Name: in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

Nous remercions le Dr Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) pour les discussions et l'utilisation de l'équipement. Nous remercions le Dr Juergen K. Willmann pour son mentorat. Cette étude a été appuyée par la subvention du NIH R21EB022214 (KEW), la subvention de formation NIH R25CA118681 (KEW) et le NIH K99EB023279 (KEW). Le Stanford Neuroscience Microscopy Service a été soutenu par NIH NS069375.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité administratif institutionnel sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC) de l'Université Stanford.
1. Modèle de souris transgénique du développement du cancer du sein
<ol><li>Observez des souris du modèle désiré de cancer pour la croissance appropriée de tumeur par l'intermédiaire de la palpation ou de la mesure d'étrier avant de procéder. REMARQUE : Ici, le modèle murin transgénique du développemen...

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Cette méthode comporte plusieurs étapes critiques et nécessite des modifications potentielles pour assurer une mise en œuvre réussie. Tout d'abord, la posologie et le moment de l'injection intraveineuse d'anticorps/anticorps conjugués doivent être adaptés à l'application spécifique. En général, des doses doivent être utilisées qui sont compatibles avec la façon dont le conjugaison d'anticorps sera généralement utilisé, c'est-à-dire, des doses assorties de l'anticorps thérapeutique ou de l'agent de con...

Les anticorps monoclonaux (mAb) sont de grandes glycoprotéines (environ 150 kDa) de la superfamille d'immunoglobuline qui sont sécrétées par les cellules B et ont une fonction primaire dans le système immunitaire pour identifier et inhiber la fonction biologique de, ou marquer pour pathogènes bactériens ou viraux, et peuvent reconnaître l'expression protéique anormale sur les cellules cancéreuses1. Les anticorps peuvent avoir une affinité extrêmement élevée avec leurs épitopes spécifiques jusqu'aux concentrations femtomolaires, ce qui en fait des outils très prometteurs en biomédecine2. Avec le développement de la technologie hybridome par Milstein et Kohler (prix Nobel en 1984), la production de mAbs est devenu possible3. Plus tard, mAbs humains ont été générés en utilisant la technologie d'affichage de phage ou souches transgéniques de souris et ont révolutionné leur utilisation comme outils de recherche et thérapeutiquesnouvelles 4,5.
Le cancer est un problème de santé mondial et une cause majeure de décès, créant la nécessité de nouvelles approches pour la prévention, la détection et la thérapie6. Jusqu'ici, les mAbs ont permis l'extraction du rôle des gènes et de leurs protéines dans la tumorigénèse et une fois dirigécontre des biomarqueurs de cancer, peut permettre la détection et la caractérisation de tumeur pour la stratification patiente. Pour la thérapie de cancer, les mAbs bispécifiques, les conjugués anticorps-médicaments, et de plus petits fragments d'anticorps sont développés comme thérapeutiques, et pour l'administration ciblée de drogue pour augmenter l'efficacité thérapeutique7. En outre, les anticorps servent pour le ciblage de biomarqueurs des agents de contraste pour des modalités d'imagerie moléculaire telles que la chirurgie fluorescence-guidée, l'imagerie photoacoustique (PA), l'imagerie moléculaire d'ultrason (US), et l'émission médicalement employée de positron tomographie (PET) ou tomographie calculée par émission de photons (SPECT)8. Enfin, les anticorps peuvent également être utilisés comme agents théranostiques permettant la stratification des patients et la surveillance de la réponse pour les thérapies ciblées9. Par conséquent, les nouveaux mAbs commencent à jouer un rôle critique dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer.
En dépit des progrès critiques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être rendues inefficaces en raison de la complexité de l'environnement de tumeur. Les interactions entre anticorps dépendent du type d'épitopée, c'est-à-dire qu'il soit linéaire ou conformationnel10. En plus de la reconnaissance des antigènes, les anticorps doivent surmonter les barrières naturelles telles que les parois des vaisseaux, les membranes basales et le stroma tumoral pour atteindre les cellules cibles exprimant l'antigène. Les anticorps interagissent avec le tissu non seulement à travers le domaine de liaison d'antigène à fragment variable (Fab), mais aussi à travers le fragment cristallin constant (Fc) qui conduit à des interactions hors site11. Le ciblage est également compliqué par l'expression hétérogène des marqueurs de tumeur tout au long du volume de tumeur et de l'hétérogénéité dans la vascularisation de tumeur et le système lymphatique12,13. En outre, le microenvironnement de tumeur est composé des fibroblastes cancer-associés qui soutiennent des cellules de tumeur, des cellules immunitaires de tumeur qui suppriment des réactions immunitaires antitumorales, et de l'endothélium de tumeur qui soutient le transport de l'oxygène et des éléments nutritifs, tous des qui interfèrent avec la pénétration, la distribution et la disponibilité de thérapies ou de diagnostics à base d'anticorps. Dans l'ensemble, ces considérations peuvent limiter l'efficacité thérapeutique ou diagnostique, réduire la réponse au traitement, et peut entraîner une résistance tumorale.
Par conséquent, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction de la conjugaison à base d'anticorps dans le microenvironnement tumoral. Actuellement, dans les études précliniques, l'expression de marqueur dans les modèles de recherche de tumeur est analysée ex vivo par la coloration d'immunofluorescence (IF) des sections de tumeur14. La coloration standard de SI est exécutée avec les anticorps marqueurs-spécifiques primaires qui sont alors accentués par les anticorps fluorescents secondaires sur des tranches de tissu de tumeur ex vivo qui ont été isolées de l'animal. Cette technique met en évidence l'emplacement statique du marqueur au moment de la fixation du tissu et ne donne pas un aperçu de la façon dont les traitements ou les diagnostics à base d'anticorps pourraient se répartir ou interagir dans des conditions physiologiques. L'imagerie moléculaire par PET, SPECT, US, et PA peut fournir des informations sur la distribution d'agent de contraste conjugué par anticorps dans les modèles précliniques vivants8,15. Comme ces modalités d'imagerie ne sont pas invasives, des études longitudinales peuvent être effectuées et des données sensibles au temps peuvent être recueillies avec un nombre minimal d'animaux par groupe. Cependant, ces approches d'imagerie moléculaire non invasives ne sont pas assez sensibles et n'ont pas une résolution suffisante pour la localisation de la distribution des anticorps au niveau cellulaire. En outre, les caractéristiques physiques et biologiques de l'anticorps primaire peuvent être radicalement modifiées par la conjugaison d'un agent de contraste16.
Afin de prendre en considération les conditions physiologiques et pathologiques in vivo de la façon dont les thérapies et les diagnostics à base d'anticorps interagissent dans l'environnement tumoral et d'obtenir une distribution cellulaire et même sous-cellulaire à haute résolution profils des anticorps non conjugués, nous proposons une approche de IF, réputée localisation d'immunofluorescence in vivo (IVIL), dans laquelle l'anticorps antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo. Le thérapeutique ou le diagnostic à base d'anticorps, agissant comme un anticorps primaire, circule dans les vaisseaux sanguins fonctionnels et se lie à sa protéine cible dans le cadre tumoral très précis et vivant. Après l'isolement des tumeurs in vivo-étiquetées avec l'anticorps primaire, un anticorps secondaire est employé pour localiser les conjugués accumulés et retenus d'anticorps. Cette approche est similaire à une approche d'histologie DE LA SI précédemment décrite injectant des anticorps étiquetés fluorescents17. Bien qu'ici, l'utilisation d'anticorps non conjugués évite un changement potentiel dans les caractéristiques de biodistribution induites par la modification des anticorps. En outre, l'application ex vivo d'anticorps secondaires fluorescents évite une perte possible du signal de fluorescence pendant la collecte et le traitement des tissus et fournit l'amplification de l'intensité du signal de fluorescence. Notre approche d'étiquetage reflète la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents ciblés et peut fournir des informations importantes pour le développement de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques.
Ici, nous décrivons deux applications de la méthode IVIL appliquées dans des études précédentes portant sur la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste à base d'anticorps pour les approches d'imagerie moléculaire pour la détection du cancer du sein. Tout d'abord, la biodistribution d'un colorant infrarouge proche de l'anticorps (anticorps-B7-H3 liés au colorant de fluorescence infrarouge proche, vert endocyanine, B7-H3-ICG) et l'agent de contrôle de l'isotype (Iso-ICG) pour la fluorescence et la photoacoustique moléculaire l'imagerie est explorée18. La méthode de cette application est décrite dans le protocole. Ensuite, les résultats de biodistribution d'un anticorps conformationnellement sensible à la netrin-1, généralement non détectable avec l'imagerie FI traditionnelle, utilisé avec l'imagerie moléculaire par ultrasons, est quantifié et présenté dans les résultats représentatifs19. À la fin de ce document de protocole, les lecteurs devraient se sentir à l'aise d'adopter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:990px;" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Model</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td style="width:334px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td>
			<td style="width:196px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:166px;">002374</td>
			<td>Females, 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Handling Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">27G Catheter</td>
			<td style="width:196px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:166px;">Please call to order</td>
			<td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Alcohol Wipes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-246073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Gauze Sponges (4&#34; x 4&#34; 16 Ply)</td>
			<td style="width:196px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:166px;">2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Heat Lamp</td>
			<td style="width:196px;">Morganville Scientific</td>
			<td style="width:166px;">&#160;HL0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:196px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:166px;">29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:196px;">3M</td>
			<td style="width:166px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue Collection</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable Base Molds</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical London Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11080-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:166px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antibodies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-594 goat anti-human IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IgG Isotype Control</td>
			<td style="width:196px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:166px;">NBP1-97043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humanized anti-netrin-1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Netris Pharma</td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>contact@netrispharma.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td style="width:166px;">ab134161</td>
			<td>EPNCIR122 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:166px;">550274</td>
			<td>MEC 13.3 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Reagents</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Clear Nail Polish</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Any local drug store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Indocyanine Green - NHS</td>
			<td style="width:196px;">Intrace Medical</td>
			<td style="width:166px;">ICG-NHS ester</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">TA-006-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">ICN19135680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Adhesion Glass Slides</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Desalting Columns</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass Cover Slips</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">12-544G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:166px;">22311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Slide Staining Tray</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">87000-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Software</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FIJI</td>
			<td style="width:196px;">LOCI, UW-Madison.</td>
			<td style="width:166px;">Version 4.0</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des outils importants dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer. Ils sont utilisés pour démêler le rôle des protéines dans la tumorigénèse, peuvent être dirigés vers les biomarqueurs du cancer permettant la détection et la caractérisation des tumeurs, et peuvent être utilisés pour la thérapie contre le cancer comme mAbs ou des conjugués anticorps-médicaments pour activer les cellules effectrices immunitaires, pour inhiber voies de signalisation, ou tuer directement les cellules porteuses de l'antigène spécifique. En dépit des progrès cliniques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être altérées par la complexité et l'hétérogénéité du microenvironnement de tumeur. Ainsi, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction du conjugué à base d'anticorps avec le microenvironnement tumoral vivant. Ici, nous décrivons In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) comme une nouvelle approche pour étudier les interactions des thérapies et des diagnostics basés sur les anticorps dans les conditions physiologiques et pathologiques in vivo. Dans cette technique, un anticorps thérapeutique ou diagnostique d'antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo et localisé ex vivo avec un anticorps secondaire dans les tumeurs isolées. IVIL reflète donc la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents de ciblage. Deux applications IVIL sont décrites évaluant la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste basés sur les anticorps pour l'imagerie moléculaire du cancer du sein. Ce protocole permettra aux futurs utilisateurs d'adapter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.

La méthode IVIL a été utilisée ici pour examiner la biodistribution in vivo et l'interaction tissulaire de B7-H3-ICG et Iso-ICG, en permettant aux agents, après injection intraveineuse dans un animal vivant, d'interagir avec le tissu cible pendant 96 h, puis une fois que les tissus sont d'agir comme les principaux anticorps pendant l'immunostaining ex vivo. La méthode IVIL a également été comparée à la coloration standard ex vivo IF des tissus pour le marqueur B7-H3. Les glande...

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In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

La méthode de localisation de l'immunofluorescence in vivo (IVIL) peut être utilisée pour examiner la biodistribution in vivo d'anticorps et d'anticorps conjugués à des fins oncologiques chez des organismes vivants à l'aide d'une combinaison de ciblage tumoral in vivo et d'immunostaining ex vivo Méthodes.

In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Ce protocole pour la localisation in vivo d’immunofluorescence, ou IVIL, évalue la biodistribution in vivo des anticorps diagnostiques et thérapeutiques ou des agents anticorps-basés pour la recherche, la détection, et le traitement de cancer. Contrairement à la coloration immunofluorescente conventionnelle où l’expression cellulaire des antigènes est révélée ex vivo, la méthode IVIL élucide la façon dont les anticorps et les agents à base d’anticorps se répartir chez l’animal vivant. Cette vidéo aidera à comprendre le flux de travail global de la méthode IVIL.Il montre des détails importants pour la reproduction réussie du protocole pour d’autres applications et anticorps. Observez les souris du modèle de cancer désiré pour la croissance appropriée de tumeur par l’intermédiaire de la palpation ou de la mesure d’étrier avant de procéder. Purifiez les anticorps anti-souris B7-H3 et lapin IgG sur une colonne de désaltage afin d’éliminer les agents de conservation et les tampons de stockage selon les instructions du fabricant.Aliquot dosages de 33 microgrammes de chaque anticorps conjuguer dans les tubes de microcentrifugeuse individuels. Après l’anesthésie décrite dans le protocole de texte, préparez-vous à l’inoculation de veine de queue des solutions d’anticorps. Désinfecter la queue de l’animal en essuyant trois fois avec un lingette d’alcool.Dilater les veines de la queue en chauffant avec un coussin chauffant pendant environ 30 secondes. Évitez de chauffer tout l’animal. À l’aide d’un cathéter de veine de queue de calibre 27, insérez l’aiguille du papillon dans l’une des deux veines latérales de la queue.Visualisez le flux sanguin dans le cathéter pour vous assurer que l’aiguille est bien placée afin que les solutions entrent pleinement dans l’animal plutôt que d’être capturées dans la queue. Utilisez un morceau de ruban chirurgical pour fixer soigneusement la queue avec l’aiguille insérée à la scène. Rincer le cathéter avec 25 microlitres de solution saline stérile tamponnée de phosphate.Ensuite, injectez la solution d’anticorps dans le cathéter à l’aide de seringues à insuline. Rincer le cathéter une fois de plus avec 25 microlitres de PBS stérile. Retirez l’aiguille de la queue et appliquez de la pression pour arrêter tout saignement.Effectuez l’euthanasie humaine de la souris comme décrit dans le protocole de texte, et mentez la souris dans la position de supination. Utilisez des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour exciser les tissus tumoraux. Utilisez des forceps pour saisir seulement la couche externe de la peau entre l’ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue, et faire une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux.Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe, et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane abdominale sous-jacente de la paroi abdominale, la gardant intacte. Faire une incision verticale jusqu’à l’abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre la troisième et la quatrième glande mammaire, faire une coupe horizontale à travers l’abdomen pour permettre la rétractation de la peau et la visualisation des glandes mammaires.Saisir chaque tumeur ou glande normale avec des forceps, couper soigneusement la peau attachée à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Placez les tissus excisés dans des moules de base jetables en tissu qui sont préétiquetés et remplis d’un milieu d’intégration optimal de la température de coupe. Congeler rapidement les moules par placement sur la glace sèche.Afin d’étudier la livraison hors cible, exciser d’autres tissus ou organes d’intérêt. À l’aide d’un cryostat, sectionne les blocs de tissu congelés à 10 microns d’épaisseur et placez les sections adjacentes sur des toboggans en verre d’adhérence préétiquetés. Rincer les diapositives de tissu congelées avec pbs température ambiante pendant cinq minutes pour enlever le milieu d’intégration.Délimiter les sections tissulaires à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe pour réduire le volume de solutions nécessaires lors de la coloration. Fixer les sections tissulaires avec 4% de solution de paraformaldéhyde pendant cinq minutes. Après avoir rinçant les diapositives dans PBS pendant cinq minutes, perméabiliser les sections tissulaires avec 0,5%Triton X-100 en PBS pendant 15 minutes.Rincez les diapositives à nouveau dans PBS pendant cinq minutes. Bloquer les tissus avec PBS contenant 3% de poids par volume albumine de sérum bovin et 5% de volume par volume sérum de chèvre pendant une heure à température ambiante. Après avoir rinçant les glissières dans PBS pendant cinq minutes, incuber les sections avec des anticorps primaires de tenue de dossiers tels qu’un marqueur nucléaire, vasculaire ou cytoplasmique commun.Ici, rat anti-souris CD31 est utilisé à une dilution d’un à 100 dans la solution de blocage. Les toboggans avec anticorps primaires sont laissés pendant la nuit à quatre degrés Celsius, à l’abri de la déshydratation sur un plateau de diapositives. Après l’incubation, rincer les glissières dans PBS pendant cinq minutes trois fois.Changez le PBS à chaque fois. Incuber les diapositives avec des anticorps secondaires pour étiqueter les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l’anticorps anti-B7-H3 à l’aide d’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué Alexa Fluor 546, et visualisez le CD31 avec l’anticorps secondaire anti-rat Alexa Fluor 488 dans la solution de blocage.Protégez les glissières de la lumière et de la déshydratation sur un bac à glissière pendant une heure à température ambiante. Après le rinçage des diapositives dans PBS comme avant, appliquer une goutte du milieu de montage dans le centre de la tranche de tissu. Placez soigneusement un coverslip, en évitant le piégeage des bulles d’air.Sceller les bords du coverslip avec du vernis à ongles clair, et laisser sécher. Procéder à l’imagerie par microscopie confocale et à l’analyse quantitative de l’image telle que décrite dans le protocole de texte. Les micrographes confocal représentatifs montrent la comparaison de la localisation conjuguée d’anticorps-ICG de B7-H3 spécifique et de la localisation conjuguée d’anticorps-ICG de contrôle non spécifique d’isotype dans les glandes mammaires murines contenant les tissus normaux ou carcinomes.Glandes mammaires murines normales d’un animal injecté par voie intraveineuse avec Iso-ICG ou B7-H3-ICG et contre-tachées de CD31 ne montrent aucune coloration des conjugués anticorps. Les tissus normaux se sont montrés pour n’avoir aucune expression de B7-H3 par la coloration standard d’immunofluorescence d’ex vivo. Dans les tumeurs mammaires invasives, B7-H3-ICG se lie fortement à la vascularisation, le premier point de contact in vivo, puis est capable d’extravaser de la vascularisation pour tacher hétérogènement l’épithélium tumoral.Iso-ICG montre l’accumulation non spécifique dans les tissus de tumeur. La coloration immunofluorescente ex vivo standard montre l’expression uniforme du marqueur B7-H3 sur les cellules épithéliales et endothéliales. Les micrographes confocal représentatifs montrent la méthode in vivo de localisation d’immunofluorescence pour détecter l’expression netrin-1 ou l’expression de contrôle d’isotype dans le carcinome murin et les glandes mammaires normales.La localisation in vivo d’immunofluorescence confirme le signal épithélial pour netrin-1 dans les tumeurs de MMTV-PyMT mais pas dans les glandes mammaires normales. En outre, il y a un signal netrin-1 fort sur des cellules endothéliales dans des tumeurs de sein, comme indiqué par le signal jaune colocalisé. Le signal est significativement plus faible dans les glandes mammaires normales.La méthode IVIL devra être optimisée en termes de dosage des anticorps, de synchronisation de la collecte des tissus et de dilution secondaire des anticorps pour une mise en œuvre réussie. L’IVIL permet de cibler les épitopes conformationnels qui ne peuvent pas être détectés à l’aide de taches d’immunofluorescence standard, ce qui nécessite un traitement tissulaire. En outre, des organes sains des souris tumeur-roulements peuvent être rassemblés pour évaluer la livraison hors cible des anticorps thérapeutiques.Avec l’utilisation accrue de thérapeutiques à base d’anticorps et d’agents de contraste dans la recherche et la gestion du cancer, la méthode IVIL est très applicable à la recherche et au développement pharmaceutiques. Les chercheurs dans les thérapies de cancer, l’imagerie moléculaire, l’inflammation, et d’autres secteurs peuvent constater que la méthode d’IVIL fournit l’information utile.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules

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Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...