Name: single-cell screening method for the selection and recovery of antibodies with desired specificities from enriched human memory b cell populations
Uploaded: 2019-08-22T14:00:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations at JoVE.com

लेखकों को कई विधि संशोधनों और वर्तमान BSelex मंच के शोधन के व्यापक परीक्षण के लिए लुसी Chammas, मार्था कोस्टा, जूली किम, नैन्सी Herdia, और जेरेमी Macedo शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

<ol>
	<li>Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Culture+of+Human+Naive+and+Memory+B+Cells+for+Use+as+APCs.">Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs.</a> Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).</li><li>Corti, D., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+neutralizing+antiviral+antibodies.">Broadly neutralizing antiviral antibodies.</a> Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).</li><li>Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB+virus-induced+B+lymphocyte+cell+lines+producing+specific+antibody.">EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody.</a> Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).</li><li>Bloom, A. D., Nakamura, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+tetraploid,+immunoglobulin-producing+cell+line+from+the+hybridization+of+two+human+lymphocyte+lines.">Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).</li><li>Olsson, L., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-human+hybridomas+producing+monoclonal+antibodies+of+predefined+antigenic+specificity.">Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).</li><li>Lechner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Circulating+Immune+Cells+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration.">Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> Scientific Reports. 5, 16754 (2015).</li><li>Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+optimal+lymphocyte+gates+for+immunophenotyping+by+flow+cytometry.">Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry.</a> Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).</li><li>Pascual, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+memory+to+hyperphosphorylated+tau+in+asymptomatic+individuals.">Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals.</a> Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).</li><li>van Ameijde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+therapeutic+potential+of+a+naturally+occurring+human+antibody+targeting+a+phosphorylated+Ser(422)+containing+epitope+on+pathological+tau.">Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning.">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cloning+of+high-affinity+human+monoclonal+antibodies+against+influenza+virus.">Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus.</a> Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).</li><li>Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+T-cell+receptor+sequence+to+functional+phenotype+at+the+single-cell+level.">Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level.</a> Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Jones, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+the+central+conserved+region+of+RSV+G+by+neutralizing+human+antibodies.">Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies.</a> PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US patent. , (2017).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

यहाँ प्रस्तुत विधि प्रवाह साइटोमेट्री और एकल कोशिका क्लोनिंग को जोड़ती है, और हम यहाँ का वर्णन तरीकों हम पहले टिलर और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित तरीकों के आधार पर11. उनके काम में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की वसूली और क्लोनिंग का वर्णन किया गया है ताकि व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर मनुष्यों में बी सेल प्रदर्शनों का अध्ययन किया जा सके। हम उनकी प्रक्रिया के प्रमुख घटकों को अनुकूलित किया है स्मृति बी कोशिकाओं की आबादी से प्रतिजन-विशिष्ट monoclonal एंटीबॉडी की वसूली की अनुमति देने के लिए, बहु कदम प्रवर्धन प्राइमर रणनीति सहित. प्रमुख संशोधन लेबल प्रतिजन "बैट" के अलावा है. अतिरिक्त अनुकूलन प्रकाशित प्रोटोकॉल के लिए किया गया है, सहित (लेकिन सीमित नहीं) एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में क्लोनिंग वेक्टर रीढ़ को संशोधित करने, germline प्रदर्शनों के अतिरिक्त प्राइमर कवरेज (दोनों नेता अनुक्रम और रूपरेखा 1), उच्च अभिव्यक्ति के लिए निलंबन HEK293 कोशिकाओं के transfection, और पीसीआर प्रवर्धन के दौरान उच्च निष्ठा polymerases का उपयोग करें।
यहाँ वर्णित विधियों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रवाह साइटोमेट्री और एकल सेल क्लोनिंग के बीच संक्रमण के पास हैं। सबसे पहले, प्लेट में हल एकल कोशिकाओं की उचित नियुक्ति आवश्यक है. सॉर्टर पर ड्रॉप-देरी सही तरीके से सेट करना एक महत्वपूर्ण चरण है. पर्यावरण कारकों, जैसे कम आर्द्रता, भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, के रूप में हम अपनी वसूली क्षमता काफी गिरावट पाया है जब तक एक स्थिर बंदूक लक्ष्य सॉर्ट प्लेटों पर प्रयोग किया जाता है. सेल प्लेसमेंट के बाद, प्लेटें यह सुनिश्चित करने के लिए centrifuged हैं कोशिकाओं कुओं के नीचे बफर के 10 डिग्री एल से संपर्क किया है. इन उपायों के सभी आणविक जीव विज्ञान भाग के लिए महत्वपूर्ण हैं सफल होने के लिए. यदि शर्तें किसी एकल सेल की रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के लिए उप-अनुकूल हैं, तो पीसीआर प्रवर्धन भी $-actin का उपयोग मुश्किल हो सकता है। प्रस्तुत विधि की ताकत कोशिकाओं के लाखों लोगों से पूछताछ करने की क्षमता है और केवल पसंद के प्रतिजन के खिलाफ प्रतिजन प्रतिक्रिया मानदंड से मेल खाते हैं कि लोगों को सॉर्ट. यह शोर अनुपात करने के लिए संकेत की आवश्यकता के रूप में संभव के रूप में उच्च हो, जो छँटाई से पहले चारा सांद्रता के अनुकूलन द्वारा किया जाता है. दोहरी लेबल चारा झूठी सकारात्मक कोशिकाओं की वसूली को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो हो सकता है अगर फ्लोरोफोर्स में से एक उच्च पृष्ठभूमि है. एक से अधिक प्रतिजन चारा का उपयोग संकेत कर सकते हैं: शोर अनुकूलन और अधिक कठिन है, लेकिन एक साथ कई पेप्टाइड्स पूछताछ करने की क्षमता इस विधि का एक और लाभ है.
जब पुनर्प्राप्ति क्षमता कम होती है, तो यह पुष्टि करने के लिए नेस्टेड जेड-एक्टिन प्राइमर का एक सेट उपयोग किया जाता है कि टेम्पलेट cDNA मौजूद है. इस दृष्टिकोण के लिए दोष यह है कि यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वहाँ अच्छी तरह से या रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में कोई सेल मौजूद नहीं था विफल रहा है, समस्या निवारण मुश्किल बना रही है. कभी-कभी विपरीत हो जाएगा और क्षमता अपेक्षा से अधिक होती है। भारी श्रृंखला के लिए विशिष्ट वसूली के बीच है 30-45% और प्रकाश श्रृंखला अधिक हैं, के बीच 40-60%. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया (चरण मैं और द्वितीय) एक एकल सेल से बढ़ाना करने के लिए 50 चक्र का उपयोग करता है। कुल चक्र की उच्च संख्या भी इस विधि संदूषण के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है. amplicons के अनुक्रम विश्लेषण एक संदूषक शुरू किया गया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक असामान्य रूप से उच्च वसूली दर वैध रूप से प्राप्त किया गया है.
पसंद के एक प्रतिजन के खिलाफ देशी मानव एंटीबॉडी ठीक करने के लिए इस विधि की उपयोगिता कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. सबसे पहले, केवल घुलनशील प्रोटीन है कि लेबल किया जा सकता है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है "बैट" प्रवाह cytometry के लिए. प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत प्रकार के लिए, हम ताओ प्रोटीन से संश्लेषित ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स की एक श्रृंखला का इस्तेमाल किया, पूरे प्रोटीन का उपयोग कर के बाद से मुश्किल साबित कर दिया. रैखिक पेप्टाइड्स का उपयोग इष्टतम नहीं है, क्योंकि यह गैर रेखीय या संरचनात्मक एपिटोप के खिलाफ एंटीबॉडी की पहचान को सीमित कर सकता है। तथापि, हम ताऊ के विरुद्ध अनेक विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने में सक्षम थे और ये वर्तमान में आगे मूल्यांकन8,9के दौर से गुजर रहे हैं । एक और सीमा आणविक जीव विज्ञान वसूली और IgGs की क्लोनिंग के कम थ्रूपुट है. प्रारंभिक छँटाई रणनीति कोशिकाओं के लाखों लोगों की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन बाद में आणविक जीव विज्ञान प्रसंस्करण कई चरणों के होते हैं. चल रहे अनुकूलन के लिए नए प्रौद्योगिकियों को शामिल करने के प्रयास, गिब्सन विधानसभा10 के रूप में कई कदम सुव्यवस्थित है, लेकिन बाधा व्यक्तिगत भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़े क्लोनिंग बनी हुई है.
"BSelex" विधि प्रतिजन प्रतिक्रिया प्रदर्शित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए स्मृति बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त बीसीआर का इस्तेमाल करता है, और फिर प्रवाह साइटोमेट्री11,12के माध्यम से इन अलग-अलग कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें। बीसीआर पर इस निर्भरता के कारण, विधि स्मृति बी सेल डिब्बे तक ही सीमित है, और प्लाज्मा ब्लास्टकेरूप जैसे एंटीबॉडी स्रावित कोशिकाओं (एएससी) को कैप्चर नहीं करता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण ASCs की तुलना में प्रतिजन-विशिष्ट इम्यूनोग्लोबिन की एक व्यापक प्रदर्शनों को ठीक करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. इन्फ्लुएंजा टीकाकरण अध्ययनों से पता चलता है कि जबकि प्रतिक्रियाशील ASCs विस्तारित बी सेल क्लोन की एक छोटी संख्या से प्रभुत्व किया जा सकता है, प्रतिजन विशेष स्मृति बी सेल आबादी शायद ही कभी क्लोन12है. टी कोशिकाओं की सतह पर टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) जीन व्यवस्था और पुनर्संयोजन में बी सेल रिसेप्टर के लिए समानता के पास विविधता को अधिकतम करने के लिए. यहाँ प्रस्तुत विधि में वर्णित है क्या करने के लिए इसी तरह एकल सेल दृष्टिकोण टी सेल प्रदर्शनों का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, वसूली और अल्फा और बीटा चेन13के एकल सेल क्लोनिंग सहित . हालांकि, TCR मान्यता पेप्टाइड्स MHC अणुओं द्वारा प्रस्तुत किया जा करने की आवश्यकता है, पेप्टाइड-विशिष्ट टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लेबल चारा दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण जटिलता जोड़ने. बी कोशिकाओं के विपरीत, टी कोशिकाओं पूरे चर क्षेत्र की आत्मीयता परिपक्वता से गुजरना नहीं है, इसलिए कम CDR3 क्षेत्र की पहचान और कुछ flanking अनुक्रम सब है कि पहचान और पुनर्गठन के लिए आवश्यक है. अंत में, इस विधि प्रवाह साइटोमिट्री का उपयोग आईजीजी अणुओं की पहचान का वर्णन करता है, लेकिन यह भी विभिन्न आइसोटाइप के बी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए वैकल्पिक phenotypic मार्करों का उपयोग करने के लिए संभव है।
वर्तमान में, एंटीजन विशिष्टता के कार्यात्मक विश्लेषण के साथ अगली पीढ़ी अनुक्रमण से एकत्र डेटा की भारी मात्रा को जोड़ने के लिए विकसित किए जा रहे हैं, लेकिन इन तरीकों को अभी भी परिष्कृत किया जा रहा है। अपनी सीमाओं के बावजूद, यहाँ वर्णित विधि दोनों संक्रामक और गैर संक्रामक रोगोंकेलिए संभावित चिकित्सीय मूल्य के साथ एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 8 ,14,15, और एक विश्वसनीय का प्रतिनिधित्व करता है बी कोशिकाओं या व्यापक सेल संस्कृति के व्यापक हेरफेर के बिना, मनुष्यों से प्रासंगिक एंटीजन-विशिष्ट IgGs ठीक करने के लिए दृष्टिकोण।

एंटीबॉडी चिकित्सकीय अणुओं की एक बढ़ती हुई वर्ग हैं, और किसी भी मानव में मौजूदा बी सेल प्रदर्शनों की सूची इस तरह के एंटीबॉडी का एक संभावित स्रोत है। जब एक मानव दाता से बरामद, वे कोई अनुकूलन या "मानवीकरण" की आवश्यकता होती है, कदम है कि अन्य पशु प्रणालियों में उत्पन्न एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हैं. मानव एंटीबॉडी की पहचान और अलगाव के लिए कई तरीके मौजूद हैं, जिनमें बी सेल सक्रियण और प्रसार1, ईबीवी रूपांतरण2,3, और हाइब्रिडोमा सेल लाइनों की पीढ़ी 4 के माध्यम से अमरीकरण शामिल है ,5. हालांकि, इन तरीकों के सभी स्क्रीन और प्रतिजन विशेष एंटीबॉडी ठीक करने के लिए व्यापक सेल संस्कृति की आवश्यकता है. मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची के बारे में जानकारी बहुत अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) प्रौद्योगिकी के विकास के साथ विस्तार किया गया है, दाता के नमूनों में मौजूद अलग-अलग दृश्यों की भारी मात्रा की पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, क्योंकि एनजीएस मौजूद सभी दृश्यों का एक नास्तिक दृश्य देता है, यह एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान और अलगाव के लिए अनुमति नहीं देता है, विशेष रूप से दुर्लभ या कम आवृत्ति एंटीबॉडी के मामले में।
"BSelex" विधि का उद्देश्य मानव दाताओं में परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के परिसंचरण से प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करना है, और आगे के विश्लेषण के लिए इन एंटीबॉडी के दृश्यों को अलग करना और पुनर्प्राप्त करना है। इस विधि के प्रवाह cytometry और सेल छँटाई का इस्तेमाल बी सेल रिसेप्टर (BCR) स्मृति बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त का लाभ लेने के लिए. अधिक कम-थ्रूपुट आण्विक जीव विज्ञान विधियों को शुरू करने से पहले प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से प्रतिजन-विशिष्टता के लिए लाखों बी कोशिकाओं की जांच की जा सकती है। जोड़ी भारी और प्रकाश श्रृंखला पहचान सबसे NGS तरीकों, जो थोक में सेल दृश्यों का विश्लेषण में संभव नहीं है. विधि में हम यहाँ का वर्णन, कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से अलग कर रहे हैं, और दोनों भारी और प्रकाश श्रृंखला दृश्यों की बनती वसूली संभव है, जो प्रत्यक्ष क्लोनिंग और पूर्ण आईजीजी की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter</td>
			<td style="width:136px;">MoFlo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Biotinylated peptides</td>
			<td style="width:136px;">New England Peptide</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Cell sorting &#34;bait&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Micro Bio-spin P30 gel column</td>
			<td style="width:136px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">#7326223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Streptavidin (R-PE)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SA10041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Streptavidin (APC)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S32362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">CD22 MicroBeads, human&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;">#130-046-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LS columns</td>
			<td style="width:136px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;">#130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pre separation filters&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;">#130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD#340951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PE-Cy7 mouse anti-human CD27&#160;</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">#560609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">FITC mouse anti-human IgG</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">#560952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DAPI</td>
			<td style="width:136px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNaseOUT</td>
			<td style="width:136px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Bovine serum albumin, Fraction V</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI media</td>
			<td style="width:136px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">#SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">HI FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mastercycler Gradient</td>
			<td style="width:136px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model #6325</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR 96-well plates</td>
			<td style="width:136px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">MPS-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Plate mats</td>
			<td style="width:136px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">SMX-PCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix</td>
			<td style="width:136px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">#639125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Superscript IV First-strand synthesis system</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#18091050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-531-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Platinum polymerase</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#10966108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:136px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">assorted</td>
			<td>Primers for all PCR steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Purification kit</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Miniprep Kit</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:136px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E5520S</td>
			<td>Gibson assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Expi293 Expression Media</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A14351-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">ExpiFectamine 293 Transfection Kit</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A14525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Opti-MEM Media</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">CO2 incubator (Multitron)</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Octet&#160;RED384 System</td>
			<td style="width:136px;">Pall/ Forte Bio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#15500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody</td>
			<td style="width:136px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:119px;">#109-036-097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td style="width:136px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:119px;">#115-035-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)&#160;</td>
			<td style="width:136px;">KPL</td>
			<td style="width:119px;">#52-00-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">TMB Stop Solution</td>
			<td style="width:136px;">KPL</td>
			<td style="width:119px;">#50-85-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell screening method for the selection and recovery of antibodies with desired specificities from enriched human memory b cell populations

मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची संभावित चिकित्सीय एंटीबॉडी और उपयोगी biomarkers के एक बड़े पैमाने पर अप्रयुक्त स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है. जबकि वर्तमान अभिकलनीय विधियाँ, जैसे कि अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS), अनुक्रम स्तर पर एंटीबॉडी प्रदर्शनों के संग्रह पर डेटा के भारी सेट उपज, कार्यात्मक डेटा की पहचान करने के लिए जो दृश्यों एक विशेष प्रतिजन या सेट के लिए प्रासंगिक हैं की आवश्यकता है एंटीजन. यहां, हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से मानव रक्त दाता से व्यक्तिगत एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि परिपक्व बी कोशिकाओं के एक प्रारंभिक संवर्धन का इस्तेमाल करता है और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से आईजीजी स्मृति बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए phenotypic सेल मार्करों और फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन का एक संयोजन की आवश्यकता है। भारी और प्रकाश श्रृंखला चर क्षेत्रों तो क्लोन और फिर से जांच कर रहे हैं. हालांकि स्मृति बी सेल डिब्बे तक ही सीमित है, इस विधि प्रवाह साइटोमेट्री का लाभ लेता है बी कोशिकाओं के लाखों पूछताछ और एक एकल सेल से युग्मित भारी और प्रकाश श्रृंखला अनुक्रम देता है अभिव्यक्ति और विशिष्टता की पुष्टि के लिए तैयार प्रारूप में. इस विधि के साथ बरामद एंटीबॉडी चिकित्सकीय क्षमता के लिए विचार किया जा सकता है, लेकिन यह भी विशिष्टता और bioinformatic दृष्टिकोण के साथ समारोह के लिए व्यक्तियों के भीतर बी सेल प्रदर्शनों का आकलन लिंक कर सकते हैं.

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Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से व्यक्तिगत एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने और पुनर्प्राप्त करने के लिए BSelex विधि एकल सेल पीसीआर और क्लोनिंग के साथ प्रवाह साइटोमेट्री को जोड़ती है।

समृद्ध मानव स्मृति बी सेल आबादी से वांछित विशिष्टताओं के साथ एंटीबॉडी के चयन और वसूली के लिए एकल सेल स्क्रीनिंग विधि

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि इसका उपयोग दुर्लभ, एंटीजन-विशिष्ट बी-कोशिकाओं की पहचान करने के लिए मानव दानदाताओं के प्रतिरक्षा प्रदर्शनों से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक हमें मूल रूप से बनती हुई भारी और हल्की श्रृंखलाओं को प्राप्त करने की अनुमति देती है, जिसे तेजी से क्लोन किया जा सकता है, और फिर सीधे एंटीजन या ब्याज के एंटीजन के खिलाफ परीक्षण किया जाता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन माइक मॉर्टन, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा ।विगलन और वसूली के कम से कम एक घंटे बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा दाता पीबीएमसी एकत्र करें। और फिर से गिनती के लिए बर्फ ठंड एमईएस बफर के ५० मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित । एक और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मार, और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार CD22 माइक्रोमोतियों के साथ सकारात्मक चयन द्वारा CD22-सकारात्मक बी कोशिकाओं को अलग ।अपकेंद्रित्र द्वारा मनका अलग सीडी22-सकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा करें और कोशिकाओं को चार गुना 10 पर वीएक्स बफर एकाग्रता के मिलीलीटर प्रति सातवीं कोशिकाओं में फिर से खर्च करें। कोमल मिश्रण के साथ निर्माता की कमजोर पड़ने की सिफारिशों के अनुसार कोशिकाओं के लिए एक IgG CD19 CD27 एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें, और नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सातवीं कोशिकाओं के लिए 10 aliquot । एक पीई और एपीसी के साथ 36 नैनोमोलर की अंतिम एकाग्रता पर नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब में एक दोहरी लेबल बायोटिन स्टेपटाविडिन टेट्राम्र्स जोड़ें, जो सॉर्ट ट्यूब में पेप्टाइड्स की संख्या से गुणा किया गया है।ताजा Vax बफर के साथ प्रत्येक ट्यूब 2.5 मिलीलीटर में अंतिम मात्रा लाओ और 36 नैनोमोलर प्रत्येक पीई और एपीसी पर ट्यूब सॉर्ट करने के लिए पेप्टाइड टेट्रामर्स जोड़ें। अपकेंद्रित्र के बाद, कोशिकाओं को दो बार 10 से टीबीएस एकाग्रता के 6 100 माइक्रोलीटर के लिए एक 30 से 60 मिनट के लिए इनक्यूबेशन, अंधेरे में, चार डिग्री सेल्सियस पर, रोटेशन के साथ लाने के लिए । इनक्यूबेशन के अंत में, अलग पांच मिलीलीटर फिल्टर कैप ट्यूबों में नमूनों को तनाव देने से पहले प्रति वॉश ताजा टीबीएस बफर में कोशिकाओं को दो बार धोएं।कोशिका झिल्ली अखंडता के मार्कर के रूप में DAPI के 0.3 माइक्रोमोलर अंतिम एकाग्रता के साथ नमूनों को दाग दें। और एकल सेल छंटाई के लिए उपयुक्त सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री गेट्स सेट करने के लिए सेल सॉर्टर पर पूरे नकारात्मक नियंत्रण को चलाएं। एंटीजन पीई बनाम एंटीजन एपीसी प्लॉट और एक एंटीजन पीई सकारात्मक के रूप में R8 गेट सेट, और एपीसी-डबल सकारात्मक गेट में घटनाओं की एक कम संख्या के साथ सकारात्मक चतुर्भुज ।फिर, एक सीडी 19-सकारात्मक CD27-सकारात्मक एंटीजन पीई-सकारात्मक, एंटीजन एपीसी-सकारात्मक कोशिकाओं को मास्टर मिक्स के व्यक्तिगत कुओं में 96 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें। तरह के अंत में, एल्यूमीनियम टेप पैड के साथ थाली को कवर, और शून्य से पहले ८० डिग्री भंडारण से पहले ४०० बार जी पर एक मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र । रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस प्रतिक्रिया करने के लिए, खोलने से पहले प्लेट को दो मिनट के लिए दो मिनट के लिए घूमते हुए दो मिनट के लिए बर्फ पर क्रमबद्ध बी-कोशिकाओं को पिघला दें।एक उपयुक्त एंजाइम मास्टर मिक्स के साथ कोशिकाओं के इलाज के बाद, प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक टेम्पलेट के रूप में मानार्थ डीएनए के २.५ माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 1 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में प्राइमर जोड़ें । फिर, प्रत्येक अच्छी तरह से 10X पॉलीमरेज बफर की 2X एकाग्रता जोड़ें ताकि अंतिम मात्रा को प्रति प्रतिक्रिया 25 माइक्रोलीटर तक लाया जा सके। और 50 चक्रों के लिए प्रत्येक भारी और प्रकाश श्रृंखला पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाएं।प्रतिक्रियाओं के अंत में, सकारात्मक प्रवर्धन हिट की कल्पना करने के लिए 1% एगर उठे जेल पर नमूने चलाएं। जेल निष्कर्षण के माध्यम से एक ही सेल से दोनों बनती भारी और प्रकाश श्रृंखला प्रतिक्रियाओं को अलग करें। सटीक लिगेशन मिश्रण गणना के लिए ऑप्टिकल घनत्व द्वारा डीएनए टुकड़ा एकाग्रता को 60 तक निर्धारित करें।निर्माता के निर्देशों के अनुसार चार टुकड़े लिगेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके बरामद भारी और हल्के चेन टुकड़ों को एक लिंकर टुकड़े और अभिव्यक्ति वेक्टर बैकबोन के साथ मिलाएं। और निर्माता के निर्देशों के अनुसार लिगेशन प्रतिक्रियाओं को रासायनिक रूप से सक्षम बैक्टीरिया में बदल दें। एक बार एंटीबायोटिक प्लेटों पर चढ़ाया, प्रति मिनट २५० घूर्णन पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेशन के लिए शेष परिवर्तन संस्कृति के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ विकास माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें ।अगली सुबह, निर्माता के निर्देशों के अनुसार रात भर के बंधन मिश्रण संस्कृतियों से एक मिनीप्रेप डीएनए तैयार करें और परिणामस्वरूप प्लाज्मिड डीएनए एकाग्रता निर्धारित करें। अलग एंटीबॉडी की एंटीजन विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, 293 कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर निलंबन में cationic लिपिड बेस रिएजेंट के साथ मिनीप्रेप डीएनए के 10 माइक्रोग्राम को ट्रांसफेक्ट करें। सेल कल्चर को तीन से चार दिन ३७ डिग्री सेल्सियस और 8% कार्बन डाइऑक्साइड और १२५ घूर्णन प्रति मिनट पर इनक्यूबेट करें ।इनक्यूबेशन के अंत में, 1000 बार जी पर 10 मिनट के लिए संस्कृति अपकेंद्रित्र, और स्पष्ट माध्यम ठीक हो। प्रोटीन ए के लिए आत्मीयता के माध्यम से सुपरनैट में आईजीजी एकाग्रता को मापें और मानक एलिसा प्रोटोकॉल के अनुसार तरह के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यक्तिगत पेप्टाइड्स के खिलाफ एलिसा द्वारा 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एकाग्रता पर सुपरनैट में प्रत्येक एंटीबॉडी का परीक्षण करें। फिर, आईजीजी सुपरनेट के कमजोर होने का उपयोग करके एक अतिरिक्त एलिसा के साथ स्क्रीन सकारात्मक हिट की पुष्टि करें ताकि प्रति मिलीलीटर 20 माइक्रोलीटर से शुरू होने वाली एकाग्रता वक्र उत्पन्न हो सके और प्रारंभिक स्क्रीन एलिसा के प्रति प्रतिक्रियाशीलता दिखाने वाले प्रत्येक एंटीजन के लिए ऑप्टिकल घनत्व के खिलाफ साजिश रच सके।मानव दाताओं से एंटीजन विशिष्ट एंटीबॉडी को अलग करने के लिए, लक्ष्य स्मृति बी-कोशिकाओं को अलग करने के लिए साइटोमेट्री गेट्स की एक श्रृंखला तैयार की जा सकती है। लिम्फोसाइट्स को आगे और साइड स्कैटर का उपयोग करके उनके सेल आकार और दानेदारता के आधार पर अलग-थलग कर दिया जाता है। डबल्स और मृत कोशिकाओं के बहिष्कार के बाद, फेनोटाइपिक मार्कर आईजीजी-पॉजिटिव सीडी 19-पॉजिटिव बी-सेल्स और सीडी 27-पॉजिटिव मेमोरी बी-सेल्स के अलगाव की अनुमति देते हैं ।सिंगल सेल क्लोनिंग का पहला रीडआउट संबंधित भारी और हल्के चर श्रृंखलाओं के प्रवर्धन की पुष्टि है। यहां, पीसीआर दिखाए जाने के बाद 42% पेयर रिकवरी के साथ 24 एकल कोशिकाओं से एक बहुत ही कुशल प्रवर्धन का एक उदाहरण। आईजीजी क्लोनिंग के बाद, आईजीजी अभिव्यक्ति वेक्टर मानव भ्रूण गुर्दे 293 कोशिकाओं में देखा जाता है।बरामद एंटीबॉडी एलिसा द्वारा प्रतिक्रियाशीलता के लिए बनाए गए ताऊ पेप्टाइड्स के मूल पैनल के खिलाफ जांच की जाती है। अतिरिक्त पुष्टि तो प्रारंभिक स्क्रीन में पहचान पेप्टाइड्स के खिलाफ एक ही पुनर्संयोजन एंटीबॉडी नमूनों की एकाग्रता वक्र का उपयोग कर पूरा हो गया है । प्रत्येक सकारात्मक हिट के लिए, एक व्यक्तिगत प्लाज्मिड क्लोन को परिवर्तित पूल से अलग किया जा सकता है और उसी एलिसा विधि द्वारा फिर से पुष्टि की जा सकती है।लक्ष्य एकल कोशिकाओं से बढ़ाना दृश्यों है, तो सबसे महत्वपूर्ण बात को याद है कि किसी भी संदूषण इस प्रक्रिया के पीसीआर भाग के दौरान परिलक्षित किया जाएगा । यह प्रक्रिया मानव पुनः संयोजन एंटीबॉडी को बरकरार रखता है, जो शुद्धि और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है जितना आप उत्पन्न करना चाहते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear चूहे के खिलाफ पूर्व परिभाषित टी सेल रिसेप्टर specificities के साथ Toxoplasma gondii SCNT के माध्यम से प्राप्त

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

घायल प्रवाह cytometry द्वारा स्पाइनल कॉर्ड ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन: एक सेल शोधन विधि के लिए एक उपन्यास का प्रयोग करें

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

अग्रदूत बी सेल सबसेट के गर्भनाल रक्त से अलगाव

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से स्केलेबल उच्च Throughput चुनाव

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

अलग माउस त्वचा क्षेत्र से Cytofluorimetric विश्लेषण के लिए एकल कोशिका निलंबन की तैयारी

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

अमर छाँटे बी कोशिकाओं से पुनः संयोजक मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का सृजन

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

मानव तालु Tonsils से बी और टी lymphocytes के लिए कुशल अलगाव प्रोटोकॉल

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

ल्युकोसैट समृद्ध रक्त के नमूनों में Halogenating peroxidase की गतिविधि के फास्ट और विशिष्ट आकलन

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

एक सरल लाल रक्त कोशिका बी Lymphoblastoid सेल लाइनों की स्थापना के लिए Lysis विधि

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...