Name: in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

Wir danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) für Diskussionen und den Einsatz von Geräten. Wir danken Dr. Jürgen K. Willmann für seine Betreuung. Diese Studie wurde durch das NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA1118681 Training Grant (KEW) und NIH K99EB023279 (KEW) unterstützt. Der Stanford Neuroscience Microscopy Service wurde von NIH NS069375 unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) der Stanford University genehmigt.
1. Transgenes Mausmodell der Brustkrebsentwicklung
<ol><li>Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell für das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Sattelmessung, bevor Sie fortfahren. HINWEIS: Hier wurde das transgene murinische Modell der Brustkrebsentwicklung (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) verwendet. Die...

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	<li>Forthal, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+Antibodies.">Functions of Antibodies.</a> Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).</li><li>Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. 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Diese Methode hat mehrere kritische Schritte und erfordert potenzielle Änderungen, um eine erfolgreiche Implementierung sicherzustellen. Erstens müssen die Dosierung und das Timing der intravenösen Injektion von Antikörper/Antikörperkonjugat auf die jeweilige Anwendung zugeschnitten sein. Im Allgemeinen sollten Dosierungen verwendet werden, die mit der Art und Weise übereinstimmen, wie das Antikörperkonjugat typischerweise verwendet wird, d. h. passende Dosierungen des therapeutischen Antikörpers oder des Antikö...

Monoklonale Antikörper (mAb) sind große Glykoproteine (ca. 150 kDa) der Immunglobulin-Überfamilie, die von B-Zellen abgesondert werden und eine primäre Funktion im Immunsystem haben, um die biologische Funktion von bakterielle oder virale Krankheitserreger und kann abnorme Proteinexpression auf Krebszellen erkennen1. Antikörper können eine extrem hohe Affinität zu ihren spezifischen Epitopen bis hin zu Femtomolarenkonzentrationen haben, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der Biomedizin2macht. Mit der Entwicklung der Hybridom-Technologie durch Milstein und Köhler (Nobelpreis 1984) wurde die Produktion von mAbs möglich3. Später wurden menschliche mAbs mit der Phagenanzeige-Technologie oder transgenen Mausstämmen erzeugt und revolutionierten ihre Verwendung als neuartige Forschungswerkzeuge und Therapeutika4,5.
Krebs ist ein weltweites Gesundheitsproblem und eine der Hauptursachen für den Tod, was die Notwendigkeit neuer Ansätze für Prävention, Erkennung und Therapie schafft6. Bis heute haben mAbs die Extrication der Rolle von Genen und ihren Proteinen bei der Tumorgenese ermöglicht und können, wenn sie gegen Krebsbiomarker gerichtet sind, die Tumorerkennung und Charakterisierung für die Schichtung des Patienten ermöglichen. Für die Krebstherapie werden bispezifische mAbs, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate und kleinere Antikörperfragmente als Therapeutika entwickelt, und für die gezielte Wirkstoffabgabe zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit7. Zusätzlich dienen Antikörper für die Biomarker-Targeting von Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Modalitäten wie Fluoreszenz-geführte Chirurgie, photoakustische (PA) Bildgebung, Ultraschall (US) molekulare Bildgebung und klinisch verwendete Positronenemission Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT)8. Schließlich können Antikörper auch als Theranost-Wirkstoffe eingesetzt werden, die eine Schichtung der Patienten und eine Reaktionsüberwachung für gezielte Therapien ermöglichen9. Daher beginnen neuartige mAbs eine entscheidende Rolle bei der Krebserkennung, -diagnose und -behandlung zu spielen.
Trotz kritischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen aufgrund der Komplexität der Tumorumgebung unwirksam gemacht werden. Antikörperwechselwirkungen sind abhängig von der Art des Epitops, d.h.,ob es linear oder konform10ist. Neben der Erkennung von Antigenen müssen Antikörper natürliche Barrieren wie Gefäßwände, Basalmembranen und tumorstroma überwinden, um Zielzellen zu erreichen, die das Antigen exdrücken. Antikörper interagieren mit dem Gewebe nicht nur durch die variable Fragmentantigenbindung (Fab) Domäne, sondern auch durch das konstante kristalline Fragment (Fc), das weiter zu off-site Interaktionen führt11. Das Targeting wird auch durch die heterogene Expression von Tumormarkern in der Tumormasse und Heterogenität in der Tumorvaskularisation und dem Lymphsystem12,13erschwert. Darüber hinaus besteht die Tumormikroumgebung aus krebsassoziierten Fibroblasten, die Tumorzellen unterstützen, Tumorimmunzellen, die Anti-Tumor-Immunreaktionen unterdrücken, und dem Tumorendothel, das den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen unterstützt, die das Eindringen, die Verteilung und die Verfügbarkeit von Antikörper-basierten Therapeutika oder Diagnostika beeinträchtigen. Insgesamt können diese Überlegungen die therapeutische oder diagnostische Wirksamkeit einschränken, das Behandlungsverhalten reduzieren und zu Tumorresistenzführen führen.
Daher ist es für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats innerhalb der Tumormikroumgebung zu bewerten. Derzeit wird in präklinischen Studien die Markerexpression in Tumorforschungsmodellen ex vivo durch Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Tumorabschnitten14analysiert. Standard-IF-Färbung wird mit primären markerspezifischen Antikörpern durchgeführt, die dann durch sekundäre fluoreszierend markierte Antikörper auf ex vivo Tumorgewebescheiben hervorgehoben werden, die vom Tier isoliert wurden. Diese Technik hebt die statische Position des Markers zum Zeitpunkt der Gewebefixierung hervor und gibt keinen Einblick, wie sich die antikörperbasierten Therapeutika oder Diagnostika unter physiologischen Bedingungen verteilen oder interagieren könnten. Die molekulare Bildgebung durch PET, SPECT, US und PA kann Informationen über die antikörperkonjugierte Kontrastmittelverteilung in lebenden präklinischen Modellen8,15liefern. Da es sich bei diesen bildgebenden Modalitäten um nicht-invasive, Längsschnittstudien handelt und zeitkritische Daten mit einer minimalen Anzahl von Tieren pro Gruppe gesammelt werden können. Diese nicht-invasiven molekularen bildgebenden Ansätze sind jedoch nicht empfindlich genug und haben nicht genügend Auflösung für die Lokalisierung der Antikörperverteilung auf zellulärer Ebene. Zusätzlich können die physikalischen und biologischen Eigenschaften des primärantikörpers durch die Konjugation eines Kontrastmittels drastisch verändert werden16.
Um die in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen zu berücksichtigen, wie antikörperbasierte Therapeutika und Diagnostika innerhalb der Tumorumgebung interagieren und eine hochauflösende zelluläre und sogar subzelluläre Verteilung zu erhalten Profile von nicht konjugierten Antikörpern schlagen wir einen IF-Ansatz vor, der als In-Vivo-Immunfluoreszenzlokalisation (IVIL) bezeichnet wird, bei dem der antigenspezifische Antikörper intravenös in vivo injiziert wird. Der Antikörper-basierte therapeutische oder diagnostische, als primärer Antikörper wirkt, zirkuliert in funktionellen Blutgefäßen und bindet an sein Zielprotein in der hochgenauen, lebenden Tumorumgebung. Nach isolierung von in vivo-markierten Tumoren mit dem primären Antikörper wird ein sekundärer Antikörper verwendet, um angesammelte und zurückgehaltene Antikörperkonjugate zu lokalisieren. Dieser Ansatz ähnelt einem zuvor beschriebenen IF-Histologie-Ansatz, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper17injiziert werden. Obwohl hier, die Verwendung von nicht konjugierten Antikörpern vermeidet eine mögliche Änderung der Bioverteilungseigenschaften durch Antikörpermodifikation induziert. Darüber hinaus vermeidet die Ex-vivo-Anwendung von fluoreszierendem Sekundärantikörper einen möglichen Verlust des Fluoreszenzsignals während der Gewebeentnahme und -verarbeitung und sorgt für eine Verstärkung der Fluoreszenzsignalintensität. Unser Etikettierungsansatz spiegelt die In-vivo-Biodistribution von Antikörper-basierten Medikamenten und gezielten Wirkstoffen wider und kann wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger diagnostischer und therapeutischer Wirkstoffe liefern.
Hier beschreiben wir zwei Anwendungen der IVIL-Methode, wie sie in früheren Studien zur Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Ansätze zur Brustkrebserkennung angewandt wurden. Erstens die Bioverteilung eines Antikörper-nahen Infrarotfarbstoffkonjugats (Anti-B7-H3-Antikörper, der an den nahen Infrarotfluoreszenzfarbstoff, Indocyaningrün, B7-H3-ICG) und des Isotypkontrollmittels (Iso-ICG) für Fluoreszenz und photoakustische molekulare molekulare Bildgebung wird untersucht18. Die Methode dieser Anwendung wird im Protokoll beschrieben. Als nächstes werden die Bioverteilungsergebnisse eines konformen Antikörpers gegen Netrin-1, der in der Regel nicht mit herkömmlicher IF-Bildgebung nachweisbar ist und mit ultraschallmolekularer Bildgebung verwendet wird, quantifiziert und in den repräsentativen Ergebnissen19dargestellt. Am Ende dieses Protokollpapiers sollten sich leserende Menschen wohl fühlen, wenn sie die IVIL-Methode für ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anwenden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:990px;" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Model</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td style="width:334px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td>
			<td style="width:196px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:166px;">002374</td>
			<td>Females, 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Handling Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">27G Catheter</td>
			<td style="width:196px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:166px;">Please call to order</td>
			<td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Alcohol Wipes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-246073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Gauze Sponges (4&#34; x 4&#34; 16 Ply)</td>
			<td style="width:196px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:166px;">2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Heat Lamp</td>
			<td style="width:196px;">Morganville Scientific</td>
			<td style="width:166px;">&#160;HL0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:196px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:166px;">29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:196px;">3M</td>
			<td style="width:166px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue Collection</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable Base Molds</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-363-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical London Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11080-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:166px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antibodies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-594 goat anti-human IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IgG Isotype Control</td>
			<td style="width:196px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:166px;">NBP1-97043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humanized anti-netrin-1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Netris Pharma</td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>contact@netrispharma.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td style="width:166px;">ab134161</td>
			<td>EPNCIR122 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:166px;">550274</td>
			<td>MEC 13.3 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Reagents</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Clear Nail Polish</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Any local drug store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Indocyanine Green - NHS</td>
			<td style="width:196px;">Intrace Medical</td>
			<td style="width:166px;">ICG-NHS ester</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">TA-006-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">ICN19135680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Adhesion Glass Slides</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Desalting Columns</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass Cover Slips</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">12-544G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:166px;">22311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Slide Staining Tray</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">87000-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Software</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FIJI</td>
			<td style="width:196px;">LOCI, UW-Madison.</td>
			<td style="width:166px;">Version 4.0</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research

Monoklonale Antikörper (mAbs) sind wichtige Instrumente zur Krebserkennung, -diagnose und -behandlung. Sie werden verwendet, um die Rolle von Proteinen in der Tumorgenese zu entwirren, können auf Krebsbiomarker gerichtet werden, die die Erkennung und Charakterisierung von Tumoren ermöglichen, und können für die Krebstherapie als mAbs oder Antikörper-Wirkstoff-Konjugate verwendet werden, um Immuneffektorzellen zu aktivieren, Signalwege oder direkt töten Zellen, die das spezifische Antigen tragen. Trotz klinischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen durch die Komplexität und Heterogenität der Tumormikroumgebung beeinträchtigt werden. Für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika ist es daher entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats mit der lebenden Tumormikroumgebung zu bewerten. Hier beschreiben wir In Vivo Immunofluoreszenzlokalisierung (IVIL) als einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Wechselwirkungen von Antikörper-basierten Therapeutika und Diagnostika unter den in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen. Bei dieser Technik wird ein therapeutischer oder diagnostischer Antigen-spezifischer Antikörper invivo in vivo injiziert und ex vivo mit einem sekundären Antikörper in isolierten Tumoren lokalisiert. IVIL spiegelt daher die In-vivo-Bioverteilung von Antikörper- und Targeting-Mitteln wider. Zwei IVIL-Anwendungen werden beschrieben, um die Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für die molekulare Bildgebung von Brustkrebs zu bewerten. Dieses Protokoll wird es zukünftigen Anwendern ermöglichen, die IVIL-Methode an ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anzupassen.

Die IVIL-Methode wurde hier verwendet, um die In-vivo-Bioverteilung und Gewebeinteraktion von B7-H3-ICG und Iso-ICG zu untersuchen, indem die Wirkstoffe nach intravenöser Injektion in ein lebendes Tier 96 h mit dem Zielgewebe interagieren konnten und geerntet werden, um als primäre Antikörper während der Ex-vivo-Immunfärbung zu fungieren. Die IVIL-Methode wurde auch mit der Standard-Ex-vivo-IF-Färbung der Gewebe für den B7-H3-Marker verglichen. Normale murinische Brustdrüsen drüc...

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In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisationsmethode (IVIL) kann verwendet werden, um die In-vivo-Bioverteilung von Antikörpern und Antikörperkonjugaten für onkologische Zwecke in lebenden Organismen mit einer Kombination aus In-vivo-Tumor-Targeting und Ex-vivo-Immunfärbung zu untersuchen. Methoden.

In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Dieses Protokoll für die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisierung (IVIL) bewertet die In-vivo-Bioverteilung diagnostischer und therapeutischer Antikörper oder Antikörper-basierter Wirkstoffe für die Krebsforschung, -detektion und -behandlung. Im Gegensatz zur herkömmlichen immunfluoreszenten Färbung, bei der die zelluläre Expression von Antigenen ex vivo offenbart wird, erläutert die IVIL-Methode, wie sich Antikörper und Antikörper-basierte Wirkstoffe im lebenden Tier verteilen. Dieses Video wird das Verständnis des gesamten Workflows der IVIL-Methode unterstützen.Es zeigt wichtige Details für eine erfolgreiche Reproduktion des Protokolls für andere Anwendungen und Antikörper. Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell für das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Sattelmessung, bevor Sie fortfahren. Reinigen Sie Kaninchen Anti-Maus B7-H3 und Kaninchen IgG Isotyp-Kontrollantikörper auf einer Entsalzungssäule, um Konservierungsstoffe und Speicherpuffer nach den Anweisungen des Herstellers zu entfernen.Aliquot Dosierungen von 33 Mikrogramm jedes Antikörperkonjugats in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Anästhesisierung, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie sich auf die Endschwanzvenenimpfung der Antikörperlösungen vor. Desinfizieren Sie den Schwanz des Tieres, indem Sie dreimal mit einem Alkoholwisch wischen.Die Schwanzvenen durch Erwärmung mit einem Wärmepolster für ca. 30 Sekunden delateieren. Vermeiden Sie das Erhitzen des gesamten Tieres. Mit einem 27-Spur-Schwanzvenenkatheter legen Sie die Schmetterlingsnadel in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen ein.Visualisieren Sie den Blutrückfluss in den Katheter, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig platziert wird, so dass die Lösungen vollständig in das Tier gelangen, anstatt im Schwanz gefangen zu werden. Verwenden Sie ein Stück operationsekband, um den Schwanz mit der eingesetzten Nadel vorsichtig auf die Bühne zu fixieren. Spülen Sie den Katheter mit 25 Mikroliter steriler Phosphat-gepufferter Saline.Anschließend injizieren Sie die Antikörperlösung mit Insulinspritzen in den Katheter. Spülen Sie den Katheter noch einmal mit 25 Mikroliter sterilem PBS. Entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz, und wenden Sie Druck auf, um jegliche Blutung zu stoppen.Führen Sie eine humane Euthanasie der Maus durch, wie im Textprotokoll beschrieben, und legen Sie die Maus in die Supine-Position. Verwenden Sie chirurgische Schere und Zangen, um Tumorgewebe zu verbrauchen. Verwenden Sie Zangen, um nur die äußere Schicht der Haut zwischen dem Satz der Brustdrüsen am nächsten zum Schwanz zu erfassen, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer chirurgischen Schere.Führen Sie die geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie langsam die Spitze, um die Haut vorsichtig von der darunter liegenden Bauchwandmembran zu trennen und sie intakt zu halten. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in den Bauch, weiterhin die Haut von der inneren Membran zu trennen. Zwischen der dritten und vierten Brustdrüse, machen Sie einen horizontalen Schnitt über den Bauch, um das Zurückziehen der Haut und die Visualisierung der Brustdrüsen zu ermöglichen.Greifen Sie jeden Tumor oder normale Drüse mit Zangen, vorsichtig trimmen Sie die befestigte Haut mit chirurgischer Schere. Legen Sie ausgeschnittene Gewebe in Einweg-Basisformen des Gewebes, die voretikettiert und mit einem optimalen Schnitttemperatur-Einbettmedium gefüllt sind. Die Formen schnell einfrieren, indem man sie auf Trockeneis platziert.Um die Off-Target-Lieferung zu untersuchen, verbrauchen Sie andere Gewebe oder Organe von Interesse. Mit einem Kryostat, Abschnitt gefrorene Gewebeblöcke mit 10-Mikron Dicke, und legen Sie angrenzende Abschnitte auf vorbeschriftete Adhäsion Glasrutschen. Spülen Sie gefroreneGewebe diagletten mit Raumtemperatur PBS für fünf Minuten, um das Einbettmedium zu entfernen.Dearcate Gewebeabschnitte mit einem hydrophoben Barriere-Stift, um das Volumen der Lösungen während der Färbung benötigt zu reduzieren. Fixieren Sie die Gewebeabschnitte mit 4%Paraformaldehyd-Lösung für fünf Minuten. Nach dem Spülen der Dias in PBS für fünf Minuten, permeabilisieren Gewebeabschnitte mit 0,5%Triton X-100 in PBS für 15 Minuten.Spülen Sie die Dias erneut in PBS für fünf Minuten. Blockieren Sie das Gewebe mit PBS mit einem Gewicht von 3 % pro Volumen Rinderserumalbumin und 5 % Volumen pro Volumen Ziegenserum für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem Spülen der Dias in PBS für fünf Minuten, inkubieren Sie die Abschnitte mit Aufzeichnungen primäre Antikörper wie eine gemeinsame kern-, vaskuläre, oder zytoplasmatische Marker.Hier bei einer Ein-zu-100-Verdünnung in der Blockierlösung wird Ratten-Anti-Maus-CD31 eingesetzt. Die Dias mit Primärantikörpern werden über Nacht bei vier Grad Celsius gelassen, geschützt vor Austrocknung auf einem Diatablett. Nach der Inkubation spülen Sie die Dias in PBS dreimal für fünf Minuten.Ändern Sie die PBS jedes Mal. Inkubieren Sie die Dias mit sekundären Antikörpern, um die primären Antikörper zu kennzeichnen. Für diese Anwendung, visualisieren Anti-B7-H3 Antikörper mit Alexa Fluor 546 konjugierten Ziege Anti-Kaninchen-Antikörper, und visualisieren CD31 mit Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Ratten Sekundärantikörper in Blockierlösung.Schützen Sie die Dias eine Stunde lang bei Raumtemperatur vor Licht und Austrocknung auf einem Diatablett. Nach dem Spülen der Dias in PBS wie zuvor, einen Tropfen des Montagemediums in die Mitte der Gewebescheibe auftragen. Legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf, um das Einwickeln von Luftblasen zu vermeiden.Versiegeln Sie die Ränder des Deckels mit klarem Nagellack und lassen Sie sie trocknen. Fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie-Bildgebung und quantitativen Bildanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Repräsentative konfokale Mikrographien zeigen den Vergleich spezifischer B7-H3-Antikörper-ICG-Konjugat- und unspezifischer Isotyp-Kontroll-Antikörper-ICG-Konjugatlokalisierung in murinen Brustdrüsen, die normales oder karzinomhaltiges Gewebe enthalten.Normale murinische Brustdrüsen von einem Tier, das intravenös mit Iso-ICG oder B7-H3-ICG injiziert und mit CD31 kontragefärbt ist, zeigen keine Färbung der Antikörperkonjugate. Es wurde gezeigt, dass normale Gewebe keine Expression von B7-H3 durch Standard-Ex-vivo-Immunfluoreszenzfärbung haben. Bei invasiven Brusttumoren bindet B7-H3-ICG stark an die Vaskulatur, den ersten Kontaktpunkt in vivo, und ist dann in der Lage, aus der Vaskulatur zu extravasieren, um das Tumorepithel heterogen zu färben.Iso-ICG zeigt unspezifische Akkumulation innerhalb des Tumorgewebes. Die Standard-Ex-vivo-Immunfluoreszenzfärbung zeigt eine gleichmäßige Expression des B7-H3-Markers auf epitheliale und endotheliale Zellen. Repräsentative konfokale Mikrographien zeigen die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisierungsmethode zum Nachweis der Netrin-1-Expression oder der Isotypkontrollexpression bei murinen Karzinom und normalen Brustdrüsen.In vivo Immunfluoreszenzlokalisierung bestätigt epitheliale Signal für Netrin-1 in MMTV-PyMT Tumoren, aber nicht in normalen Brustdrüsen. Darüber hinaus gibt es ein starkes Netrin-1-Signal auf Endothelzellen in Brusttumoren, wie durch das kolokalisierte gelbe Signal angezeigt. Das Signal ist in normalen Brustdrüsen deutlich schwächer.Die IVIL-Methode muss in Bezug auf DieAntikörperdosierung, Gewebesammlung Timing und sekundäre Antikörperverdünnung für eine erfolgreiche Umsetzung optimiert werden. IVIL ermöglicht die Ausrichtung auf konforme Epitope, die nicht mit Standard-Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen werden können, die eine Gewebeverarbeitung erfordert. Auch können gesunde Organe von tumortragenden Mäusen gesammelt werden, um die abwegige Abgabe von therapeutischen Antikörpern zu bewerten.Durch den verstärkten Einsatz von Antikörper-basierten Therapeutika und Kontrastmitteln in der Krebsforschung und -therapie ist die IVIL-Methode sehr gut auf die pharmazeutische Forschung und Entwicklung anwendbar. Forscher in Krebstherapien, molekulare Bildgebung, Entzündungen und anderen Bereichen können feststellen, dass die IVIL-Methode nützliche Informationen liefert.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Mit 22 3 Anti-PD-L1-Antikörper konzentrieren sich auf Biopsie und Zytologie Proben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...