Name: in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research at JoVE.com

우리는 토론 및 장비 사용을 위한 박사 앤드류 올슨 (스탠포드 신경 과학 현미경 검사법 서비스)에게 감사합니다. 유르겐 케이 윌만 박사님의 멘토링에 감사드립니다. 본 연구는 NIH R21EB022214 교부금(KEW), NIH R25CA118681 교육 보조금(KEW), NIH K99EB023279(KEW)에 의해 지원되었다. 스탠포드 신경 과학 현미경 검사법은 NIH NS069375에 의해 지원되었습니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 스탠포드 대학의 실험실 동물 관리에 기관 관리 패널에 의해 승인되었습니다 (APLAC).
1. 유방암 발달의 형질전환 마우스 모형
<ol><li>진행하기 전에 촉진 또는 캘리퍼스 측정을 통해 적절한 종양 성장을 위해 원하는 암 모델로부터 마우스를 관찰하십시오. 참고: 여기에서, 유방암 발달의 형질전환 뮤린 모델 (FVB/N-Tg (MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT)가 사용...

<ol>
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이 메서드에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며 성공적인 구현을 위해 잠재적인 수정이 필요합니다. 첫째, 항체/항체 컨쥬게이트 정맥 주사의 투여량 및 타이밍은 특정 용도에 맞게 조정되어야 한다. 일반적으로, 투여량은 항체 컨쥬게이트가 전형적으로 사용되는 방법, 즉 치료용 항체 또는 항체 기반 조영제의 매칭 투여량과 일치하는 방식과 일치하는 것을 사용되어야 한다. 또한 표적 조직의 수집...

단클론 항체(mAb)는 B 세포에 의해 분비되는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 큰 당단백질(약 150 kDa)이며, 면역계에서 1차 적인 기능을 가지고 있는 것은 생물학적 기능을 식별하고 억제하거나, 또는 파괴, 세균 또는 바이러스 성 병원체, 암 세포에 비정상적인 단백질 발현을 인식할 수 있습니다1. 항체는 생물 의학2에서매우 유망한 도구를 만드는 펨토몰 농도까지 그들의 특정 에피토프에 매우 높은 친화력을 가질 수 있습니다. 밀스타인과 쾰러 (1984 년 노벨상 수상)에 의해 하이브리드 도마 기술의 개발과 함께, mAbs의 생산이 가능하게되었다3. 이후, 인간 mAb는 파지 디스플레이 기술 또는 형질전환 마우스 균주를 이용하여 생성되었고, 그들의 새로운 연구 도구 및 치료제로서의 사용에혁명을일으켰다4,5.
암은 전 세계적으로 건강 문제이며 예방, 탐지 및 치료에 대한 새로운 접근법의 필요성을 만드는 주요 사망 원인6. 현재까지, mAbs는 종양 발생에 있는 유전자 그리고 그들의 단백질의 역할의 구출을 허용하고 암 biomarkers에 대하여 지시될 때, 환자 계층화를 위한 종양 탐지 그리고 특성화를 가능하게 할 수 있습니다. 암 치료의 경우, 이중특이적 mAbs, 항체-약물 접합체 및 더 작은 항체 단편이 치료제로서 개발되고 있으며, 표적 약물 전달을 위한 치료 효능을 향상시키기 위해7. 추가적으로, 항체는 형광 유도 수술, 광음향 (PA) 화상 진찰, 초음파 (미국) 분자 화상 진찰 및 임상으로 이용된 양전자 방출과 같은 분자 화상 진찰 양식에 대한 조영제의 biomarker 표적화를 위해 봉사합니다 단층 촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)8. 마지막으로, 항체는 또한 표적 치료에 대한 환자의 계층화 및 반응 모니터링을 가능하게 하는 라노스틱 제제로서 사용될 수있다 9. 따라서, 새로운 mAb는 암 탐지, 진단 및 처리에 있는 중요한 역할을 하기 시작됩니다.
신규하고 고도로 구체적인 mAb의 개발 및 생산에 있어 중요한 발전에도 불구하고 종양 환경의 복잡성으로 인해 진단 및 치료 응용 분야는 비효율적일 수 있습니다. 항체 상호작용은 에피토프의 종류에 의존한다,즉,선형 또는형태(10)인지. 항원의 인식 이외에, 항체는 항원을 발현하는 표적 세포에 도달하기 위하여 혈관 벽, 기저 막 및 종양 기질과 같은 자연적인 방벽을 극복할 필요가 있습니다. 항체는 가변 단편 항원 결합(Fab) 도메인을 통해서뿐만 아니라 상수 결정성 단편(Fc)을 통해조직과 상호작용하여 오프사이트상호작용(11)을더욱 유도한다. 표적화는 또한 종양 혈관화 및림프계(12,13)에서종양 벌크 및 이질성을 통하여 종양 마커의 이질적인 발현에 의해 복잡해진다. 또한, 종양 미세 환경은 종양 세포를 지원하는 암 관련 섬유 아세포, 항 종양 면역 반응을 억제하는 종양 면역 세포, 산소 및 영양소의 수송을 지원하는 종양 내피로 구성됩니다. 항체 기반 치료제 또는 진단의 침투, 분배 및 가용성을 방해합니다. 전반적으로, 이러한 고려 사항은 치료 또는 진단 효능을 제한하고, 치료 반응을 감소시키고, 종양 저항성을 초래할 수 있다.
따라서, 효율적인 항체 기반 치료법 및 진단의 개발을 위해, 종양 미세환경 내의 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 현재, 전임상 연구에서, 종양 연구 모델에서마커 발현은 종양섹션(14)의면역형광(IF) 염색에 의해 생체내 생체내를 분석한다. 표준 IF 염색은 동물에게서 분리된 ex vivo 종양 조직 조각에 이차 형광표지된 항체에 의해 그 때 강조되는 1 차적인 마커 특정 항체로 실행됩니다. 이 기술은 조직 고정시의 마커의 정적 위치를 강조하고 항체 기반 치료제 또는 진단이 생리적 조건에서 어떻게 분배하거나 상호 작용할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. PET, SPECT, 미국 및 PA에 의한 분자 이미징은 살아있는 전임상 모델8,15에서항체 접합조제 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 이미징 양식은 비침습적이기 때문에, 종방향 연구를 수행할 수 있으며, 시간에 민감한 데이터는 그룹당 최소한의 동물로 수집될 수 있다. 그러나, 이러한 비침습적 분자 이미징 접근법은 충분히 민감하지 않으며 세포 수준에서 항체 분포의 국소화를 위한 충분한 분해능이 없다. 부가적으로, 1차 항체의 물리적 및 생물학적 특성은조영제(16)의컨쥬게이션에 의해 크게 변화될 수 있다.
항체 기반 치료제 및 진단이 종양 환경 내에서 상호 작용하는 방법을 고려하여 생체 내 생리학적 및 병리학적 조건을 취하고 고해상도 세포 및 심지어 하위 세포 분포를 얻기 위해 비 공액 항체의 프로파일, 우리는 항원 특이적 항체가 생체 내에서 정맥 주사되는 생체 내 면역 형광 국소화 (IVIL)로 간주되는 IF 접근법을 제안합니다. 항체 기지를 둔 치료 또는 진단은, 1 차적인 항체로 작용하고, 기능성 혈관에서 순환하고 고도로 정확한 살아있는 종양 환경에서 그것의 표적 단백질에 묶습니다. 생체 내 표지된 종양을 1차 항체와 분리한 후, 이차 항체는 축적되고 유지된 항체 접합체를 국소화하는 데 사용된다. 이 접근법은 형광 표지된 항체17을주입하는 이전에 기술된 IF 진학 접근법과 유사하다. 여기서, 비공액 항체의 사용은 항체 변형에 의해 유도된 생체 분포 특성의 잠재적 변화를 피한다. 더욱이, 형광 이차 항체의 생체 내 적용은 조직 수집 및 처리 동안 형광 신호의 가능한 손실을 방지하고 형광 신호 강도의 증폭을 제공한다. 당사의 라벨링 접근법은 항체 기반 약물 및 표적 제제의 생체 분포를 반영하며 새로운 진단 및 치료제 개발을 위한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
여기에서, 우리는 유방암 검출을 위한 분자 화상 진찰 접근을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 조사하는 이전 연구 결과에서 적용된 것과 같이 IVIL 방법의 2개의 응용을 기술합니다. 첫째, 형광 및 광음향 분자를 위한 항체 근적외선 염료 접합체(근적외선 형광 염료, 인도시아닌 그린, B7-H3-ICG)와 이소타입 제어제(Iso-ICG)의 생체 분포 이미징은18. 이 응용 프로그램의 메서드는 프로토콜에 설명되어 있습니다. 다음으로, 네크린-1에 대한 형태적으로 민감한 항체의 생체 분포 결과는, 통상적으로 기존의 IF 이미징으로 검출할 수 없으며, 초음파 분자 이미징과 함께 사용되며, 대표적인 결과19에제시된다. 이 프로토콜 논문의 끝에서, 독자는 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 채택 편안하게 느껴야한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:990px;" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Model</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td style="width:334px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td>
			<td style="width:196px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:166px;">002374</td>
			<td>Females, 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animal Handling Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">27G Catheter</td>
			<td style="width:196px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:166px;">Please call to order</td>
			<td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Alcohol Wipes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-246073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Gauze Sponges (4&#34; x 4&#34; 16 Ply)</td>
			<td style="width:196px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:166px;">2913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Heat Lamp</td>
			<td style="width:196px;">Morganville Scientific</td>
			<td style="width:166px;">&#160;HL0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:196px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:166px;">29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:196px;">3M</td>
			<td style="width:166px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tissue Collection</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable Base Molds</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">22-363-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical London Forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11080-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:295px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:166px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Antibodies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor-594 goat anti-human IgG</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:166px;">A11014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IgG Isotype Control</td>
			<td style="width:196px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:166px;">NBP1-97043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humanized anti-netrin-1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Netris Pharma</td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>contact@netrispharma.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td style="width:166px;">ab134161</td>
			<td>EPNCIR122 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Rat anti-Mouse CD31</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:166px;">550274</td>
			<td>MEC 13.3 Clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Reagents</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Clear Nail Polish</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td>Any local drug store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Indocyanine Green - NHS</td>
			<td style="width:196px;">Intrace Medical</td>
			<td style="width:166px;">ICG-NHS ester</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Mounting Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">TA-006-FM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">ICN19135680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:166px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Supplies</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Adhesion Glass Slides</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Desalting Columns</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">45-000-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass Cover Slips</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">12-544G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:166px;">22311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:166px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Slide Staining Tray</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:166px;">87000-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Software</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:166px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">FIJI</td>
			<td style="width:196px;">LOCI, UW-Madison.</td>
			<td style="width:166px;">Version 4.0</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo immunofluorescence localization for assessment of therapeutic and diagnostic antibody biodistribution in cancer research

단일 클론 항체 (mAbs)는 암 검출, 진단 및 치료에 중요한 도구입니다. 그(것)들은 종양 발생에 있는 단백질의 역할을 해명하기 위하여 이용되고, 종양 탐지 및 특성화를 가능하게 하는 암 biomarkers에 지시될 수 있고, 면역 이펙터 세포를 활성화하기 위하여 mAbs 또는 항체 약 접합체로 암 치료에 사용될 수 있고, 억제하기 위하여 신호 경로, 또는 직접 특정 항원을 운반 하는 세포를 죽일. 신규하고 고도로 특이적인 mAbs의 개발 및 생산에 대한 임상적 진보에도 불구하고, 진단 및 치료 응용은 종양 미세 환경의 복잡성과 이질성에 의해 손상될 수 있다. 따라서, 효율적인 항체 기반 치료 및 진단의 개발을 위해, 살아있는 종양 미세 환경과 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 생체 내 면역형 광형 국소화 (IVIL)를 생체 내 생리및 병리학 적 조건에서 항체 기반 치료제 및 진단의 상호 작용을 연구하는 새로운 접근법으로 설명합니다. 이 기술에서, 치료 적 또는 진단 항원 특이적 항체는 정맥 내 생체 내에서 주입되고 분리된 종양에서 이차 항체를 가진 생체외 로 국소화된다. 따라서 IVIL은 항체 기반 약물 및 표적화제의 생체내 생체 분포를 반영한다. 2개의 IVIL 응용은 유방암의 분자 화상 진찰을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 평가하는 기술됩니다. 이 프로토콜은 미래 사용자가 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 적응 할 수 있습니다.

IVIL 방법은 B7-H3-ICG 및 Iso-ICG의 생체 내 생체 분포 및 조직 상호 작용을 검사하기 위해 여기에서 사용되었으며, 살아있는 동물에 정맥 주사 후, 96 시간 동안 표적 조직과 상호 작용한 다음 조직이 일단 조직에 상호 작용하도록 함으로써 에이전트를 허용하였다. 수확, 생체 내 면역 염색 동안 1 차 항체로서 작용한다. 상기 IVIL 방법은 또한 B7-H3 마커에 대한 조직의 표준 생체 ?...

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In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

생체 내 면역형광 국소화(IVIL) 방법은 생체내 종양 표적화 및 ex vivo 면역염색의 조합을 사용하여 살아있는 유기체에서 종양학적 목적을 위해 항체 및 항체 접합체의 생체 분포를 검사하는데 사용될 수 있다. 방법.

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

생체 내 면역형광국화 또는 IVIL을 위한 이 프로토콜은 암 연구, 검출 및 치료를 위한 진단 및 치료 항체 또는 항체 기반 제제의 생체 내 생체 분포를 평가한다. 항원의 세포 발현이 밝혀진 종래의 면역형성 염색과는 대조적으로, IVIL 방법은 살아있는 동물에서 항체 및 항체 기반 제제가 어떻게 분배되는지 해명한다. 이 비디오는 IVIL 메서드의 전반적인 워크플로우를 이해하는 데 도움이 됩니다.그것은 다른 응용 프로그램 및 항체에 대한 프로토콜의 성공적인 재생산을위한 중요한 세부 사항을 보여줍니다. 진행하기 전에 심Pation 또는 캘리퍼 측정을 통해 적절한 종양 성장을 원하는 암 모델에서 마우스를 관찰한다. 토끼 안티 마우스 B7-H3 및 토끼 IgG 등형 제어 항체를 탈염 컬럼에 정화하여 제조업체 지침에 따라 방부제 및 저장 버퍼를 제거합니다.개별 미세 원심 분리기 튜브에서 각 항체 컨쥬게이트의 33 마이크로그램의 Aliquot 투여량. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 마취에 따라 항체 용액의 꼬리 정맥 접종을 준비한다. 알코올 닦아세면 동물의 꼬리를 소독합니다.약 30초 동안 열패드로 따뜻하게 하여 꼬리 정맥을 팽창시다. 전체 동물을 가열하지 마십시오. 27 게이지 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 나비 바늘을 삽입합니다.카테터에 혈액 역류를 시각화하여 바늘이 제대로 배치되어 솔루션이 꼬리에 포획되는 것과 동물을 완전히 입력할 수 있도록 합니다. 수술 용 테이프를 사용하여 삽입 된 바늘로 꼬리를 조심스럽게 수정합니다. 카테터를 멸균 인산염 완충식식염 25마이크로리터로 씻어내면 됩니다.그런 다음, 인슐린 주사기를 사용하여 카테터에 항체 용액을 주입한다. 멸균 PBS의 25 마이크로 리터와 카테터를 다시 한번 플러시. 꼬리에서 바늘을 제거하고, 출혈을 중지 압력을 적용합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스의 인도적인 안락사를 수행하고 마우스를 supine 위치에 놓습니다. 종양 조직을 절제하기 위하여 외과 가위와 집게를 사용하십시오. 집게를 사용하여 꼬리에 가장 가까운 유방 땀샘 세트 사이의 피부 외부 층만 파악하고 수술 가위로 작은 절개를합니다.닫힌 가위를 절단에 넣고 팁을 천천히 열어 피부를 기본 복벽 막과 조심스럽게 분리하여 그대로 유지합니다. 복부를 수직으로 절개하여 피부를 내부 막과 분리하십시오. 세 번째와 네 번째 유방 땀샘 사이에, 피부의 후퇴와 유방 땀샘의 시각화를 허용하기 위해 복부를 가로 질러 수평 컷을합니다.각 종양 이나 일반 동맥을 집게로 잡고 외과 가위를 사용하여 부착 된 피부를 조심스럽게 다듬습니다. 절제된 조직을 미리 표지되고 최적의 절삭 온도가 포함되는 조직 일회용 염기 몰드에 놓습니다. 드라이 아이스에 배치하여 금형을 신속하게 동결합니다.오프 타겟 전달을 연구하기 위해 다른 조직이나 관심 기관을 소비합니다. 저온기를 사용하여 10미크론 두께로 단면 고정 된 조직 블록을 만들고 인접한 섹션을 미리 표지된 접착 유리 슬라이드에 놓습니다. 냉동 티슈 슬라이드를 실온 PBS로 5분간 헹구어 내장 매체를 제거합니다.염색 하는 동안 필요한 솔루션의 볼륨을 줄이기 위해 소수성 장벽 펜조직 섹션을 마마로테. 4%의 파라포름알데히드 용액으로 조직 섹션을 5분간 수정합니다. PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구고, PBS에서 0.5%의 트리톤 X-100을 15분 동안 과미로 분류합니다.5분 동안 PBS에서 슬라이드를 다시 헹구십시오. 볼륨 소 세럼 알부민당 3%의 중량과 실온에서 1시간 동안 부피 염소 세럼당 5%의 부피를 함유한 PBS로 조직을 차단합니다. PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구고, 일반적인 핵, 혈관 또는 세포질 마커와 같은 기록 보관 1차 항체로 섹션을 배양한다.여기서, 쥐 안티 마우스 CD31은 차단 용액에서 일대일 100 희석에 사용된다. 1차 항체가 있는 슬라이드는 밤새 섭씨 4도에 남아 있으며 슬라이드 트레이의 탈수로부터 보호됩니다. 인큐베이션에 따라 PBS에서 슬라이드를 세 번 5분간 헹구십시오.매번 PBS를 변경합니다. 1 차 항체를 표지하기 위해 이차 항체로 슬라이드를 배양합니다. 이 적용을 위해 알렉사 플루오(546)를 이용한 항B7-H3 항체를 시각화하고, 차단용에서 알렉사 플루어 488 염소 항쥐 이차 항체로 CD31을 시각화한다.슬라이드 트레이의 조명과 탈수로부터 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 보호합니다. 이전과 같이 PBS에서 슬라이드를 헹구고, 티슈 슬라이스의 중앙에 장착 매체의 한 방울을 적용합니다. 조심스럽게 기포의 함정을 피하기 위해 커버 슬립을 배치합니다.뚜껑 가장자리를 명확한 매니큐어로 밀봉하고 건조시키십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 공초점 현미경 이미징 및 정량적 이미지 분석을 진행합니다. 대표적인 공초점 현미경 사진은 정상 또는 암종 조직을 포함하는 뮤린 유방 땀샘에서 특정 B7-H3 항체-ICG 컨쥬게이트 및 비특이적 동위원소 대조군 항체-ICG 컨쥬게이트 국소화를 비교하는 것을 보여준다.이소-ICG 또는 B7-H3-ICG로 정맥 주사하고 CD31로 대응하는 동물의 정상적인 명골 모샘은 항체 컨쥬게이트의 염색을 보이지 않는다. 정상 조직은 표준 전 생체 면역 형광 염색에 의해 B7-H3의 발현이 없는 것으로 나타났다. 침습성 유방 종양에서 B7-H3-ICG는 생체 내첫 접촉 지점인 혈관에 강하게 결합한 다음 혈관에서 이질적으로 종양 상피를 염색할 수 있습니다.ISO-ICG는 종양 조직 내의 비특이적 축적을 보여줍니다. 표준 전 생체 내 피세포 에 B7-H3 마커의 균일 한 발현을 나타낸다. 대표적인 공초점 현미경사진은 악성암과 정상 유방땀샘에서 넷린-1 발현 또는 등류형 대조현을 검출하는 생체 내 면역형국화 방법을 보여준다.생체 내 면역플루오에시언국화는 MMTV-PyMT 종양에서 넷린-1에 대한 상피 신호를 확인하지만 정상적인 유방 땀샘에서는 확인되지 않습니다. 더욱이, 유 방 종양의 내피 세포에 강한 넷린-1 신호가 있다, 공동화 된 황색 신호에 의해 표시. 신호는 일반적인 유방 선지에서 상당히 약합니다.IVIL 방법은 항체 투여량, 조직 수집 타이밍 및 이차 항체 희석의 관점에서 최적화되어야 성공적인 구현을 위해 최적화되어야 합니다. IVIL은 조직 처리를 필요로 하는 표준 면역 형광 얼룩을 사용하여 검출될 수 없는 형성 전형의 표적을 허용합니다. 또한 종양 을 낳는 마우스의 건강한 장기는 치료 항체의 오프 타겟 전달을 평가하기 위해 수집 될 수 있습니다.암 연구 및 관리에서 항체 기반 치료제 및 조영제의 사용이 증가함에 따라 IVIL 방법은 제약 연구 및 개발에 매우 적용 가능합니다. 암 치료, 분자 이미징, 염증 및 기타 분야의 연구원은 IVIL 방법이 유용한 정보를 제공한다는 것을 발견 할 수 있습니다.

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