Name: in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

ディスカッションと機器の使用に関して、アンドリュー・オルソン博士(スタンフォード神経科学顕微鏡サービス)に感謝します。ユルゲン・K・ウィルマン博士の指導に感謝します。本研究は、NIH R21EB022214助成金(KEW)、NIH R25CA118681研修助成(KEW)、およびNIH K99EB023279(KEW)によって支援されました。スタンフォード神経科学顕微鏡検査サービスはNIH NS069375によってサポートされました。

ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の実験室動物ケア(APLAC)に関する機関行政委員会によって承認されています。
乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル
<ol><li>先に進む前に触診またはキャリパー測定を介して適切な腫瘍増殖のための所望の癌モデルからマウスを観察する。 注:ここでは、乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル(FVB/N...

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	<li>Forthal, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+Antibodies.">Functions of Antibodies.</a> Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).</li><li>Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+antibody+fragments+with+monovalent+femtomolar+antigen-binding+affinity.">Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Lonberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+human+antibodies+from+mice+comprising+four+distinct+genetic+modifications.">Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.</a> Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).</li><li>McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+antibodies:+filamentous+phage+displaying+antibody+variable+domains.">Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains.</a> Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).</li><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).</li><li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics.">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li><li>Kircher, M. F., Willmann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Body+Imaging:+MR+Imaging,+CT,+and+US.+Part+I.+Principles.">Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles.</a> Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).</li><li>Fleuren, E. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostic+applications+of+antibodies+in+oncology.">Theranostic applications of antibodies in oncology.</a> Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., Bis&#322;awska Axn&#228;s, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Antibodies+with+Regards+to+Linear+and+Conformational+Epitopes.">Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes.</a> PLoS ONE. 10 (3), (2015).</li><li>Woof, J. M., Burton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-Fc+receptor+interactions+illuminated+by+crystal+structures.">Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).</li><li>Brooks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+genomics:+The+challenge+of+developing+cancer+biomarkers.">Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers.</a> Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).</li><li>Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+Mechanisms+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies+in+Health+and+Disease.">Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease.</a> The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).</li><li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+immunohistochemistry.">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).</li><li>Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+cancer+with+positron+emission+tomography.">Molecular imaging of cancer with positron emission tomography.</a> Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).</li><li>Freise, A. C., Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+with+Antibodies+and+Engineered+Fragments.">In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments.</a> Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).</li><li>Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Tumor+Penetration+and+Single-Cell+Targeting+of+Antibody-Drug+Conjugates+Increases+Anticancer+Efficacy+and+Host+Survival.">Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival.</a> Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).</li><li>Wilson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+Photoacoustic+Molecular+Imaging+of+Breast+Cancer+using+a+B7-H3-targeted+ICG+Contrast+Agent.">Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent.</a> Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).</li><li>Wischhusen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+molecular+imaging+as+a+non-invasive+companion+diagnostic+for+netrin-1+interference+therapy+in+breast+cancer.">Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer.</a> Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+A+chromatography+for+antibody+purification.">Protein A chromatography for antibody purification.</a> Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bachawal, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Earlier+detection+of+breast+cancer+with+ultrasound+molecular+imaging+in+a+transgenic+mouse+model.">Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model.</a> Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).</li><li>Fitamant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+expression+confers+a+selective+advantage+for+tumor+cell+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li><li>Ryman, J. T., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Monoclonal+Antibodies.">Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies.</a> CPT: Pharmacometrics &amp; Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).</li><li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Masking+During+Fixation+and+Embedding,+Dissected.">Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+reprograms+lymphatic+vessels+to+blood+vessels.">Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Fluorescence+Immunohistochemistry:+Localization+of+Fluorescently+Labeled+Cetuximab+in+Squamous+Cell+Carcinomas.">In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors.">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li><li>Rexer, B. N., Arteaga, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+acquired+resistance+to+HER2-targeted+therapies+in+HER2+gene-amplified+breast+cancer:+mechanisms+and+clinical+implications.">Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications.</a> Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).</li></ol>

この方法には、いくつかの重要な手順があり、実装を成功させるために潜在的な変更が必要です。まず、抗体/抗体コンジュゲート静脈内注射の投与量およびタイミングは、特定の用途に合わせて調整されなければならない。一般に、抗体コンジュゲートが一般的に使用される方法、すなわち、治療用抗体または抗体ベースの造影剤の一致する用量と一致する用量を使用すべきである。また、...

モノクローナル抗体(mAb)は、B細胞によって分泌され、免疫系の主要な機能を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの大きな糖タンパク質(約150 kDa)であり、生物学的機能を同定し阻害するか、または破壊、細菌またはウイルス病原体、および癌細胞1上の異常なタンパク質発現を認識することができる。抗体は、その特異的なエピトープからフェムトモラー濃度まで非常に高い親和性を有し、生物医学2において非常に有望なツールを作ることができる。ミルシュタインとケーラー(1984年にノーベル賞を受賞)によるハイブリドーマ技術の開発により、mAbsの生産が可能になりました3.その後、ヒトmAbsはファージディスプレイ技術またはトランスジェニックマウス株を用いて生成され、新規研究ツールおよび治療薬としての使用に革命を起こし、4,5.
がんは世界的な健康問題であり、予防、検出、治療のための新しいアプローチの必要性を生み出す主な死因6である。現在までに、mAbsは腫瘍形成における遺伝子およびそのタンパク質の役割の駆除を可能にし、癌バイオマーカーに対して指示された場合、患者の層形成のための腫瘍検出および特徴付けを可能にすることができる。がん治療では、二重特異性mAbs、抗体薬物コンジュゲート、およびより小さな抗体断片が治療薬として開発され、および治療有効性を高める標的薬物送達のために7.さらに、抗体は、蛍光誘導手術、光音響(PA)イメージング、超音波(米国)分子イメージング、臨床的に使用される陽電子放出などの分子イメージングモダリティに対する造影剤のバイオマーカーターゲティングに役立ちます。断層撮影(PET)または単一光子発光体コンピュータ断層撮影(SPECT)8.最後に、抗体は、標的治療9に対する患者の階層化および応答モニタリングを可能にするセラノスティック剤としても使用することができる。したがって、新しいmAbsは、がんの検出、診断、および治療において重要な役割を果たし始めています。
新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の重要な進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍環境の複雑さのために無効にすることができる。抗体相互作用は、エピトープの種類、すなわち、線形か立体構造10のいずれに依存する。抗原の認識に加えて、抗体は、抗原を発現する標的細胞に到達するために、血管壁、基底膜、腫瘍間質などの自然な障壁を克服する必要があります。抗体は、可変フラグメントメント抗原結合(Fab)ドメインを介してだけでなく、さらにオフサイト相互作用につながる一定結晶性断片(Fc)を介して組織と相互作用する11。標的化はまた、腫瘍血管化およびリンパ系12、13における腫瘍バルクおよび不均一性全体の腫瘍マーカーの不均一発現によっても複雑である。さらに、腫瘍微小環境は、腫瘍細胞を支えるがん関連線維芽細胞、抗腫瘍免疫反応を抑制する腫瘍免疫細胞、酸素や栄養素の輸送をサポートする腫瘍内皮で構成されています。抗体ベースの治療薬または診断の浸透、分布、および入手可能性を妨げる。全体的に、これらの考慮事項は、治療または診断の有効性を制限し、治療応答を減少させることができ、腫瘍抵抗性をもたらす可能性があります。
したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、腫瘍微小環境内における抗体ベースのコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。現在、前臨床試験において、腫瘍研究モデルにおけるマーカー発現は、腫瘍セクション14の免疫蛍光(IF)染色によりexvivoを分析する。標準的なIF染色は、一次マーカー特異的抗体で行われ、その後、動物から単離された生体内腫瘍組織スライス上の二次蛍光標識抗体によって強調表示される。この技術は、組織固定時のマーカーの静的位置を強調し、抗体ベースの治療薬または診断が生理学的条件でどのように分配または相互作用するかについての洞察を提供しない。PET、SPECT、米国、およびPAによる分子イメージングは、生きている前臨床モデル8、15における抗体共役造影剤分布に関する情報を提供することができる。これらのイメージングモダリティは非侵襲的なので、縦方向の研究を行うことができ、時間に敏感なデータをグループあたり最小限の数の動物で収集することができます。しかし、これらの非侵襲的な分子イメージングアプローチは十分に敏感ではなく、細胞レベルでの抗体分布の局在化のための十分な分解能を有していない。さらに、一次抗体の物理的および生物学的特性は、造影剤16の結合によって劇的に変化してもよい。
抗体ベースの治療と診断が腫瘍環境内でどのように相互作用するかを考慮し、高分解能細胞および細胞下分布を得るために、生体内の生理的および病理学的状態を考慮するために非共役抗体のプロファイルは、抗原特異的抗体が生体内に静脈内に注入される生体内免疫蛍光局在化(IVIL)とみなされるIFアプローチを提案する。抗体ベースの治療または診断は、一次抗体として作用し、機能性血管内を循環し、高精度で生きている腫瘍環境で標的タンパク質に結合する。一次抗体を用いて生体内の腫瘍を単離した後、二次抗体を用いて蓄積および保持された抗体コンジュゲートを局所化する。このアプローチは、蛍光標識抗体17を注入する前述のIF機関学アプローチに類似している。しかし、ここで、非共役抗体の使用は、抗体修飾によって誘導される生体分布特性の潜在的な変化を回避する。さらに、蛍光二次抗体のex vivoアプリケーションは、組織の収集および処理中に蛍光シグナルの損失の可能性を回避し、蛍光シグナル強度の増幅を提供する。当社のラベリングアプローチは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生分解に反映され、新規診断および治療薬の開発に重要な洞察を提供することができます。
ここでは、乳癌検出のための分子イメージングアプローチに対する抗体ベースの造影剤の生体分布とアクセシビリティを研究する前の研究で適用されたIVIL法の2つの応用例について述べた。まず、抗体近赤外色素コンジュゲート(近赤外蛍光色素に結合した抗B7-H3抗体、indocyanine green、B7-H3-ICG)および蛍光および光音響分子に対するアイソタイプ制御剤(Iso-ICG)の生体分布イメージングは18を探索される。このアプリケーションのメソッドは、プロトコルで説明されています。次に、netrin-1に対する立体構造に敏感な抗体の生体分布結果は、典型的には従来のIFイメージングでは検出できない、超音波分子イメージングと共に使用され、代表的な結果19に定量され、提示される。このプロトコルペーパーの結論では、読者は、独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を採用して快適に感じるべきです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:990px;" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Model</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td style="width:334px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td>
			<td style="width:196px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:166px;">002374</td>
			<td>Females, 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Handling Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">27G Catheter</td>
			<td style="width:196px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:166px;">Please call to order</td>
			<td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Alcohol Wipes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-246073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Gauze Sponges (4&#34; x 4&#34; 16 Ply)</td>
			<td style="width:196px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:166px;">2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Heat Lamp</td>
			<td style="width:196px;">Morganville Scientific</td>
			<td style="width:166px;">&#160;HL0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:196px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:166px;">29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:196px;">3M</td>
			<td style="width:166px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue Collection</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable Base Molds</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-363-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical London Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11080-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:166px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antibodies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-594 goat anti-human IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IgG Isotype Control</td>
			<td style="width:196px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:166px;">NBP1-97043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humanized anti-netrin-1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Netris Pharma</td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>contact@netrispharma.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td style="width:166px;">ab134161</td>
			<td>EPNCIR122 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:166px;">550274</td>
			<td>MEC 13.3 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Reagents</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Clear Nail Polish</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Any local drug store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Indocyanine Green - NHS</td>
			<td style="width:196px;">Intrace Medical</td>
			<td style="width:166px;">ICG-NHS ester</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">TA-006-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">ICN19135680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Adhesion Glass Slides</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Desalting Columns</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass Cover Slips</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">12-544G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:166px;">22311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Slide Staining Tray</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">87000-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Software</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FIJI</td>
			<td style="width:196px;">LOCI, UW-Madison.</td>
			<td style="width:166px;">Version 4.0</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research

モノクローナル抗体(mAbs)は、がんの検出、診断、治療において重要なツールです。それらは、腫瘍形成におけるタンパク質の役割を解明するために使用され、腫瘍の検出および特徴付けを可能にする癌バイオマーカーに向けられ、免疫エフェクター細胞を活性化するためにmAbsまたは抗体薬物コンジュゲートとして癌治療に使用することができ、阻害するシグナル伝達経路、または特定の抗原を運ぶ細胞を直接殺す。新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の臨床的進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍微小環境の複雑さおよび不均一性によって損なわれる。したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、生体腫瘍微小環境との抗体ベースコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。ここでは、生体内生理的および病理学的条件における抗体ベースの治療薬および診断の相互作用を研究するための新しいアプローチとして、生体内免疫蛍光局所化(IVIL)について説明する。この技術では、治療または診断抗原特異的抗体を生体内に静脈内注射し、単離腫瘍中の二次抗体を用いて局所的なex vivoを投与する。したがって、IVILは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生体分布を反映する。2つのIVILアプリケーションは、乳癌の分子イメージングのための抗体ベースの造影剤の生体分布およびアクセシビリティを評価する記載されている。このプロトコルは、将来のユーザーが独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を適応することを可能にします。

IVIL法は、B7-H3-ICGおよびIso-ICGの生体内生体分布および組織相互作用を調べるためにここで使用され、薬剤が生体動物に静脈内注射した後、96時間の標的組織と相互作用し、その後組織が一旦収穫され、排生免疫染色中に一次抗体として作用する。IVIL法はまた、B7-H3マーカーに対する組織の標準的なex vivo IF染色と比較した。正常なマウス乳腺はB7-H3マーカーを発現せず、...

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In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

インビボ免疫蛍光局在化(IVIL)法は、生体内腫瘍標的化とexvivo免疫染色の組み合わせを用いて、生体内の腫瘍学的目的のための抗体および抗体コンジュゲートの生体内生分解を調べるために使用することができる。メソッド。

がん研究における治療・診断抗体生体分布の評価のための生体内免疫蛍光局所法

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

インビボ免疫蛍光局在局(IVIL)のためのこのプロトコルは、がん研究、検出、および治療のための診断および治療用抗体または抗体ベースの薬剤の生体分布を評価する。IVIL法は、抗原の細胞発現がex vivoで明らかにされる従来の免疫蛍光染色とは対照的に、抗体および抗体ベースの薬剤が生きている動物でどのように分布するかを解明する。このビデオは、IVILメソッドの全体的なワークフローの理解を助ける。他のアプリケーションおよび抗体に対するプロトコルの再生を成功させるための重要な詳細を示す。先に進む前に触診またはキャリパー測定を介して適切な腫瘍増殖のための所望の癌モデルからのマウスを観察する。脱塩カラム上のウサギの抗マウスB7-H3およびウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を精製し、メーカーの指示に従って防腐剤と保存バッファーを除去します。個々のマイクロ遠心分離管における各抗体コンジュゲートの33マイクログラムのアリコート投与量。テキストプロトコルに記載されている麻酔に続いて、抗体溶液の尾静脈接種に備える。アルコール拭きで3回拭いて動物の尾を消毒する。ヒートパッドで約30秒間温めることで尾静脈を拡張します。動物全体を加熱しないでください。27ゲージの尾静脈カテーテルを使用して、2つの側面尾静脈の1つに蝶の針を挿入します。カテーテルに血流を視覚化して、針が適切に配置され、溶液が動物に完全に入り込み、尾に捕捉されるようにします。手術用テープを使用して、挿入された針で尾を慎重にステージに固定します。25マイクロリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水でカテーテルを洗い流します。次いで、インスリン注射器を用いてカテーテルに抗体溶液を注入する。滅菌PBSの25マイクロリットルでカテーテルをもう一度洗い流します。針を尾から取り出し、圧力をかけて出血を止めます。テキストプロトコルに記載されているようにマウスの人道的安楽死を行い、仰向けの位置にマウスを置く。手術用ハサミと鉗子を使って腫瘍組織を切除する。鉗子を使用して、尾部に最も近い乳腺の組み合わせの間の皮膚の外層だけを把握し、外科用ハサミで小さな切開を行います。閉じたはさみをカットに導入し、ゆっくりと先端を開いて下の腹壁膜から皮膚を慎重に分離し、そのままに保ちます。腹部を垂直に切開し、皮膚を内膜から分離し続けます。3番目と4番目の乳腺の間で、皮膚の引き込みと乳腺の視覚化を可能にするために腹部を横切って水平に切り取る。各腫瘍または正常腺を鉗子でつかみ、外科用ハサミを使用して取り付けた皮膚を慎重に切り取る。切除された組織を、あらかじめラベル付けされ、最適な切断温度埋め込み媒体で満たされたティッシュの使い捨てベース型に入れます。ドライアイスに配置することで、金型を素早く凍結します。オフターゲットの送達を研究するために、他の組織または関心のある器官を物品化する。クライオスタットを使用して、10ミクロンの厚さの凍結組織ブロックを切り離し、隣接するセクションをあらかじめラベル付けされた接着ガラススライドの上に置きます。凍結した組織スライドを室温PBSで5分間リンスし、埋め込み培地を除去する。組織切片を疎水性バリアペンで区切り、染色時に必要な溶液の量を減らします。4%パラホルムアルデヒド溶液で組織切片を5分間固定します。スライドをPBSで5分間リンスした後、PBSで0.5%トリトンX-100で組織切片を15分間透過させる。PBS でスライドを再び 5 分間リンスします。1ボリュームのウシ血清アルブミンあたり3%の重量と室温で1時間の体積ヤギ血清あたり5%の体積を含むPBSで組織をブロックします。PBSでスライドを5分間リンスした後、一般的な核、血管、または細胞質マーカーなどの記録保持一次抗体で切片をインキュベートします。ここで、ラット抗マウスCD31は、ブロッキング溶液中の1対100希釈で使用される。一次抗体を有するスライドは、スライドトレイの脱水から保護された摂氏4度で一晩放置される。インキュベーションに続いて、PBSでスライドを5分間3回すすいだ。毎回 PBS を変更します。一次抗体を標識する二次抗体でスライドをインキュベートします。このアプリケーションでは、アレクサフルオール546コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を使用して抗B7-H3抗体を可視化し、ブロッキング溶液中のアレクサフルーオール488ヤギ抗ラット二次抗体を用いてCD31を可視化します。スライドトレイの軽い脱水症状から、室温で1時間保護します。前のようにPBSでスライドをすすぐ後、組織スライスの中央に取り付け媒体の1滴を塗布する。気泡の封じ込めを避け、慎重にカバースリップを置きます。カバースリップの端を透明なマニキュアで密封し、乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているように、共焦点顕微鏡イメージングと定量画像解析を進めます。代表的な共焦点顕微鏡写真は、正常または癌腫組織を含むマウス乳腺における特異的B7-H3抗体ICGコンジュゲートおよび非特異的アイソタイプ対照抗体ICGコンジュゲートの局在化の比較を示す。イソ-ICGまたはB7-H3-ICGを静脈内注射した動物からの正常なマウス乳腺およびCD31で染色されたカウンターは、抗体コンジュゲートの染色を示さない。正常組織は、標準的なex生体免疫蛍光染色法によるB7-H3の発現を有さないことを示した。浸潤性乳腺腫瘍では、B7-H3-ICGは、生体内の最初の接触点である血管系に強く結合し、その後、血管系から腫瘍上皮を不均一に染色するために外乳化することができる。イソICGは、腫瘍組織内の非特異的蓄積を示す。標準的なex vivo免疫蛍光染色は、上皮細胞および内皮細胞上のB7-H3マーカーの均一な発現を示す。代表共焦点顕微鏡写真は、マウス癌および正常乳腺におけるネトリン-1発現またはアイソタイプ制御発現を検出するin vivo免疫蛍光局在化法を示す。生体内免疫蛍光局在化は、MMTV-PyMT腫瘍ではネトリン-1の上皮シグナルを確認するが、正常な乳腺では確認しない。さらに、共局化した黄色のシグナルによって示されるように、乳房腫瘍の内皮細胞に強いネトリン-1シグナルがある。正常乳腺では信号が著しく弱い。IVIL法は、抗体投薬量、組織採取タイミング、二次抗体希釈の観点から最適化して実装を成功させる必要があります。IVILは組織処理を必要とする標準的な免疫蛍光染色を使用して検出できない立体構造エピトープを標的化することを可能にする。また、腫瘍を持つマウスの健康な器官を収集して、治療用抗体のオフターゲット送達を評価することができる。がんの研究・管理における抗体系治療薬や造影剤の使用が増加する中、IVIL法は医薬品の研究開発に非常に応用可能です。がん治療、分子イメージング、炎症、その他の分野の研究者は、IVIL法が有用な情報を提供することを発見するかもしれません。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

アンチ PD L1 抗体は生検で非小細胞肺癌患者からの細胞のサンプル集中 22 3 を使用して

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...