat derece bir saat kurumasını montaj ortamı sağlar. Tümörilişkili nötrofil izolasyoniçin, onlar hasat ve iki ila üç milimetrelik parçalar halinde tümörleri kıyma steril makas kullanmak gibi steril altı kuyu plaka bireysel kuyular içine iyi başına beş tümör yerleştirin. Daha sonra, bir mililitre dispase kollajenaz d dnase 1 çözeltisi ile tümör parçalarını sindirin ve 37 santigrat derecede nem oranı %5 karbondioksitte 45 dakika boyunca 10 mililitrelik şırınga ile numuneleri 15 dakikada bir karıştırın.Kuluçka sonunda, sindirilmemiş lifleri kaldırmak ve 15 mililitrelik son bir hacme PBS eklemek için iyi başına 15 mililitrelik bir tüp içine 100 mikrometre süzgeçler aracılığıyla hücreleri filtreleyin. Ayrık hücreleri santrifüj ile toplayın ve tüp başına bir mililitre lysis tampon ile kırmızı kan hücrelerini lyse. Karıştırma sonra, tek bir 15 mililitrelik tüp içine her tüp içeriğini birleştirmek, tam dört derece santigrat orta 11 mililitre ile iki dakika sonra reaksiyon durdurma.Santrifüjden sonra, pbs bir mililitre pelet resuspend ve buz üzerinde 15 dakika fc-blok antikor üç mikrolitre ile herhangi bir non-spesifik bağlama blok. Kuluçka sonunda, hücreleri anti-CD11b ve Ly6G antikorları ve diğer ilgi antikorları ve daPI ile etiketleyin. Kuluçka sonunda, pbs 14 mililitre hücreleri yıkayın ve bir kez 10 buz taze tam orta konsantrasyon mililitre başına yedinci hücrelere pelet askıya, sonra CD11b-pozitif, Ly6G, yüksek DAPI-negatif nötrofiller bir floresan-aktive hücre ayırıcı standart sıralama protokollerine göre, tür sonunda akış sitometre üzerinde izole nötrofillersaflığını kontrol sıralamak.In vitro tümör ilişkili nötrofil inhibisyonu için, tohum 1.5 kez 10 beşinci sıralanmış nötrofil ler için 96-iyi U-alt plaka iki kuyuher içine ve fk866 eklemek 100 nanomolar bir kuyu içine tam ortamda son konsantrasyon ve diğer kuyuya tek başına tam orta eşit hacimli. Hücre kültürü kuluçka iki saat sonra, PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve sonraki enjeksiyon için uygun konsantrasyonda PBS pelet resuspend. NAMPT inhibitörü tedavi nötrofiller tedavi edilmeyen hücrelere göre aort dal oluşumunu uyarmak için önemli ölçüde azalmış kapasiteye sahiptir.Buna ek olarak, inhibitör tedavi anti-anjiyojenik nötrofillerin deri altı enjeksiyonu tedavi edilmemiş interferon alfa ve beta reseptör alt ünitesi 1 nakavt nötrofil enjekte farelere göre tümör büyümesinde önemli bir bozulmaya neden olur. Çıkarılan tümörlerin histolojik incelemesi, tedavi edilmeyen nakavt nötrofilleri ile karşılaştırıldığında inhibitör tedavi edilen tümör ilişkili nötrofillerle tedavi edilen farelerden izole edilen tümörlerde anjiyogenezin önemli ölçüde bastırıldığını da doğrulamaktadır. FK866-tedavi edilen tümör ilişkili nötrofillerin özelliklerini değerlendirmek için nötrofil polarizasyonunda yer alan hücre içi yolların aktivasyonunu incelemek için kantitatif PCR ve Batı Blot'u yapılabilir.Nötrofiller kısa ömürlü olduğundan, tüm adımları mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirmek ve tüm işlem boyunca nötrofiller soğuk tutmak için gereklidir. Bu teknik, in vivo in tümörilişkili nötrofillerin anjiojenik ve tümörijenik özelliklerinin düzenlenmesinde rol oynayan hücre içi mekanizmalar ve faktörlerin incelenmesinin önünü açar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Kolon-26 Karsinoma Tümör taşıyan Kanser Kaşeksi Araştırmaları Modeli Olarak Fare

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Kimlik ve metastatik faktörler gen transferi ile karakterizasyonu roman RIP-etiketinin içine; RIP-tva fare modeli

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Örnek çıkarma ve eşzamanlı Kromatografik Nefelometri doksorubisin ve ilaç kombinasyonu dağıtımında nano tanecikleri tümörü taşıyan fareler takip Mitomycin C

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...