Name: single-cell screening method for the selection and recovery of antibodies with desired specificities from enriched human memory b cell populations
Uploaded: 2019-08-22T14:00:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Люси Шаммас, Марта Коста, Джули Ким, Нэнси Эредиа и Джереми Маседо за тщательное тестирование многих модификаций метода и уточнение текущей платформы BSelex.

<ol>
	<li>Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Culture+of+Human+Naive+and+Memory+B+Cells+for+Use+as+APCs.">Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs.</a> Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).</li><li>Corti, D., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+neutralizing+antiviral+antibodies.">Broadly neutralizing antiviral antibodies.</a> Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).</li><li>Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB+virus-induced+B+lymphocyte+cell+lines+producing+specific+antibody.">EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody.</a> Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).</li><li>Bloom, A. D., Nakamura, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+tetraploid,+immunoglobulin-producing+cell+line+from+the+hybridization+of+two+human+lymphocyte+lines.">Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).</li><li>Olsson, L., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-human+hybridomas+producing+monoclonal+antibodies+of+predefined+antigenic+specificity.">Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).</li><li>Lechner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Circulating+Immune+Cells+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration.">Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> Scientific Reports. 5, 16754 (2015).</li><li>Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+optimal+lymphocyte+gates+for+immunophenotyping+by+flow+cytometry.">Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry.</a> Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).</li><li>Pascual, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+memory+to+hyperphosphorylated+tau+in+asymptomatic+individuals.">Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals.</a> Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).</li><li>van Ameijde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+therapeutic+potential+of+a+naturally+occurring+human+antibody+targeting+a+phosphorylated+Ser(422)+containing+epitope+on+pathological+tau.">Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning.">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li><li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cloning+of+high-affinity+human+monoclonal+antibodies+against+influenza+virus.">Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus.</a> Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).</li><li>Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+T-cell+receptor+sequence+to+functional+phenotype+at+the+single-cell+level.">Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level.</a> Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).</li><li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51/VL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities.">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).</li><li>Jones, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+recognition+of+the+central+conserved+region+of+RSV+G+by+neutralizing+human+antibodies.">Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies.</a> PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US patent. , (2017).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать

Представленный здесь метод сочетает в себе цитометрию потока и клонирование одноклеточных клеток, а методы, которые мы описываем здесь, мы основыем на методах, ранее разработанных Тиллером и коллегами11. Их работа описывает восстановление и клонирование моноклональных антител для изучения репертуара В-клеток у людей на уровне отдельных клеток. Мы адаптировали основные компоненты их процесса, чтобы позволить восстановление антиген-специфических моноклональных антител из популяции клеток памяти В, в том числе многоступенчатой стратегии праймеризации усиления. Основной модификацией является добавление маркированного антигена "приманка". Дополнительные адаптации к опубликованному протоколу, в том числе (но не ограничиваясь) изменение хребета вектора клонирования в одно выражение плазмида, дополнительное охват зародышевой линии (как последовательность лидеров, так и рамка 1), трансфекция суспензии HEK293 клеток для более высокой экспрессии, а также использование полимеразы высокой точности во время усиления ПЦР.
Для описанных здесь методов наиболее важные шаги находятся вблизи перехода между цитометрией потока и клонированием одноклеточных ячеек. Во-первых, необходимо правильное размещение отсортированных одиночных ячеек в тарелку. Правильное настройка задержки сбросом на сортаторявляется ключевым шагом. Экологические факторы, такие как низкая влажность, также должны быть приняты во внимание, как мы обнаружили, что наши восстановления эффективности значительно снизиться, если статический пистолет используется на целевой сортировки пластин. После размещения клеток, пластины центрифугируются, чтобы убедиться, что клетки связались с 10 зл буфера в нижней части скважин. Все эти меры имеют решающее значение для молекулярной биологии часть, чтобы быть успешным. Если условия являются неоптимальными для обратной реакции транскрипции одной клетки, pcR усиление даже к-актин может быть трудным. Сила представленного метода заключается в способности допрашивать миллионы клеток и сортировать только те, которые соответствуют критериям реактивности антигена против антигена выбора. Это требует, чтобы соотношение сигнала к шуму было как можно выше, что делается путем оптимизации концентрации приманки перед сортировкой. Двойная этикетка приманки используется для уменьшения восстановления ложноположительных клеток, которые могут произойти, если один из флюорофоров имеет высокий фон. Использование более чем одного антигена приманки может сделать сигнал: оптимизация шума сложнее, но возможность допроса нескольких пептидов одновременно является еще одним преимуществом этого метода.
При низкой эффективности восстановления используется набор вложенных праймеров с актином, которые подтверждают наличие шаблона cDNA. Недостатком этого подхода является то, что трудно определить, не было ли ячейки, присутствуютвой в колодце или обратная реакция транскрипции не удалось, что делает устранение неполадок трудно. Иногда происходит обратное, и эффективность выше, чем ожидалось. Типичное восстановление для тяжелой цепи составляет от 30-45% и световые цепи выше, между 40-60%. Каждая реакция ПЦР (Шаг I и II) использует 50 циклов для усиления из одной ячейки. Большое количество общих циклов также делает этот метод восприимчивым к загрязнению. Последовательность анализа ампиконов может быть использована для определения того, загрязнитель был введен, или необычно высокий уровень восстановления был законно достигнута.
Полезность этого метода для восстановления местных человеческих антител против антигена выбора имеет несколько существенных ограничений. Во-первых, только растворимые белки, которые могут быть помечены могут быть использованы в качестве "приманки" для потока цитометрии. Для видов, представленных в репрезентативных результатах, мы использовали серию синтезированных перекрывающихся пептидов из тау-белка, так как использование всего белка оказалось трудным. Использование линейных пептидов, вероятно, не является оптимальным, так как это может ограничить выявление антител против нелинейных или структурных эпитопов. Тем не менее, мы смогли определить несколько уникальных антител против Тау, и они в настоящее время проходят дальнейшую оценку8,9. Другим ограничением является низкая пропускная стоимость восстановления молекулярной биологии и клонирования ИгГов. Первоначальная стратегия сортировки позволяет скрининг миллионов клеток, но последующая обработка молекулярной биологии состоит из нескольких этапов. Продолжающиеся усилия по оптимизации для внедрения новых технологий, таких как Gibson Assembly10, упростили несколько шагов, но узким местом остается клонирование отдельных тяжелых и легких цепных пар.
Метод "BSelex" использует BCR, выраженный на поверхности клеток памяти В, чтобы определить клетки, которые отображают реактивность антигена, а затем восстановить эти отдельные клетки через цитометрию потока11,12. Из-за этой зависимости от BCR, метод ограничен отсеком клетки памяти B, и не захватывает клетки высвобождения антител (ASCs) such as plasmablasts. Тем не менее, этот подход может быть выгодным для восстановления более широкого репертуара антиген-специфических иммуноглобинов по сравнению с ASCs. Исследования вакцинации против гриппа показывают, что в то время как реактивные ASCs может доминировать небольшое количество расширенных клонов Клеток B, антиген-специфической памяти B клеточной популяции редко клональный12. Рецептор Т-клеток (ТКР) на поверхности Т-клеток обладает сходством с рецептором В-клеток в расположении генов и рекомбинации для максимального разнообразия. Одноклеточные подходы, аналогичные тому, что описано в методе, представленном здесь, были разработаны для оценки репертуара Т-клеток, включая восстановление и одноклеточное клонирование альфа- и бета-цепей13. Тем не менее, распознавание TCR требует, чтобы пептиды были представлены молекулами MHC, добавляя значительную сложность маркированному подходу к приманке для определения пептид-специфических Т-клеток. В отличие от В-клеток, Т-клетки не проходят созревание сродства всей переменной области, поэтому идентификация короткой области CDR3 и некоторой фланговой последовательности — это все, что требуется для идентификации и восстановления. Наконец, этот метод описывает идентификацию молекул IgG с использованием цитометрии потока, но можно также использовать альтернативные фенотипические маркеры для идентификации В-клеток различных изотипов.
В настоящее время разрабатываются методы, связанные с подключением огромного объема данных, собранных в ходе секвенирования следующего поколения, с функциональным анализом специфичности антигена, однако эти методы все еще совершенствуются. Несмотря на свои ограничения, описанный здесь метод использовался для выявления антителс потенциальной терапевтической ценностью как для инфекционных, так и для неинфекционных заболеваний 8,14,15,и представляет собой надежный подход к восстановлению соответствующих антиген-специфических IgGs от людей, без обширных манипуляций В-клеток или обширной культуры клеток.

Антитела являются растущим классом терапевтических молекул, и существующий репертуар В-клеток у любого человека является потенциальным источником таких антител. При извлечении из человека донора, они не требуют адаптации или "гуманизации", шаги, которые необходимы для антител, генерируемых в других системах животных. Существует несколько методов идентификации и изоляции человеческих антител, включая активацию В-клеток и пролиферацию1,увековечение через преобразование EBV2,3,и генерацию линий клеток гибридомы4 ,5. Тем не менее, все эти методы требуют обширной клеточной культуры для проверки и восстановления антигена конкретных антител. Информация о репертуаре человеческих антител была значительно расширена с развитием технологии секвенирования следующего поколения (NGS), позволяющей выявлять огромное количество отдельных последовательностей, присутствующих в образцах доноров. Однако, поскольку NGS дает агностик зрения всех присутствующих последовательностей, он не позволяет для идентификации и изоляции антиген-специфических антител, особенно в случае редких или низкочастотных антител.
Целью метода «BSelex» является выявление антиген-специфических антител из циркулирующих периферических моноядерных клеток крови у доноров человека, а также изоляция и восстановление последовательностей этих антител для дальнейшего анализа. Этот метод использует цитометрию потока и сортировки клеток, чтобы воспользоваться рецептором В-клеток (BCR), выраженным на поверхности клеток памяти В. Миллионы В-клеток могут быть проверены на антиген-специфическость с помощью цитометрии потока, прежде чем более низкой пропускной способностью молекулярной биологии методы инициируются. Парная тяжелая и световая цепная идентификация невозможна в большинстве методов NGS, которые анализируют клеточные последовательности оптом. В методе, который мы описываем здесь, клетки изолированы по отдельности, и парное восстановление как тяжелых, так и световых цепных последовательностей возможно, что позволяет прямое клонирование и выражение полного IgG.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:681px;" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter</td>
			<td style="width:136px;">MoFlo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Biotinylated peptides</td>
			<td style="width:136px;">New England Peptide</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Cell sorting &#34;bait&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Micro Bio-spin P30 gel column</td>
			<td style="width:136px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">#7326223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Streptavidin (R-PE)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SA10041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Streptavidin (APC)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S32362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">CD22 MicroBeads, human&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;">#130-046-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LS columns</td>
			<td style="width:136px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;">#130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Pre separation filters&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;">#130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD#340951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PE-Cy7 mouse anti-human CD27&#160;</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">#560609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">FITC mouse anti-human IgG</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">#560952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DAPI</td>
			<td style="width:136px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNaseOUT</td>
			<td style="width:136px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Bovine serum albumin, Fraction V</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI media</td>
			<td style="width:136px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">#SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">HI FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mastercycler Gradient</td>
			<td style="width:136px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model #6325</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR 96-well plates</td>
			<td style="width:136px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">MPS-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Plate mats</td>
			<td style="width:136px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">SMX-PCR96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix</td>
			<td style="width:136px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">#639125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Superscript IV First-strand synthesis system</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#18091050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-531-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Platinum polymerase</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#10966108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:136px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">assorted</td>
			<td>Primers for all PCR steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">PCR Purification kit</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Miniprep Kit</td>
			<td style="width:136px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">#27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:136px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">E5520S</td>
			<td>Gibson assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Expi293 Expression Media</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A14351-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">ExpiFectamine 293 Transfection Kit</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A14525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Opti-MEM Media</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">CO2 incubator (Multitron)</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Octet&#160;RED384 System</td>
			<td style="width:136px;">Pall/ Forte Bio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#15500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">#3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody</td>
			<td style="width:136px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:119px;">#109-036-097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td style="width:136px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:119px;">#115-035-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)&#160;</td>
			<td style="width:136px;">KPL</td>
			<td style="width:119px;">#52-00-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">TMB Stop Solution</td>
			<td style="width:136px;">KPL</td>
			<td style="width:119px;">#50-85-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell screening method for the selection and recovery of antibodies with desired specificities from enriched human memory b cell populations

Репертуар человеческих антител представляет собой в значительной степени неиспользованный источник потенциальных терапевтических антител и полезных биомаркеров. В то время как современные вычислительные методы, такие как секвенирование следующего поколения (NGS), дают огромные наборы данных о репертуаре антител на уровне последовательности, функциональные данные необходимы для определения того, какие последовательности имеют отношение к конкретному антигену или набору Антигенов. Здесь мы описываем метод выявления и извлечения отдельных антиген-специфических антител из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК) от донора крови человека. Этот метод использует первоначальное обогащение зрелых В-клеток и требует сочетания фенотипических маркеров клеток и флуоресцентно помеченного белка, чтобы изолировать клетки памяти IgG B через цитометрию потока. Переменные области тяжелой и легкой цепи затем клонируются и повторно проверяются. Хотя этот метод ограничен отсеком ячейки памяти B, он использует цитометрию потока, чтобы допросить миллионы В-клеток и возвращает парные тяжелые и светлые цепные последовательности из одной ячейки в формате, готовом к выражению и подтверждению специфичности. Антитела, извлеченные с помощью этого метода, могут быть рассмотрены для терапевтического потенциала, но также могут связать специфичность и функции с биоинформатическими подходами для оценки репертуара B-клеток в организме человека.

Этот метод охватывает многоступенчатый процесс изоляции антигенных антител от человеческих доноров. В репрезентативных данных, показанных здесь, клетки были инкубированы с бассейном флуоресцентно помеченных пептидов, представляющих несколько различных областей тау белка, в том числе фосфорилированных пептидов для имитации хосфорилирования сайтов. Эти пептиды были использованы в качестве "приманки" для выявления клеток, которые реактивна с тау эпитопы (ы) интерес. В рамках подготовки к сортировке для идентификации использовалась панель флуоресцентно маркированных фенотипических маркеров для идентификации различных популяций клеток в обогащенной популяции входящих в группу входящих в группу В. Серия ворот цитометрии были разработаны, чтобы изолировать целевые клетки памяти B(рисунок 1). Лимфоциты были изолированы на основе их размера клетки и детализации с использованием переднего рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) участков в потоке цитометрии6,7. После исключения нескольких клеток ("дублеты") и мертвых клеток, фенотипические маркеры позволили сегрегации IgGи памяти B-клеток через IgG, CD19 (B-клетки) и CD27 (память). При таком подходе маркер CD27 не распределяется на две отдельные популяции, поэтому для конечных ворот включены 45% лучших 45% клеток CD27и выражения. Наконец, клетки, дважды положительные для APC и PE фторфоров распространять в верхнем правом квадранте gating графа, что свидетельствует о реактивности обеих помеченных версий пептидов. Клетки, попавший в нарисованные ворота, были изолированы и отсортированы по отдельным колодцам 96-колодца. Использование антигена с двумя различными метками увеличивает соотношение сигнала к шуму и уменьшает количество ложных срабатываний в последующем процессе молекулярной биологии. Отсортированные ячейки составляли около 0,1% клеток памяти B в конечных воротах и 0,001% от исходного образца ячейки.
Первое считывание одноклеточного клонирования является подтверждением усиления соответствующих тяжелых и легких переменных цепей(рисунок 2). Так как парное восстановление обоих ампилонов желательно, реакции ПЦР оцениваются бок о бок на гель агарозы, и соответствующие пары вырезаются из геля и фрагментов ДНК извлечены. Типичная эффективность усиления составляет 30-50% тяжелой цепи и 50-70% легкой (каппа) цепи. Восстановление парных ампиктонов, как правило, между 25-40% эффективности. Эти показатели варьируются в зависимости от донорских пулов, и репрезентативные данные(рисунок3) являются примером очень эффективного усиления из 24 одиночных клеток (42% парного восстановления). После клонирования IgG вектор экспрессии IgG трансфицируется в эмбриональные почки человека (HEK-293), которые используются для максимального выражения. Использование среды, свободной от сыворотки, уменьшает загрязняющие белки из рекомбинантных антител и помогает свести к минимуму шум в последующих связывающих анализах. Восстановленные антитела проверяются на исходной панели тау пептидов и забил для реактивности ELISA (Рисунок 4). Первоначальный порог OD 0.5 выше фона используется для обозначения положительной реактивности антигена, а белок «Актин» используется в качестве контроля для неспецифической связывания. Если цитометрия потока и сортировки шаги использовать смешанный пул пептидов, скрининг ELISA является первым шагом deconvoluting конкретных реактивности восстановленных IgGs. Три из 10 IgGs асссеянели продемонстрировали реактивность против фосфорилированного пептида CBTAU22.1, и один был реактивным к нефосфорилированной CBTAU27.1 (Рисунок 4A). Дополнительное подтверждение было завершено с использованием кривой концентрации тех же рекомбинантных образцов антител против пептидов, определенных на первоначальном экране, и дополнительного пептида в качестве отрицательного контроля(рисунок 4В). Для каждого положительного удара отдельный плазмидный клон был изолирован от преобразованного пула и подтвержден тем же методом ELISA. Только клон 34 показано данные, представленные, и в то время как реактивность к нефосфорилированной CBTAU27.1 было подтверждено, более низкая сродство связывания также наблюдается с фосфорилированным 27,1 пептид (Рисунок 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig1.jpg"> Рисунок 1 : Изоляция антиген-реактивных одиночных клеток через цитометрию потока. (A) Показано репрезентативное участок, где популяция лимфоцитов содержалась в нарисованных воротах. (B) Ворота на основе переднего и бокового рассеяния (FSC-высота v FSC-ширина (R3); SSC-высота v SSC- ширина (R4)) были использованы для исключения дублетов. Только ячейки внутри нарисованных ворот оценивались в последующих участках. Клетки DAPIбыли признаны мертвыми и исключенными (R5). В этом эксперименте были допрошены 3,7 х 107 "живых" клеток. Большинство живых клеток были В-клетки (CD19)и IgGq клетки (4.66%) были изолированы от этой популяции (R6). Лучшие 43,2% CD27-выражающие ячейки памяти были включены в ворота отбора (R7). (C) Квадрант 2 (No2) содержал клетки, реактивные как помеченные антигены (пептид-APC v пептид-PE), и эти клетки были отсортированы и восстановлены индивидуально в 96-хорошую пластину. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig2.jpg"> Рисунок 2 : Усиление ПЦР восстанавливает тяжелую и легкую переменную последовательность IgG для клонирования. (A) Как тяжелые (VH) и легкие (Vk или Vl) переменные области цепи восстанавливаются с помощью вложенных реакций ПЦР. Шаг I праймеры усиливают вперед от родной последовательности лидера и обратного изнутри постоянной области. Несколько стрелок представляют собой пул между 7-12 грунтовки, которые используются для обеспечения широкого охвата возможных зародышевых линий. Шаг II праймеры вложены, специфические для крайних концов переменной открытой рамки чтения, и добавить последовательность к концам амблонов, которые гомологичны к соседней последовательности в векторе выражения. (B) Связной состоит из постоянной световой цепи (Ck или Cl), а затем тяжелые цепи промоутер и неродной сигнал пептид последовательности. Ампликоны, связующие и плазмидные позвоночника одновременно сливки через перекрывающиеся гомологичные последовательности, генерируемые во время шага II PcR усиления, и изолированы как нетронутыми плазмиды. Рекомбинантные тяжелые и легкие цепи в конечном векторе экспрессии управляются независимыми (и идентичными) промоутерами ЦМВ и переводятся как отдельные белки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig3.jpg"> Рисунок 3 : Тяжелые и легкие ампиконы переменной цепи IgG извлекаются из одиночных ячеек. Вложенные реакции ПЦР (Шаг II) были непосредственно загружены на 1% геля агарозы и визуализированы. Тяжелая цепь (H) и каппа световой цепи (L) ПЦР реакции из той же ячейки были загружены в соседних скважинах так парные ампликоны были легко наблюдаться. Успешные тяжелые и легкие цепи продукции примерно 400 bp и 350 bp соответственно. Успешное восстановление парных ампелонов обозначается (кв). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig4.jpg"> Рисунок 4 : Антигенная специфичность подтверждается рекомбинантными IgGs. Плазмиды, содержащие восстановленные тяжелые и световые цепные последовательности, трансфицируются в клетки HEK для выражения. Через четыре дня рекомбинантные антитела оцениваются ELISA на реактивность. (A) Концентрация IgG в уточненных носителях была измерена и разбавлена до 20 мкг/мл. Бассейн пептидов, используемых для сортировки, был индивидуально оценен с использованием 40 рмоль на скважину в стрептавидиновых пластинах. Все IgGs были протестированы в дублирующих скважинах. (B) Клоны, которые отображаются OD450 измерения йgt;0.5 были переоценены (клоны #32, #34, #35) с помощью 1:5 разбавления шаги против пептидов, определенных на экране. (C) После подтверждения в качестве хита, один клон плазмида был изолирован от клона #34 преобразованы перевязки, транссексуалов, и подтверждено ELISA. То же самое было сделано для клонов #32 и #35 (данные не показаны). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations at JoVE.com

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

Метод BSelex для выявления и восстановления отдельных антиген-специфических антител из человеческих периферических клеток крови сочетает в себе цитометрию потока с одноклеточным ПЦР и клонированием.

Одноклеточный метод скрининга для отбора и восстановления антител с желаемой спецификой от обогащенной человеческой памяти B Популяции клеток

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он может быть использован для допроса иммунного репертуара человеческих доноров для выявления редких, антиген-специфических В-клеток. Этот метод позволяет нам получить родные парные тяжелые и легкие цепи, которые могут быть быстро клонированы, а затем непосредственно протестированы против антигена или антигенов, представляющих интерес. Демонстрацией процедуры будет Майк Мортон, техник из нашей лаборатории.По крайней мере, через час после оттаивания и восстановления, собирать донора PBMC путем центрифугации. И повторно приостановить клетки в 50 миллилитров ледяной МЕУ Буфер для подсчета. Пеллет клетки другой центрифугации, и изолировать CD22-положительных B-клеток путем положительного отбора с CD22 микробусов в соответствии со стандартными протоколами.Соберите бисер изолированных CD22-положительных клеток центрифугации и повторного перерасхода клеток в четыре раза 10 до седьмой клетки на миллилитр концентрации буфера Vax. Добавьте коктейль антител IgG CD19 CD27 к клеткам согласно рекомендациям разбавления производителя с нежным смешиванием, и aliquot 10 к седьмым клеткам в трубку микроцентрифуга 1.5 миллилитров для отрицательного управления. Добавьте двухмаркированные биотиновые тетрапидиновые тетрамеры в отрицательную контрольную трубку при конечной концентрации 36 наномолярных каждый с PE и APC, умноженных на количество пептидов в сорте трубки.Принесите окончательный объем в каждой трубке 2,5 миллилитров со свежим буфером Vax и добавить пептид тетрамеры в трубу рода на 36 наномолярных каждый PE и APC. После центрифугирования, довести клетки до двух раз от 10 до 6 на 100 микролитров концентрации TBS для 30 до 60 минут инкубации, в темноте, при четырех градусах по Цельсию, с вращением. В конце инкубации, мыть клетки два раза в свежем буфере TBS на стирку, прежде чем напрягать образцы в отдельные пять миллилитров фильтр-шапка труб.Пятно образцов с 0,3 микромоляной конечной концентрации DAPI в качестве маркера целостности клеточной мембраны. И запустите весь отрицательный контроль на сортаторе клеток, чтобы установить ворота цитометрии потока для изоляции соответствующих популяций клеток для сортировки одной ячейки. Участок антиген PE против антигена APC и установить R8 ворота в качестве антигена PE-положительный, и APC-положительный квадрант с низким числом событий в двойных положительных ворот.Затем сортируют один CD19-положительный CD27-положительный антиген PE-положительный, антиген APC-положительные клетки в отдельные скважины Master Mix подготовленных 96 пластины скважины. В конце сортировки накройте пластину алюминиевыми ленточных прокладками и центрифуга клетки в течение одной минуты при 400 раз г до хранения минус 80 градусов. Для выполнения обратной реакции транскриптазы, оттепель отсортированы B-клеток на льду в течение двух минут, прежде чем спиннинг пластины в течение двух минут при 3300 раз г тянуть содержимое хорошо в нижней части пластины перед открытием.После лечения клеток с соответствующим ферментом Master Mix, добавить 2,5 микролитров бесплатной ДНК в качестве шаблона для каждой реакции ПЦР, и добавить грунтовки к окончательной концентрации 1 микромолара для каждой реакции. Затем добавьте 2X концентрацию буфера полимеразы 10X к каждой хорошо, чтобы довести окончательный объем до 25 микролитров на реакцию. И запустить тяжелые и легкие цепные реакции ПЦР каждый в течение 50 циклов.В конце реакции, запустить образцы на 1%agarose гель для визуализации положительных хитов усиления. Изолировать как парные тяжелые, так и световые цепные реакции от одной и той же клетки через извлечение геля. Определите концентрацию фрагмента ДНК по оптической плотности до 60 для точных расчетов перевязки смеси.Объедините восстановленные тяжелые и световые фрагменты цепи с фрагментом связующим звеном и основой вектора выражения, используя четырехсерийную реакцию перевязки в соответствии с инструкциями производителя. И трансформировать перевязотические реакции в химически компетентные бактерии в соответствии с инструкциями производителя. После того, как покрытием на антибиотик пластины, добавить четыре миллилитров среднего роста с антибиотиками к оставшейся культуры трансформации для инкубации ночь при 37 градусов по Цельсию на 250 вращений в минуту.На следующее утро подготовьте минипреп ДНК из ночных культур перевязки в соответствии с инструкциями производителя и определите полученную концентрацию плазмидной ДНК. Чтобы подтвердить антигенную специфичность изолированных антител, трансфект 10 микрограммов ДНК минипрепа с катионическим липидным реагентом в 10 миллилитровой суспензии 293 клеток. Инкубировать клеточной культуры три-четыре дня при 37 градусах по Цельсию и 8%углекислого газа и 125 вращений в минуту.В конце инкубации центрифугировать культуру в течение 10 минут при 1000 раз г, и восстановить очищенную среду. Измерьте концентрацию IgG в супернатанте через сродство к протеину a и испытаете каждое антитело в supernatant на концентрации 25 микрограмма в миллилитр ELISA против индивидуальных пептидов используемых для вида согласно стандартным протоколам ELISA. Затем подтвердите положительные попадания экрана с помощью дополнительного ELISA, используя разбавления супернатанта IgG для создания кривой концентрации, начиная с 20 микролитров на миллилитр и построения против оптической плотности для каждого антигена, показывающего реактивность к первоначальному экрану ELISA.Чтобы изолировать специфические антитела антигена от доноров человека, можно разработать ряд цитометрийных ворот, чтобы изолировать целевые в-клетки памяти. Лимфоциты изолированы в зависимости от размера клетки и детализации, используя вперед и стороны рассеяния. После исключения дублетов и мертвых клеток фенотипические маркеры позволяют сегрегацию IgG-положительных CD19-положительных B-клеток и CD27-положительных В-клеток памяти.Первое считывание одноклеточного клонирования является подтверждением усиления соответствующих тяжелых и легких переменных цепочек. Вот пример очень эффективного усиления из 24 одиночных ячеек с 42%-парным восстановлением после показанного ПЦР. После клонирования IgG вектор экспрессии IgG трансспектирован в эмбрионационную почку человека 293 клетки.Восстановленные антитела проверяются на оригинальную панель пептидов Тау, забитых для реактивности ELISA. Дополнительное подтверждение затем завершается с использованием кривой концентрации тех же рекомбинантных образцов антител против пептидов, выявленных на начальном экране. Для каждого положительного удара индивидуальный плазмидный клон может быть изолирован от преобразованного пула и подтвержден тем же методом ELISA.Целью является усиление последовательностей из одиночных ячеек, поэтому самое главное помнить, что любое загрязнение будет усилено во время ПЦР часть этой процедуры. Эта процедура дает нетронутыми рекомбинантных антител человека, что позволяет для очистки и функциональной характеристики столько антител, сколько вы хотите генерировать.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Мыши с Предустановленные Т Особенности клеточного рецептора Против Toxoplasma гондий, Полученные через SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Количественная оценка иммунных клеток в поврежденный спинной ткани шнура с помощью проточной цитометрии: Роман Используйте для метода очистки сотовый

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Масштабируемость Высокая пропускная Выбор фага-дисплее синтетических библиотек антител

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Получение одноклеточные подвесок для Cytofluorimetric анализа из различных регионов мышиной кожи

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Быстрая и конкретная оценка галогенирующего пероксидазной активности в лейкоцитами обогащается проб крови

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Простой эритроцит Лизис Метод создании B лимфобластоидная клеточных линий

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...