Name: in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) per le discussioni e l'uso delle attrezzature. Ringraziamo il dottor Juergen K. Willmann per il suo mentore. Questo studio è stato sostenuto da NIH R21EB022214 grant (KEW), NIH R25CA118681 training grant (KEW) e NIH K99EB023279 (KEW). Lo Stanford Neuroscience Microscopy Service è stato supportato da NIH NS069375.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Administrative Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) della Stanford University.
1. Modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno
<ol><li>Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite la palpazione o la misurazione della pinza prima di procedere. NOTA: Qui è stato utilizzato il modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno (FVB...

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Questo metodo ha diversi passaggi critici e richiede potenziali modifiche per garantire una corretta implementazione. In primo luogo, il dosaggio e la tempistica dell'iniezione endovenosa anticorpo/anticorpo devono essere adattati all'applicazione specifica. Generalmente, dosaggi dovrebbero essere utilizzati che sono coerenti con come l'anticorpo coniugato sarà in genere utilizzato, cioè, dosaggi corrispondenti dell'anticorpo terapeutico o agente di contrasto basato su anticorpi. Inoltre, i tempi della raccolta dei tes...

Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono grandi legocoproteine (circa 150 kDa) della superfamiglia immunoglobulina che sono secreti dalle cellule B e hanno una funzione primaria nel sistema immunitario per identificare e inibire la funzione biologica di, o segnare per distruzione, patogeni batterici o virali, e può riconoscere l'espressione anomala delle proteine sulle cellule tumorali1. Gli anticorpi possono avere un'affinità estremamente elevata con i loro epitopi specifici fino alle concentrazioni di femtomolare, rendendoli strumenti molto promettenti in biomedicina2. Con lo sviluppo della tecnologia dell'ibrido da parte di Milstein e del Kohler (premiato con il Premio Nobel nel 1984), la produzione di mAbs divenne possibile3 . Più tardi, mAbs umani sono stati generati utilizzando la tecnologia di visualizzazione fago o ceppi di topi transgenici e ha rivoluzionato il loro uso come nuovi strumenti di ricerca e terapie4,5.
Il cancro è un problema di salute mondiale e una delle principali cause di morte, creando la necessità di nuovi approcci per la prevenzione, la scoperta e la terapia6. Ad oggi, gli mAb hanno permesso l'estricazione del ruolo dei geni e delle loro proteine nella tumorigenesi e quando sono diretti contro i biomarcatori del cancro, possono consentire la rilevazione e la caratterizzazione del tumore per la stratificazione del paziente. Per la terapia del cancro, vengono sviluppati i coniugati bispecifici, i coniugati anticorpo-farmaco e i frammenti di anticorpi più piccoli come terapie, e per la somministrazione mirata di farmaci per migliorare l'efficacia terapeutica7. Inoltre, gli anticorpi servono per il biomarcatore mirato di agenti di contrasto per le modalità di imaging molecolare come la chirurgia a fluorescenza, l'imaging fotoacustico (PA), l'imaging molecolare degli ultrasuoni (US) e l'emissione di positroni clinicamente utilizzati tomografia (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singoli fotoni (SPECT)8. Infine, gli anticorpi possono essere utilizzati anche come agenti tenetici che consentono la stratificazione dei pazienti e il monitoraggio della risposta per le terapie mirate9. Pertanto, nuovi mAbs stanno cominciando a svolgere un ruolo fondamentale nella diagnosi, diagnosi, e trattamento del cancro.
Nonostante i progressi critici nello sviluppo e nella produzione di mAb nuovi e altamente specifici, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere rese inefficaci a causa della complessità dell'ambiente tumorale. Le interazioni anticorpali dipendono dal tipo di epitopo, cioè,se è lineare o conformazionale10. Oltre al riconoscimento degli antigeni, gli anticorpi devono superare le barriere naturali come le pareti del vaso, le membrane basali e lo stroma tumorale per raggiungere le cellule bersaglio che esprimono l'antigene. Gli anticorpi interagiscono con il tessuto non solo attraverso il dominio di legame dell'antigene a frammento variabile (Fab), ma anche attraverso il costante frammento cristallino (Fc) che porta ulteriormente alle interazioni fuori sede11. Il targeting è complicato anche dall'espressione eterogenea dei marcatori tumorali in tutta la massa tumorale e l'eterogeneità nella vascolarizzazione tumorale e dal sistema linfatico12,13. Inoltre, il microambiente tumorale è composto da fibroblasti associati al cancro che supportano le cellule tumorali, le cellule immunitarie tumorali che sopprimono le reazioni immunitarie anti-tumorali e l'endotelio tumorale che supporta il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive, tutti che interferiscono con la penetrazione, la distribuzione e la disponibilità di terapie o diagnostica basate su anticorpi. Nel complesso, queste considerazioni possono limitare l'efficacia terapeutica o diagnostica, ridurre la risposta al trattamento, e può provocare resistenza al tumore.
Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi all'interno del microambiente tumorale. Attualmente, negli studi preclinici, l'espressione dei marcatori nei modelli di ricerca sul tumore viene analizzata ex vivo per colorazione immunofluorescenza (IF) delle sezioni tumorali14. La colorazione SE standard viene eseguita con anticorpi specifici del marcatore primario che vengono poi evidenziati da anticorpi secondari fluorescenti etichettati su fette di tessuto tumorale ex vivo che sono stati isolati dall'animale. Questa tecnica evidenzia la posizione statica del marcatore al momento della fissazione dei tessuti e non fornisce informazioni su come le terapie o la diagnostica basati su anticorpi potrebbero distribuire o interagire in condizioni fisiologiche. L'imaging molecolare di PET, SPECT, US e PA può fornire informazioni sulla distribuzione dell'agente di contrasto coniugato con anticorpi nei modelli preclinici viventi8,15. Poiché queste modalità di imaging non sono invasive, è possibile eseguire studi longitudinali e raccogliere dati sensibili al tempo con un numero minimo di animali per gruppo. Tuttavia, questi approcci di imaging molecolare non invasivo non sono abbastanza sensibili e non hanno una risoluzione sufficiente per la localizzazione della distribuzione degli anticorpi a livello cellulare. Inoltre, le caratteristiche fisiche e biologiche dell'anticorpo primario possono essere drasticamente modificate dalla coniugazione di un agente di contrasto16.
Al fine di prendere in considerazione le condizioni fisiologiche e patologiche in vivo di come le terapie e la diagnostica basate su anticorpi interagiscono all'interno dell'ambiente tumorale e per ottenere una distribuzione cellulare e persino subcellulare ad alta risoluzione profili di anticorpi non coniugati, proponiamo un approccio IF, ritenuto In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), in cui l'anticorpo specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo. La terapia o diagnostica basata su anticorpi, agendo come anticorpo primario, circola nei vasi sanguigni funzionali e si lega alla proteina bersaglio nell'ambiente tumorale vivo e altamente accurato. Dopo l'isolamento dei tumori in vivo con l'anticorpo primario, viene utilizzato un anticorpo secondario per localizzare i coniugati degli anticorpi accumulati e conservati. Questo approccio è simile a un approccio di istologia IF descritto in precedenza iniettando anticorpi fluorescenti17. Anche se qui, l'uso di anticorpi non coniugati evita un potenziale cambiamento nelle caratteristiche di biodistribuzione indotte dalla modifica dell'anticorpo. Inoltre, l'applicazione ex vivo dell'anticorpo secondario fluorescente evita una possibile perdita di segnale di fluorescenza durante la raccolta e l'elaborazione dei tessuti e fornisce amplificazione dell'intensità del segnale di fluorescenza. Il nostro approccio di etichettatura riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci basati su anticorpi e agenti mirati e può fornire importanti informazioni per lo sviluppo di nuovi agenti diagnostici e terapeutici.
In questo articolo, descriviamo due applicazioni del metodo IVIL applicate in studi precedenti che studiano la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per gli approcci di imaging molecolare per il rilevamento del cancro al seno. In primo luogo, la biodistribuzione di un controcorpo a raggi infrarossi vicino a un anticorpo (anticorpo anti-B7-H3 legato al colorante a fluorescenza infrarossa vicino, al verde indocianina, B7-H3-ICG) e all'agente di controllo isotipo (Iso-ICG) per la fluorescenza e la fotoacustica molecolare l'imaging è esplorato18. Il metodo di questa applicazione è descritto nel protocollo. Successivamente, i risultati della biodistribuzione di un anticorpo conformazionalmente sensibile al netrin-1, in genere non rilevabili con l'imaging TRADIZIONALE IF, utilizzato con imaging molecolare ad ultrasuoni, vengono quantificati e presentati nei risultati rappresentativi19. Al termine di questo documento di protocollo, i lettori dovrebbero sentirsi a proprio agio nell'adottare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Model</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td style="width:334px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td>
			<td style="width:196px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:166px;">002374</td>
			<td>Females, 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Handling Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">27G Catheter</td>
			<td style="width:196px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:166px;">Please call to order</td>
			<td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Alcohol Wipes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-246073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Gauze Sponges (4&#34; x 4&#34; 16 Ply)</td>
			<td style="width:196px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:166px;">2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Heat Lamp</td>
			<td style="width:196px;">Morganville Scientific</td>
			<td style="width:166px;">&#160;HL0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:196px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:166px;">29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:196px;">3M</td>
			<td style="width:166px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue Collection</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable Base Molds</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-363-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical London Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11080-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:166px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antibodies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-594 goat anti-human IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IgG Isotype Control</td>
			<td style="width:196px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:166px;">NBP1-97043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humanized anti-netrin-1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Netris Pharma</td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>contact@netrispharma.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td style="width:166px;">ab134161</td>
			<td>EPNCIR122 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:166px;">550274</td>
			<td>MEC 13.3 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Reagents</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Clear Nail Polish</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Any local drug store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Indocyanine Green - NHS</td>
			<td style="width:196px;">Intrace Medical</td>
			<td style="width:166px;">ICG-NHS ester</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">TA-006-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">ICN19135680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Adhesion Glass Slides</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Desalting Columns</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass Cover Slips</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">12-544G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:166px;">22311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Slide Staining Tray</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">87000-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Software</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FIJI</td>
			<td style="width:196px;">LOCI, UW-Madison.</td>
			<td style="width:166px;">Version 4.0</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono strumenti importanti per il rilevamento, la diagnosi e il trattamento del cancro. Essi sono utilizzati per svelare il ruolo delle proteine nella tumorigenesi, possono essere diretti a biomarcatori tumorali che consentono il rilevamento e la caratterizzazione del tumore, e possono essere utilizzati per la terapia del cancro come mAbs o coniugati anticorpale-farmaco per attivare le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule eftori immunitarie, per inibire le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule efiloriche immunitarie, per inibire le cellule echeologiche immunitarie, per inibire le cellule ebrasive immunitarie vie di segnalazione, o uccidere direttamente le cellule che trasportano l'antigene specifico. Nonostante i progressi clinici nello sviluppo e nella produzione di nuovi e altamente specifici mAb, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere compromesse dalla complessità e dall'eterogeneità del microambiente tumorale. Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi con il microambiente tumorale vivente. Qui, descriviamo in Vivo immunofluorescenza localizzazione (IVIL) come un nuovo approccio per studiare le interazioni di terapie e diagnostica basate su anticorpi nelle condizioni fisiologiche e patologiche in vivo. In questa tecnica, un anticorpo terapeutico o diagnostico specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo e localizzato ex vivo con un anticorpo secondario in tumori isolati. IVIL, quindi, riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci anticorpi e agenti di targeting. Due applicazioni IVIL sono descritte valutando la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per l'imaging molecolare del cancro al seno. Questo protocollo permetterà agli utenti futuri di adattare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.

Il metodo IVIL è stato utilizzato qui per esaminare la biodistribuzione in vivo e l'interazione dei tessuti di B7-H3-ICG e Iso-ICG, consentendo agli agenti, dopo l'iniezione endovenosa in un animale vivente, di interagire con il tessuto bersaglio per 96 h, e poi una volta che i tessuti sono primario anticorpi durante l'immunostaining ex vivo. Il metodo IVIL è stato anche confrontato con la colorazione IF standard dei tessuti per il marcatore B7-H3. Le normali ghiandole mammarie murine n...

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In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.

Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Questo protocollo per la localizzazione in vivo dell'immunofluorescenza, o IVIL, valuta la biodistribuzione in vivo di anticorpi diagnostici e terapeutici o agenti basati su anticorpi per la ricerca, il rilevamento e il trattamento del cancro. A differenza della colorazione immunofluorescente convenzionale in cui l'espressione cellulare degli antigeni si rivela ex vivo, il metodo IVIL chiarisce come gli anticorpi e gli agenti a base di anticorpi si distribuiscono nell'animale vivente. Questo video aivierà la comprensione del flusso di lavoro complessivo del metodo IVIL.Mostra dettagli importanti per una riproduzione riuscita del protocollo per altre applicazioni e anticorpi. Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite palpazione o misurazione della pinza prima di procedere. Purificare gli anticorpi di controllo dell'isotipo IgG del coniglio B7-H3 e del coniglio su una colonna di dissalezione per rimuovere conservanti e tamponi di conservazione seguendo le istruzioni del produttore.Dosaggi aliquoti di 33 microgrammi di ciascun anticorpo coniugati in singoli tubi di microcentrifugo. Dopo l'anestesia come descritto nel protocollo di testo, prepararsi per l'inoculazione della vena della coda delle soluzioni anticorpali. Disinfettare la coda dell'animale pulendo tre volte con una salvietta alcolica.Dilatare le vene della coda riscaldando con un riscaldatore per circa 30 secondi. Evitare di riscaldare l'intero animale. Utilizzando un catetere della vena di coda calibro 27, inserire l'ago farfalla in una delle due vene posteriori della coda.Visualizza il riflusso di sangue nel catetere per assicurarti che l'ago sia posizionato correttamente in modo che le soluzioni entrino completamente nell'animale rispetto a essere catturate nella coda. Utilizzare un pezzo di nastro chirurgico per fissare attentamente la coda con l'ago inserito sul palco. Lavare il catetere con 25 microlitri di soluzione salina sterile tamponata da fosfati.Quindi, iniettare la soluzione anticorpale nel catetere usando siringhe di insulina. Lavare nuovamente il catetere con 25 microlitri di PBS sterile. Rimuovere l'ago dalla coda e applicare pressione per fermare qualsiasi sanguinamento.Eseguire l'eutanasia umana del mouse come descritto nel protocollo di testo e posare il mouse in posizione supina. Usa forbici chirurgiche e forcelle per asportare i tessuti tumorali. Usa le fasci per afferrare solo lo strato esterno della pelle tra l'insieme delle ghiandole mammarie più vicine alla coda e fare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche.Introdurre le forbici chiuse nel taglio e aprire lentamente la punta per separare accuratamente la pelle dalla membrana della parete addominale sottostante, mantenendola intatta. Fai un'incisione verticale sull'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra la terza e la quarta ghiandola mammaria, fai un taglio orizzontale sull'addome per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie.Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con le forcep, tagliare con cura la pelle attaccata usando forbici chirurgiche. Posizionare i tessuti asportati negli stampi di base monouso dei tessuti che vengono preetichettati e riempiti con un mezzo di incorporamento ottimale della temperatura di taglio. Congelare rapidamente gli stampi posizionamento sul ghiaccio secco.Al fine di studiare la consegna fuori bersaglio, asportare altri tessuti o organi di interesse. Utilizzando un criostato, se sezione blocchi di tessuto congelato con spessore di 10 micron e posizionare sezioni adiacenti su vetri di adesione preetichettati. Risciacquare i vetrini di tessuto congelato con PBS a temperatura ambiente per cinque minuti per rimuovere il mezzo di incorporamento.Demarcare le sezioni tissutali con una penna barriera idrofobica per ridurre il volume di soluzioni necessarie durante la colorazione. Fissare le sezioni tissutali con soluzione di paraformaldeide al 4% per cinque minuti. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS per cinque minuti, permeabilizzare le sezioni di tessuto con 0,5%Triton X-100 in PBS per 15 minuti.Risciacquare nuovamente le diapositive in PBS per cinque minuti. Bloccare i tessuti con PBS contenente il 3% di peso per volume di albumina di siero bovino e il 5% di volume per volume di siero di capra per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS per cinque minuti, incubare le sezioni con anticorpi primari da record come un marcatore nucleare, vascolare o citoplasmatico comune.Qui, il CD31 anti-mouse del ratto viene utilizzato con una diluizione uno-a-100 nella soluzione di blocco. Le diapositive con anticorpo primario vengono lasciate durante la notte a quattro gradi Celsius, protette dalla disidratazione su un vassoio scorrevole. Dopo l'incubazione, sciacquare le diapositive in PBS per cinque minuti tre volte.Cambiare il PBS ogni volta. Incubare le diapositive con anticorpi secondari per etichettare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare l'anticorpo anti-B7-H3 utilizzando l'anticorpo anti-coniglio di capra coniugato Alexa Fluor 546 e visualizzare CD31 con l'anticorpo secondario anti-ratto di capra Alexa Fluor 488 in soluzione di blocco.Proteggere i vetrini dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio scorrevole per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le diapositive in PBS come prima, applicare una goccia del mezzo di montaggio al centro della fetta di tessuto. Posizionare con cura un coverslip, evitando l'intrappolamento delle bolle d'aria.Sigillare i bordi del coverslip con smalto chiaro e lasciare asciugare. Procedere con l'imaging confocale della microscopia e l'analisi quantitativa delle immagini come descritto nel protocollo di testo. Le micrografie confocali rappresentative mostrano il confronto di specifici anticorpi B7-H3-ICG coniugati e anticorpi di controllo dell'isotipo non specifici-localizzazione coniugata ICG in ghiandole mammarie murine contenenti tessuti normali o carcinomi.Le ghiandole mammarie murine normali di un animale iniettato per via endovenosa con Iso-ICG o B7-H3-ICG e contrososteniate con CD31 non mostrano alcuna colorazione dei coniugati anticorpali. È stato dimostrato che i tessuti normali non hanno espressione di B7-H3 mediante colorazione standard ad immunofluorescenza ex vivo. Nei tumori mammari invasivi, il B7-H3-ICG si lega fortemente alla vascucolatura, il primo punto di contatto in vivo, e quindi è in grado di estrapolare dalla vascucolatura alla macchia eterogenea dell'epitelio tumorale.Iso-ICG mostra un accumulo non specifico all'interno dei tessuti tumorali. La colorazione immunofluorescente ex vivo standard mostra un'espressione uniforme del marcatore B7-H3 sulle cellule epiteliali ed endoteliali. Le micrografie confocali rappresentative mostrano il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per rilevare l'espressione netrin-1 o l'espressione di controllo dell'isotipo nel carcinoma murino e nelle ghiandole mammarie normali.La localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo conferma il segnale epiteliale per netrin-1 nei tumori MMTV-PyMT ma non nelle normali ghiandole mammarie. Inoltre, c'è un forte segnale netrin-1 sulle cellule endoteliali nei tumori al seno, come indicato dal segnale giallo colocalizzato. Il segnale è significativamente più debole nelle ghiandole mammarie normali.Il metodo IVIL dovrà essere ottimizzato in termini di dosaggio degli anticorpi, tempi di raccolta dei tessuti e diluizione secondaria degli anticorpi per un'implementazione di successo. IVIL consente di mirare epitopi conformazionali che non possono essere rilevati utilizzando la colorazione immunofluorescenza standard, che richiede la lavorazione dei tessuti. Inoltre, gli organi sani dei topi portanti di tumore possono essere raccolti per valutare l'erogazione off-target di anticorpi terapeutici.Con l'aumento dell'uso di terapie a base di anticorpi e agenti di contrasto nella ricerca e nella gestione del cancro, il metodo IVIL è altamente applicabile alla ricerca e allo sviluppo farmaceutico. I ricercatori in terapie oncologiche, imaging molecolare, infiammazione e altre aree possono scoprire che il metodo IVIL fornisce informazioni utili.

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Utilizzando 22 3 dell'anticorpo Anti-PD-L1 concentrarsi sulla biopsia e campioni di citologia dai malati di cancro del polmone Non a piccole cellule

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Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...